Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Сравнительный хромосомный пэинтинг млекопитающих 11
1.1.1. Сравнительное картирование млекопитающих 11
1.1.2. Хромосомный сортинг 14
1.1.3. Построение предкового кариотипа млекопитающих 16
1.1.4. Неравномерность кариотипическои эволюции млекопитающих 18
1.2. Современные методы анализа состава хромосом 22
1.2.1. Микродиссекция 22
1.2.2. Многоцветная FISH. 24
1.2.3. Многоцвтный хромосомный бар-код и RxFISH 26
1.2.4. Многоцветный бэндинг 27
1.3. В-хромосомы 29
1.3.1. Происхождение В-хромосом 29
1.3.2. Молекулярная эволюция В-хромосом 32
1.3.3. Молекулярный состав В-хромосом 33
1.3.4. Механизмы передачи и накопления В-хромосом 34
1.3.5. Модели, описывающие динамику В-хромосом в популяциях 36
1.3.6. Воздействие В-хромосом на носителя 37
1.3.7. В-хромосомы млекопитающих 39
1.3.7.1. В-хромосомы хищных 42
1.3.7.2. В-хромосомы грызунов 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
2.1. Материалы 47
2.2. Методы 50
2.2.1. Приготовление препаратов хромосом 50
2.2.2. Получение пэйнтинг-проб с помощью отбора на микрочастицах 51
2.2.2.1. Выделение высокомолекулярной ДНК 51
2.2.2.2. Получение тотальной ПЦР-библиотеки генома 51
2.2.2.3. Интер-А1и-ПЦР 52
2.2.2.4. Гетерологическая гибридизация в растворе 52
2.2.2.5. Экстракция гибридных молекул ДНК 52
2.2.3. Получение Cotl ДНК. 53
2.2.3.1. Выделение ДНК из ядер 53
2.2.3.2. Реассоциация ДНК 53
2.2.3.3. Гидролиз однонитчатой ДНК S'-нуклеазой 53
2.2.4. Микродиссекция и DOP-ПЦР 54
2.2.4.1. Приготовление растворов 54
2.2.4.2. Подготовительные процедуры 54
2.2.4.3. Микродиссекция 55
2.2.4.4. DOP-ПЦР -1 (секвеназный вариант) 56
2.2.4.5. DOP-ПЦР -2 (Taq - полимеразный вариант) 57
2.2.5. Флюоресцентная in situ гибридизация 58
2.2.5.1. Мечение зонда 58
2.2.5.2. Предгибридизация и гибридизация 58
2.2.5.3. Отмывки и детекция 59
2.2.5.4. Многоцветная FISH 59
2.2.5.5. Реципрокный пэйнтинг собака /человек / лисица 60
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 61
3.1. Получение и использование пэйнтинг проб на базе источников днк, альтернативных
СОРТИНГУ 61
3.1.1. Разработка метода получения пэйнтинг проб путем экстракции хромосомспецифичных библиотек с помощью парамагнитных частиц 62
3.1.1.1.Получение зонда 62
3.1.1.2. Получение тотальной ПЦР-библиотеки генома 64
3.1.1.3. Гетерологичная гибридизация in vitro и экстракция гибридных молекул 64
3.1.2. Картирование районов, гомологичных хромосоме 3 человека у хищных, парнокопытных зайцеобразных 66
3.1.2.1. Район, гомологичный хромосоме 3 человека, у хищных 66
3.1.2.2. Район, гомологичный хромосоме 3 человека, у парнокопытных 69
3.1.2.3. Район, гомологичный хромосоме 3 человека, у зайцеобразных 72
3.2. Реципрокный пэйнтинг хромосом собаки, человека и лисицы с использованием сортинговых библиотек 75
3.3. Получение раионспецифичных библиотек для многоцветного бэндинга всех хромосом кариотипа человека 78
3.3.1. Создание раионспецифичных библиотек 78
3.3.2. Многоцветный бэндинг 80
3.3.3. Применение метода в клинической диагностике 81
3.4. Исследование в-хромосом енотовидной собаки и восточно-азиатской мыши с помощью микродиссекции и двухцветной FISH 88
3.4.1. В-хромосомы енотовидной собаки 88
3.4.2. В-хромосомы восточно-азиатской мыши 92
ГЛАВА 4. Заключение 102
Выводы 105
список литературы
- Сравнительное картирование млекопитающих
- Получение пэйнтинг-проб с помощью отбора на микрочастицах
- Разработка метода получения пэйнтинг проб путем экстракции хромосомспецифичных библиотек с помощью парамагнитных частиц
- Реципрокный пэйнтинг хромосом собаки, человека и лисицы с использованием сортинговых библиотек
Сравнительное картирование млекопитающих
Основой сравнительного картирования геномов млекопитающих является консерватизм групп сцепления. В отсутствии хромосомных перестроек связи и порядок генов сохраняются. В процессе эволюции хромосомные перестройки неизбежно возникают, разрывая некоторые, но не все предковые сцепленности. Вероятность, что такая сцепленность или синтения будет сохранена, зависит от перестроек, накопленных исследуемыми видами с момента дивергенции. Близкородственные виды обычно накапливают меньше перестроек и, таким образом, имеют более протяженные консервативные сегменты, тогда как далекие виды обычно накапливают много перестроек и имеют короткие консервативные районы. Однако в некоторых филогенетических линиях обнаруживается значительный консерватизм, тогда как в других - значительные хромосомные перестройки. Эта мозаика консервативных и перестроенных сегментов, которые обнаруживаются при сравнении хромосомных локализаций гомологичных генов у разных видов, дает представление об общих закономерностях организации и эволюции геномов.
Хотя накопление данных по генетическому картированию позволило оценивать районы синтении у некоторых (хорошо изученных) млекопитающих, точные границы гомологичных районов все же не были определены. Сравнительные исследования характера GTG-исчерченности не позволяют надежно идентифицировать хромосомные гомологии для представителей отдаленных видов млекопитающих. На новый уровень вывел исследователей метод сравнительного хромосомного пэйнтинга или Zoo-FISH, в котором хромосомспецифичные зонды одного вида животных гибридизуют на хромосомы других видов животных. Полученная информация почти полностью соответствует имеющимся данным по генетическому картированию и позволяет устанавливать филогенетические отношения внутри таксонов. Первыми экспериментами по гетерологичному пэйнтингу были гибридизации хромосомспецифичных проб человека на хромосомы других приматов (Wienberg et al., 1990; Jauch et al., 1992). Была обнаружена высокая степень хромосомной гомологии человека и человекообразных обезьян и значительная перестроенность кариотипа гиббона.
Представительность библиотек при гетерологичном пэйнтинге внутри отрядов может быть не очень высокой из-за небольшой дивергенции видов на уровне ДНК. Поэтому можно использовать зонды, полученные с помощью методов микродиссекции и интер-АІи-ПЦР. Так, используя зонды, полученные с помощью интер-АІи-ПЦР с перестроенных гибридов соматических клеток человек/грызун, были изучены внутрихромосомные перестройки высших приматов (подотр. Anthropoidea) (Mueller et al., 1996), а с помощью микродиссекционной библиотеки с р-плеча хромосомы X коровы были исследованы перестройки половой хромосомы в пределах подотряда жвачных (Rubtsovetal., 1997).
Позже в исследования были вовлечены виды из разных отрядов млекопитающих, и основой для гетерологичной гибридизации служили высокопредставительные хромосомспецифичные библиотеки ДНК, полученные с помощью сортинга хромосом. Представительность сортинговых зондов значительно выше микродиссекционных, поскольку стартовое количество материала составляет несколько сотен копий хромосом. Поскольку самыми доступными были библиотеки сортированных хромосом человека, то первые работы по геномному пэйнтингу производились с их использованием. Таким образом были установлены гомологичные сегменты между хромосомами человека и свиньи (Rettenberger et al., 1995а), коровы (Solinasoldo et al., 1995; Hayes et al., 1995), лошади (Raudsepp et al., 1996), кошки (Rettenberger et al., 1995b; Wienberg et al., 1997), индийского мунтжака (Froenicke, Scherthan, 1997; Yang et al., 1997a), тюленя (Froenicke et al., 1997), американской норки (Hameister et al., 1997), дельфина (Bielec et al., 1998), землеройки (Dixkens et al., 1998), летучей мыши (Volleth et al., 1999), овцы (lannuzzietal., 1999).
Если при гетерологичном пэйнтинге хромосомспецифичный зонд дает несколько сигналов на разных хромосомах исследуемого вида, всегда возникает неясность, какая часть хромосомы, из которой был получен зонд, гомологична определенному сегменту у исследуемого вида. Эта проблема снимается, если проводить пэйнтинг в двух направлениях (ZooFISH всех сортированных хромосом вида А на метафазные хромосомы вида В и сортированных хромосом вида В на метафазные хромосомы вида А). Таким образом были исследованы такие пары видов, как свинья-человек (Goureau et al., 1996), человек-собака (Breen et al., 1999), человек-кошка (Wienberg et al.,1997), человек-лемур (Mueller et al., 1997b) мышь-крыса (Guilly et al.,1999), человек-кролик (Korstanje et al., 1999), китайский хомячок-мышь (Yang et al., 2000a) и другие.
Акроцентрические хромосомы человека (13, 14, 15, 21, 22) вовлечены в формирование ядрышкового организатора и содержат гомологичные последовательности в прицентромерном гетерохроматине. В экспериментах по диагностике хромосом человека с помощью FISH цельнохромосомных библиотек всегда обнаруживались сигналы во всех ядрышкообразующих районах. Замена этих зондов на пробы сортированных хромосом других приматов, не содержащих кластеров рибосомных генов, позволила решить проблему (Mueller et al., 1997а).
В настоящее время наиболее информативным является многонаправленный хромосомный пэйнтинг. Вовлечение новых видов животных в эти эксперименты позволяет исследователям расширить уже имеющуюся информацию, уточняя границы гомологичных районов и устанавливая тонкие перестройки. Данный метод требует наличия сортированных хромосом нескольких видов животных, и подобные работы были сделаны для групп тупайя / лемур / человек (Mueller et al., 1999), человек / китайский мунтжак / индийский мунтжак / серая мазама (Yang et al., 1997b), собака / лисица / человек (Yang et al., 1999), человек / собака / кошка (Yang et al., 2000b).
Получение пэйнтинг-проб с помощью отбора на микрочастицах
Микродиссекция метафазных хромосом является удобным методом получения хромосом- или районспецифичных библиотек. В настоящее время с помощью микродиссекции решаются задачи идентификации сложных хромосомных перестроек, анализа состава маркерных хромосом, получения банков для многоцветной FISH и многоцветного бэндинга, создания библиотек для ZOO-FISH.
Скалендж с соавторами впервые провели микродиссекцию политенных хромосом Drosophila (Scalenghe et al., 1981). Фрагменты ДНК клонировали в фаге лямбда и доказывали их хромосомспецифичность с помощью гибридизации in situ. Позже микродиссекция была применена для клонирования хромосомспецифичных фрагментов ДНК мыши (Roehme et al., 1984; Fisher et al., 1985; Greenfeld, Brown, 1987; Weith et al., 1987) и человека (Bates et al., 1986; Kaiser et al., 1987). Однако эти ранние работы показали, что микродиссекция малоэффективна для насыщения определенных хромосомных районов ДНК-маркерами. Для получения достаточно представительных библиотек нужно было диссектировать не менее 100 фрагментов. Диссекция проводилась на микроскопе с фазовым контрастом при увеличении 600х, что позволяло определять лишь небольшое число морфологически отличимых хромосом. Так, у мышы для определения нужных хромосом были использованы охарактеризованные линии с робертсоновскими транслокациями (Roehme et al., 1984; Fischer et al., 1985; Greenfeld, Brown 1987; Weith et al., 1987), а у человека была диссектирована хромосома 2, которая может быть идентифицирована без дифференциальной окраски (Bates et al., 1986), для идентификации хромосомы 7 человека были использованы гибриды соматических клеток (Kaiser et al., 1987).
Метод микродиссекции хромосом с помощью лазера (Monajembashi et al., 1986) является альтернативой методу диссекции стеклянной иглой, присоединенной к контролируемому микроманипулятору. Однако метод широкого распространения не получил из-за дороговизны лазерных диссекторов и отсутствия явных преимуществ по сравнению с диссекцией иглой.
Сэнгер с соавторами (Senger et al., 1990) использовали инвертированный микроскоп (увеличение 1250х), что позволило точно диссектировать нужные районы (вплоть до 1 бэнда) GTG-окрашенных хромосом. Кроме того, существенно облегчили метод использование вращающегося столика и диссекция в воздушной среде. Фрагменты хромосом подвергали депротеинизации, ДНК обрабатывали рестриктазой и лигировали в плазмиду. Далее производили амплификацию последовательностей с помощью полимеразной цепной реакции с прямым и обратным праймерами М13 и фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 Е. coli (Ludecke et al., 1990). Авторам удалось таким образом уменьшить стартовое число копий хромосомных фрагментов до 20-40.
Мелтцер с соавторами (Meltzer et al., 1992) и Гуан с соавторами (Guan et al., 1992) независимо разработали новый метод быстрого получения районспецифичных библиотек из диссектированных хромосом, используя DOP-ПЦР. При этом отпала необходимость в трудоемком микроклонировании. Авторы предложили термин "MnKpoFISH", с помощью которого можно менее чем за 24 часа определить происхождение любой цитологически видимой хромосомной перестройки.
Позже было предложено много вариаций данного метода путем использования другого праймера и шага циклической депротеинизации (Yokoyama, Sakuragawa, 1995), проведения диссекции в водной среде (Engelen et al., 1998) и других. Способы улучшения были направлены на снижение риска контаминации; уменьшение числа собираемых фрагментов и на особенности предамплификационной обработки диссектированных фрагментов.
Ваймер с соавторами (Weimer et al., 1999) предложили дальнейшее усовершенствование метода, присоединив пипетку с микрокаплей для сбора фрагментов ко второму микроманипулятору. Данное нововведение позволило значительно увеличить скорость сбора фрагментов.
Для повышения представительности библиотек, полученных всего с одной копии хромосом, Кристиан с соавторами (Christian et al., 1999) предложили проводить DOP-ПЦР in situ прямо на препаратах метафазных хромосом перед микродиссекцией. При этом продукты амплификации остаются на хромосомах, увеличивая копийность отдельных последовательностей.
Для осуществления идентификации сложных хромосомных перестроек Ваймер с соавторами (Weimer et al., 2000) предложили метод, который предполагает предварительную многоцветную FISH и микродиссекцию в одном эксперименте. С помощью M-FISH-анализа обнаруживают аберрантные хромосомы, которые в дальнейшем диссектируют и получают хромосомспецифичные библиотеки. С помощью обратного пэйнтига (на неперестроенные хромосомы) картируют точки разрыва и точно характеризуют происхождение аберрантных хромосом.
Метод гибридизации последовательностей нуклеиновых кислот in situ вывел исследователей геномов на новый уровень, позволив локализовать последовательности ДНК на хромосомах, в клетках и тканях без значительного повреждения их структуры. За последние 20 лет in situ гибридизация стала логическим продолжением традиционной цитогенетики, способствуя созданию такого направления, как молекулярная цитогенетика.
Первоначально in situ гибридизация была введена Пардю и Голлом (Pardue, Gall, 1969) и независимо группой Джонса (John et al., 1969). Для мечения зондов исследователи использовали радиоизотопы, а зондами служили последовательности, выделенные классическими методами (сателлитная, рибосомная ДНК). В дальнейшем методы генетической инженерии позволили использовать in situ гибридизацию для локализации любой ДНК- и РНК-последовательности, а сами зонды стали метить нерадиоактивными метками. В настоящее время существует довольно много модификаций неизотопного варианта гибридизации (Hopman et al., 1988). Самым распространенным методом является флюоресцентная in situ гибридизация (FISH), когда детекция зонда производится с помощью флюоресцентных меток.
Разработка метода получения пэйнтинг проб путем экстракции хромосомспецифичных библиотек с помощью парамагнитных частиц
0,1 мкг биотинилированного интер-АІи-ПЦР продукта денатурировали 5 мин при 96С с 50-кратным избытком Cot1 ДНК человека и проводили предгибридизацию в течении 30 мин при 62С в растворе 4xSSC. Тотальную ПЦР-библиотеку исследуемого животного (2,5 мкг продукта) денатурировали 4 мин в кипящей бане, добавляли праймер В (до концентрации 1 мкМ) и смешивали с интер-Алю-ПЦР продуктом. Гетерологичная гибридизация проводилась в
Гибридные молекулы фиксировали на парамагнитных микрочастицах (Dynabeads М280) в течении часа при 62С и затем отмывали 2 раза в 3xSSC при 62С, 5 раз в 0,2xSSC при 42С и 2 раза в 0,2xSSC при 56С. Фиксированные гибриды денатурировали 5 мин в кипящей бане в ТЕ буфере и отбирали супернатант. Фрагменты ДНК нарабатывали с помощью ПЦР с праймером В и проводили еще 2 цикла обогащения (гибридизация с с интер-АІи-ПЦР продуктом/ селекция гибридов/ наработка фрагментов). При получении зонда для FISH введение биотина осуществляли с помощью ПЦР по протоколу, описанному выше, используя соотношение dTTP/bio-dUTP 3:1.
Выделение ДНК из ядер проводили аналогично описанному для выделения высокомолекулярной ДНК. После растворения ДНК производили фрагментацию ультразвуком (УЗДН, 22кГц, 1,5-2мин) до среднего размера 500 п.н. Затем раствор дважды экстрагировали смесью фенол / хлороформ, осаждали ДНК двумя объемами этанола из 0,4 М NaCI, растворяли в ТЕ-буфере и еще раз переосаждали.
ДНК растворяли в ТЕ-буфере, спектрофотометрически определяли концентрацию и проводили реакцию реассоциации до желаемой величины Cot. Значению Cot=1 (Cot1) соответствует реассоциация в течение 1 часа при концентрации ДНК 83 мкг/мл в растворе 1,2xSSC при 60С (Britten et all., 1974). Обычно мы получали Cot2 ДНК в следующих условиях: 0,5 мг/мл, 1,2xSSC, 20 мин., 60С.
По окончании реакции реассоциации раствор быстро охлаждали во льду и добавляли десятикратный буфер (0,5 М NaAc рН 5,5, 0,045 М ZnSC 4) и S1-эндонуклеазу до концентрации 100 ед.акт./мг исходной ДНК. Через 1-1,5 часа инкубации при 42С двунитчатую ДНК осаждали 0,8 объемами изопропанола, центрифугировали, растворяли осадок в ТЕ-буфере и определяли концентрацию ДНК спектрофотометрически. Выход Cot2 ДНК составлял 10-16 % от общего количества ДНК. 2.2.4. Микродиссекция и DOP-ПЦР
Для приготовления 5% раствора ампулу лиофилизованного BactoTrypsin (DIFCO) растворяли в воде Ampuva. Раствор фильтровали и аликвоты по 100 мкл хранили при -20С. Для обработки препаратов метафазных хромосом 100 мкл аликвот растворяли в 35 мл фосфатного буфера (рН 6,88).
Растворы для окраски
Для приготовления окрашивающего раствора к 35 мл 0,025 М фосфатного буфера рН 6,88 (Merk) добавляли 3 мл стерильного фильтрованного раствора Гимза (Merk). При этом концентрированный раствор Гимза предварительно смешивали с небольшим количеством буфера и фильтровали через стерильный фильтр (Minisart, Sartorius) для предотвращения выпадения нерастворимых комплексов. Раствор капли для сбора 30% глицерин, 10 мМ NaCI, 10 мМ трис-НСІ, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 % SDS, 0,1% тритон Х100, 1,44 мг/мл протеиназы К.
Стеклянные иглы для сбора фрагментов хромосом готовили на приборе для вытягивания пипеток (Narishige, Modell РВ-7) из стеклянных палочек (Duranglass) диаметром 2 мм. На первой ступени вытягивали палочку при максимальной температуре, не обрывая, затем, при меньшей температуре обрывали. Обе половины использовали для сбора фрагментов. Важно следить, чтобы тонкая часть иглы не была слишком длинной, иначе иглы будут слишком гибкие. При необходимости можно обламывать иглу о край пипетки для сбора, чтобы получить более подходящее острие. Приготовление пипеток для сбора
Для сбора фрагментов использовали стеклянные пастеровские пипетки (223 мм, Brand). Вытягивание пипеток производили на том же приборе, который использовали для вытягивания игл. При этом использовали одну ступень (средний разогрев, 100 г груз). Конец пипетки аккуратно обламывали.
Пипетки силиконизировали погружением в 1%-й диметилдихлорсилан в четыреххлористом углероде, высушивали и нейтрализовали погружением в Іммраствор ЭДТА (рН 7.5). Инкубировали пипетки 1 час при 60С и 30 минут при 100С.
Приготовление покровных стекол Для распластывания хромосом использовали покровные стекла (60x24 мм). Перед использованием выдерживали стекла несколько дней в 10% растворе SDS. Приготовление препаратов метафазных хромосом Выдержанные в SDS стекла тщательно ополаскивали дистиллированной водой. На мокрые стекла наносили 50 мкл свежего фиксатора и затем несколько капель суспензии фиксированных клеток. Препараты сушили и ополаскивали в фосфатном буфере.
Силиконизированную пастеровскую пипетку осторожно окунали в раствор для сбора, при этом, под действием капиллярных сил, небольшое количество жидкости входило в конец пипетки. В период диссекции и сбора хромосом пипетка находилась во влажной камере. Микродиссекцию проводили на инвертированном микроскопе Axiovert 205 или Axiovert 10 (Zeiss). Для центрирования пипетки и иглы использовали небольшое увеличение (10х объектив Plan-Neofluar). Для диссекции использовали объектив ЮОх Plan-Neofluar и иммерсионное масло. В удобное для диссекции положение хромосомы приводили с помощью вращающегося столика. Иглу приводили в движение с помощью микроманипулятора (Merzhaeuser). Вырезанные фрагменты собирали на иглу и переносили в каплю для сбора в пипетке. После сбора фрагментов пипетку помещали на 2 часа в водяную баню при 60С для проведения протеиназной обработки.
Реципрокный пэйнтинг хромосом собаки, человека и лисицы с использованием сортинговых библиотек
Распределение сигналов на В-хромосомах АреЗ и Аре4 В соответствии с результатами гибридизации все полученные библиотеки были разделены на 2 класса. Библиотеки, полученные из метацентриков разной морфологии, дали похожую картину распределения сигнала (В1 хроматин). Библиотеки, полученные из мелких В-хромосом, также дали сходную картину у каждой особи (В2 хроматин). В1 библиотеки метили 5 В-хромосом (3 метацентрика, 2 акроцентрика) у Аре4 и 5 В-хромосом (4 метацентрика, 1 акроцентрик) у АреЗ. В2 библиотеки маркировали 5-7 точкоподобных добавочных хромосомы у Аре4 (один акроценрик метился как В1 так и В2 пробой) и 2-3 точкоподобных элемента у АреЗ.
Одновременная детекция В1 и В2 хроматина на метафазах всех исследованных особей С помощью двухцветной FISH, где В1-зонд метили биотином, а В2 зонд-дигоксигенином, исследовали одновременную локализацию обоих проб на всех (Аре1-Ареб) особях Apodemus peninsulae. Результаты гибридизации приведены в табл. 5 и на рис. 16.
У Аре1 две акроцентрические В-хромосомы В1 специфичны и две метацентрические В-хромосомы состояли большей частью из В1 хроматина с В2 специфичными терминальными блоками. В некоторых клетках присутствовала точкоподобная В2 специфичная хромосома.
У Аре2 В2 проба метила большую часть трех метацентрических В-хромосом, А В1 проба метила оставшуюся часть этих элементов и еще 5 метацентриков. Наблюдался полиморфизм по наличию одного точкоподобного элемента и по распределению В1/В2 блоков на одном крупном метацентрике.
В1-специфичные В хромосомы оказались DAPI позитивными, тогда как В2-специфичные элементы оказались DAPI негативными. В1-библиотеки дали сильный фон на аутосомах, который был уменьшен в последующих Таблица 5. Результаты гибридизации В1 и В2 проб на В-хромосомы 6 особей Apodemus peninsulae. Особь Сигналы В1 зонда Сигналы В2 зонда Аре1 (4-5 В хр.) 2 метацентрика (большая часть) 2 акроцентрика Теломерные блоки на 2хметацентриках +0-1 точкоподобных элемента Аре2 (8-9 В хр.) 3 плеча метацентриков + 5метацентриков +0-1 точкоподобных элемента 3 плеча метацентриков АреЗ (7-8 В хр.) 4 метацентрика +1 акроцентрик 2-3 точкоподобных элемента Аре4 (9-11 Вхр.) 3 метацентрика +1 акроцентрик +блок на 1 акроцентрике 4-6 точкоподобных элементов+блоки на 1 акроцентрике Аре 5, 6 (2 В хр.) 2 метацентрика 0 экспериментах благодаря использованию Cot2 ДНК Apodemus agrarius (близкий вид без В-хромосом), В2 пробы почти не дали фона на аутосомах. Это свидетельствует о разном содержании повторов в В1 и В2 хроматине. На некоторых аутосомах и половых хромосомах В1 и В2 пробы дали прицентромерные сигналы.
Гибридизация В1 и В2 проб на родственные виды без В-хромосом
Два родственных вида из рода Apodemus были также исследованы с помощью FISH с В1 и В2 зондами. У большой японской полевой мыши {Apodemus speciosus, В-хромосомы отсутствуют) В1-библиотека дала сигналы на половых хромосомах (блок прицентромерного гетерохроматина на X хромосоме и сигнал по всему плечу гетерохроматической Y хромосомы) и на интерстициальных гетерохроматиновых блоках одной аутосомной пары (М5) (рис. 17а). У полевой мыши Apodemus agrarius В1 зонд маркировал гетерохроматиновые блоки половых хромосом (рис. 176).
. Двухцветная FISH В1 (зеленый) и В2 (красный) проб на хромосомы разных особей Apodemus peninsulae: Аре4(а), АреЗ(б) и Ареб(в). а) стрелками отмечены В-хромосомы; б) мелкими стрелками отмечены В-хромосомы, крупной стрелкой отмечена хромосома с чередованием В1 и В2 блоков; в) мелкими стрелками отмечены В-хромосомы, крупными стрелками отмечены блоки на половых хромосомах.
Рисунок 17. Локализация В1 специфичных последовательностей на хромосомах Apodemus speciosus (а) и Apodemus agrarius (б). Крупными стрелками показаны блоки на половых хромосомах, мелкими стрелками показаны блоки на мелком метацентрике. Рибосомные и теломерные повторы
В-хромосомы разных видов часто содержат кластеры рибосомной ДНК. Боескоров с соавторами сообщили об обнаружении активных ЯОР на двух (из трех) метацентрических В-хромосомах восточно-азиатской мыши, отловленной в Уссурийском заповеднике (Boeskorov et al., 1995). Мы исследовали хромосомы особей Аре1-Аре4 с помощью окраски на ядрышковые организаторы и FISH с меченым рибосомным зондом и не обнаружили на исследованных В-хромосомах интерстициальных кластеров. FISH с теломерным зондом выявила только теломерные сигналы на В-хромосомах Apodemus peninsulae.
Исследование особей уссурийских популяций
Из литературных данных известно, что представители уссурийских популяций Apodemus peninsulae обладают относительно небольшим числом В-хромосом (0-5) и что точкоподобные элементы встречаются только в редких случаях (Картавцева, 1999). У двух исследованных нами особей из этого региона (Аре5, Ареб) обе метацентрические В-хромосомы оказались В1-специфичными (рис. 16, в). Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы доказать отсутствие или наличие В2-специфичных В-хромосом в дальневосточных популяциях.
Происхождение и эволюция В-хромосом восточно-азиатской мыши
Брокхаус с соавторами предположили модель, объясняющую возможность возникновения В-хромосомы из нецентрических фрагментов А-хромосом генома (Brockhause et al., 1989). Вновь возникшие хромосомы должны обладать функциональными центромерами, способными прикрепляться к клеточному веретену для сегрегации в митозе и мейозе. При этом последовательности центромер новых элементов не обязательно должны быть гомологичны центромерам А-хромосом. Трехмерная структура хроматина может быть более важным фактором. Даже если первоначальные центромеры будут функционировать неэффективно, то отбор будет способствовать закреплению более совершенных вариантов. Несовершенство структуры центромер может выражаться в митотической и мейотической нестабильности, характерной для большинства добавочных хромосом.
100
Большинство исследованных В-хромосом были либо В1 либо В2 специфичными, поэтому можно предположить, что эти 2 вида В-хромосом возникли независимо. В1 хромосомы, скорее всего, возникли раньше, успели накопить диспергированные повторы и улучшили структуру центромеры, что сделало их более стабильными. Гомология с центромерными последовательностями и наличие общих диспергированных повторов с аутосомами и половыми хромосомами может свидетельствовать о внутривидовом происхождении данных элементов. В2 хромосомы, по-видимому, возникли позже и являются чрезвычайно нестабильными (вероятно, из-за несовершенной структуры центромеры). Факт наличия В-хромосом, содержащих оба типа В-хроматина, а также чередование В1 и В2 блоков и варьирование их размеров между разными хромосомами может свидетельствовать о неравной амплификации соответствующих последовательностей или об интенсивных хромосомных перестройках, которые продолжают иметь место в современных популяциях этого вида. DAPI-негативность В2 элементов можно обьяснить либо высоким GC-содержанием, либо особенностями упаковки В2 хроматина.
Наличие В1-специфичных последовательностей на аутосомах и половых хромосомах Apodemus peninsulae и на половых хромосомах близких видов свидетельствует о родоспецифичности некоторых последовательностей, входящих в состав В1-хроматина. В2 хроматин по-видимому является видоспецифичным для Apodemus peninsulae. Темпы кариотипической эволюции и происхождение В-хромосом Семейства млекопитающих Canidae и Muridae известны тем, что кариотипы их видов претерпели сильные преобразования в ходе эволюции. У таких видов как собака и мышь было обнаружено максимальное среди плацентарных млекопитающих количество консервативных сегментов (при сравнении с человеком). Интересно, что в этих таксонах наблюдается повышенное содержание видов с В-хромосомами. Так среди 705 кариологически исследованных видов мышеподобных (Myomorpha) 33 обладают В-хромосомами (4,7%), а среди 29 исследованных видов собачьих 5 видов обладает добавочными элементами (17,2%). В целом, только около 1,2% видов млекопитающих обладают В-хромосомами. Нам представляется, что это не случайно. Вполне возможно, что именно быстрая кариотипическая эволюция способствовала возникновению добавочных элементов, как остатков реорганизации кариотипа. Или же причины, ответственные за быструю эволюцию кариотипов, делают геномы склонными к поддержанию В-хромосом.
Некоторые сверхчисленные хромосомы человека можно рассматривать как вариант В-хромосом, возникающий с определенной частотой в популяции. Очень часто наличие таких добавочных элементов сопряжено с различными клиническими патологиями. В большинстве случаев обнаруживается гомология таких хромосом с сателлитной ДНК одной из хромосом основного набора, поэтому для характеризации маркерных хромосом удобно использовать 24-цветную FISH с сателлитными ДНК всех хромосом (Nietzel et al., 2001). Однако встречаются случаи, когда происхождение маркерной хромосомы не определяется известными методами. Так, была описана стабильная маркерная хромосома, не содержащая альфоидной ДНК и не гомологичная никакой хромосоме основного набора (Ogilvie et al., 2001). Подобные факты подтверждают возможность развития функциональной центромеры из негеномных (или малокопийных геномных) последовательностей.
Периодическое возникновение В-хромосом в различных таксонах живых организмов, может являться одним из вариантов эволюции кариотипа, обеспечивающим разнообразие на популяционном уровне и способствующим видообразованию.
