Введение к работе
Актуальность проблемы
Секвенирование ряда геномов в последнее десятилетие позволило установить последовательности огромного числа генов, однако не решило всех вопросов, связанных с их функциями и регуляцией экспрессии. Исследование протеома – совокупности белков клетки, составляющих транслируемую часть генома, открывает новые возможности для идентификации генов, связанных с определенными функциональными состояниями отдельной клетки и организма в целом. Изучение белков - продуктов генов - с использованием современных методов анализа позволяет получить важную информацию о тонкой структуре генов и дополняет геномные исследования. Протеомный анализ растений уже сейчас с успехом используется для решения разнообразных генетических задач, таких как экспрессия генов в различных органах растения и на различных стадиях развития, при симбиозе, в ответ на биотический и абиотический стресс или иные воздействия), сравнение генотипов (характеристика мутантов, дифференциация линий, установление филогенетических взаимоотношений), изучение структуры генетической изменчивости в природных популяциях (Алтухов, 1989).
Запасные белки пшеницы, представленные мономерными глиадинами и полимерными глютенинами, контролируются несколькими локусами, состоящими из тесно сцепленных между собой генов. (Созинов, 1985). Наиболее полиморфными являются глиадинкодирующие локусы. И хотя генетический контроль глиадинов изучен, различия в структуре кодируемых ими белков в большинстве случаев неизвестны. Исследования первичной структуры глиадинов позволят понять структуру и эволюцию генов глиадинов, а также глиадинкодирующих кластеров в целом.
Сравнительный анализ глиадинов полиплоидной пшеницы и предполагаемых диплоидных доноров геномов предлагает подходы к решению проблемы филогении пшениц. Известно, что геном гексаплоидного вида T. aestivum состоит из трех геномов предковых диплоидных видов – доноров геномов АА, ВВ и DD. Вопрос о происхождении геномов, особенно генома В, до сих пор окончательно не решен (Feldman et al., 2001; Гончаров, 2007). В связи с этим исследования глиадинов диплоидных видов являются чрезвычайно актуальными, поскольку могут пролить свет на этот вопрос.
Интерес к изучению проламинов пшеницы связан также с уникальными физико-химическими свойствами этих белков, обусловливающими вязкоэластичные свойства клейковины. Несмотря на то, что проламины пшеницы интенсивно изучаются в последние десятилетия, структура клейковинного комплекса до сих пор не установлена (Shewry, 2009; Shewry and Halford, 2002). В этой связи особое значение имеет дисульфидное картирование проламинов, так как дисульфидным связям принадлежит решающая роль в формировании структуры клейковины (Wieser, 2007). Помимо фундаментального значения для выяснения организации и функционирования надмолекулярных белковых комплексов, структурно-функциональные исследования проламинов пшеницы важны для целенаправленной селекции на создание высокоурожайных сортов, обладающих улучшенными технологическими качествами (Salekdeh and Komatsu, 2007; Shewry et al., 2008).
Наряду со структурными исследованиями запасных белков, не меньшую роль играют и исследования их генетически детерминированного полиморфизма, который широко используется в филогенетических и популяционных исследованиях, а также в селекции для идентификации сортов, проверки их чистоты, выявления гибридов и др. (Созинов, 1985). Однако для ряда культур, в частности, для представителей семейства тыквенных, полиморфные белковые системы слабо изучены. Выявление таких систем является чрезвычайно актуальным, поскольку позволит использовать их в селекционной практике.
Другой важнейшей группой генов растений являются гены защитных белков, которые определяют устойчивость растений к патогенам и абиотическому стрессу. Изучение защитных белков – продуктов этих генов - имеет фундаментальное значение для выяснения молекулярных механизмов врожденного иммунитета растений. Кроме того, такие исследования имеют и большое практическое значение для поиска кандидатных генов, способных усилить защитный потенциал растений, которые могут быть использованы при трансформации растений для повышения их устойчивости к патогенам и абиотическому стрессу. Усиление устойчивости растений может быть достигнуто как путем повышения уровня экспрессии собственных генов, участвующих в защитных реакциях, так и путем встраивания генов, кодирующих белки и пептиды с антимикробными свойствами, из других видов растений. Все это требует детального анализа защитного арсенала растений, который слабо изучен. В растениях идентифицированы гены устойчивости (R гены), обеспечивающие защиту от определенных рас патогенов (Keller et al., 2000). Однако молекулярные процессы, инициируемые продуктами R генов, в большинстве случаев детально не исследованы. Роль важнейших компонентов защитной системы растений - PR-белков, также изучена недостаточно. Обнаружение в 90х годах в растениях антимикробных пептидов, обладающих широким спектром антимикробного действия, открыло новые возможности для создания устойчивых форм растений, поскольку гены антимикробных пептидов могут быть непосредственно встроены в геномы чувствительных к патогенам растений с использованием методов генетической трансформации (Carlini, Grossi-de-Sa, 2002). Кроме того, антимикробные пептиды растений рассматриваются в качестве альтернативы традиционно используемым антибиотикам и антимикотикам, что особенно актуально в эпоху появления большого количества устойчивых форм патогенов (De Lucca, 2000; Hancock, 2000; Marshall and Arenas, 2003). В связи с этим поиск новых высокоактивных пептидов и разработка методов их получения, в частности путем гетерологичной экспрессии, представляются чрезвычайно актуальными.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы состояла в структурно-функциональном исследовании двух важнейших групп белков растений – запасных и защитных, для решения фундаментальных проблем генетики (эволюция генов проламинов, структура глиадин-кодирующих кластеров генов, филогения пшениц, генетический контроль субъединиц кукурбитина, механизм действия генов устойчивости, исследование индуцированной устойчивости трансгенных растений, экспрессирующих двунитевую РНК), селекции (контроль сортовой чистоты, выявление гибридов и др.) и биохимии (структура и свойства запасных и защитных белков).
В связи с поставленной целью решались следующие конкретные задачи:
1. разработка методологии выделения высокоочищенных проламинов пшеницы, пригодных для структурных исследований;
2. изучение структурных особенностей глиадинов различных глиадинкодирующих локусов гексаплоидной пшеницы, а также видов рода Aegilops – предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц;
3. изучение локализации дисульфидных связей в белках суперсемейства проламинов (глиадинов и 2S альбуминов);
4. разработка методологии выделения, разделения и структурного анализа субъединиц и полимерных глютенинов;
5. исследование полиморфизма запасных белков у представителей семейства Cucurbitaceae: разработка методов идентификации сортов и изучение генетического контроля субъединиц кукурбитина
6. изучение PR-белков и структурно-функциональных изменений хлоропластов у растений родов Nicotiana и Lycopersicon с разными генами устойчивости при вирусной инфекции и перекрестной защите;
7. изучение вирусоустойчивости и белков при инфекции ВТМ у трансгенных растений табака, несущих конструкцию, детерминирующую синтез двуцепочечной РНК.
8. разработка методологии выделения антимикробных пептидов из семян однодольных растений на примере семейства злаковых. Изучение их разнообразия, структуры и свойств, установление структуры предшественника и регуляции экспрессии гена нового гевеиноподобного пептида пшеницы;
9. разработка системы гетерологичной экспрессии генов новых антимикробных пептидов растений.
Научная новизна
Впервые разработана методология разделения и очистки различных запасных и защитных растительных белков: мономерных и полимерных проламинов (сем. Poaceae), 2S альбуминов (сем. Asteraceae) и глобулинов (сем. Cucurbitaceae), PR-белков (сем. Solanaceae) и антимикробных пептидов (сем. Poaceae). Впервые изучены структурные особенности глиадинов гексаплоидной пшеницы Triticum aestivum, кодируемых одним кластером генов (1D1 и 1B1), а также кластерами гомеологичных хромосом (D и B). Впервые установлено, что компоненты одного кластера генов значительно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. Выявлено существование трех типов N-концевых аминокислотных последовательностей у -глиадинов. Показано, что N-концевые аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых геномом D, заметно дивергировали от аналогичных последовательностей генома В. Высказано предположение о том, что гены - и - глиадинов произошли в результате многократных дупликаций коротких нуклеотидных последовательностей ДНК. Выявлен значительный консерватизм аминокислотных последовательностей -глиадинов, кодируемых хромосомами А, В и D геномов. Впервые проведено исследование глиадинов двух видов эгилопсов Ae. tauschii и Ae. longissima – предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц и выявлена высокая внутривидовая изменчивость этих видов. Впервые определены N-концевые аминокислотные последовательности основных компонентов глиадинов Ae. tauschii и показано, что, как и у гексаплоидных пшениц, у эгилопсов встречаются те же типы N-концевых аминокислотных последовательностей глиадинов. Выдвинута гипотеза о том, что геном В культурных пшениц является сложным геномом, который модифицировался в ходе эволюции за счет интрогрессивной гибридизации с различными диплоидными видами, а также что генетический состав ныне существующих диплоидных видов не идентичен составу тех видов, которые участвовали в создании тетра- и гексаплоидных пшениц. Впервые для двух представителей суперсемейства проламинов - глиадина -46 и 2S альбумина подсолнечника, проведено дисульфидное картирование. Впервые выделены и охарактеризованы ряд субъединиц глютенина. Получены новые данные в пользу участия D субъединиц глютенина в терминации роста полимерной цепи глютенинов. Впервые методом светорассеяния установлены молекулярные массы полимеров глютенина. Разработаны электрофоретический и хроматографический методы анализа полиморфизма запасных белков тыквенных культур. Впервые изучен генетический контроль субъединиц кукурбитина – основного глобулина семян тыквенных растений. Впервые исследованы PR-белки растений томатов с разными генами устойчивости (Tm-1, Tm-2 и Tm-22) к ВТМ инфекции и выявлены специфические белки, характерные для каждого генотипа, которые могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе. Исследованы белки хлоропластов листьев томатов с разными генами устойчивости к ВТМ при вирусной инфекции и выявлено снижение активности фотосистемы II и транскрипционной активности пластид. Выявлено наличие интерфероноподобных белков в листьях томатов различного генотипа. Впервые показано влияние экспрессии вставки, детерминирующей синтез двунитевой РНК, не имеющей гомологии с геномами вируса и растений табака, на уровень устойчивости трансгенных растений к тобамовирусам. В инфицированных трансгенных растениях выявлен индуцируемый синтез двух новых полипептидов, относящихся к семейству -эндоглюканаз растений. Высказано предположение об участии этих белков в системе антивирусной защиты растений. Впервые проведен систематический анализ антимикробных пептидов семян вида Triticum kiharae. Выделено 24 новых пептида, относящихся к 6 семействам антимикробных пептидов растений, и установлена первичная структура 12 из них. Изучена биологическая активность в системе in vitro 6 новых антимикробных пептидов. Обнаружено новое семейство глицин-богатых пептидов растений и новый структурный тип гевеиноподобных пептидов. Определена структура предшественника нового гевеиноподобного пептида. Исследована регуляция экспрессии гена этого пептида биотическими и абиотическими факторами среды. Разработана система гетерологичной экспрессии в прокариотической системе нового гевеиноподобного пептида Triticum kiharae. Впервые изучены дефензины предполагаемых доноров геномов полиплоидных пшениц и установлена геномная локализация генов дефензинов у гексаплоидной пшеницы. Показано, что в отличие от пшеницы, в семенах другого вида растений - Taraxacum officinale - основными детерминантами антифунгальной активности являются не антимикробные пептиды, а запасные 2S альбумины. Выдвинута гипотеза о специфичности «защитного арсенала» у разных видов растений.
Практическая ценность работы
Разработанные в ходе выполнения работы методы выделения -глиадинов путем иммобилизации на тиопропил-сефарозе и разделения полимеров глютенина в агарозном геле могут быть использованы при массовом анализе образцов, что имеет большое значение в таксономических и селекционных исследованиях, а также в исследованиях молекулярно-весового распределения полимеров глютенинов в зависимости от технологических характеристик клейковины и более детального исследования структуры полимеров глютенинов. Электрофорез полимеров глютенинов может найти и более широкое применение для исследования полимеров белков сходного размера.
Полиморфизм альбуминов и глобулинов семян тыквенных культур, выявляемый с помощью электрофоретических и хроматографических систем, разработанных в ходе проведенных исследований, может быть использован в селекции, поскольку позволяет идентифицировать генетически отдаленные образцы огурца и районированные сорта тыкв. Созданный каталог аллельных вариантов субъединиц кукурбитина позволяет идентифицировать сорта тыкв отечественной селекции и является экспресс-методом определения сортовой чистоты семян тыкв в сравнении с традиционно используемым грунтконтролем.
Специфические белки, синтезирующиеся в растениях томатов с разными генами устойчивости к ВТМ (Tm-1, Tm-2 и Tm-22) в ответ на инфицирование, могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе. Гены выделенных в ходе выполнения настоящей работы антимикробных пептидов могут быть использованы для трансформации растений с целью повышения их устойчивости к фитопатогенным бактериям и грибам с использованием методов генетической инженерии. Сами пептиды могут найти применение в качестве безопасных консервантов пищевых продуктов в пищевой промышленности, поскольку они являются природными компонентами семян пшеницы. Серьезной проблемой практического применения растительных АМП является высокая стоимость производства. Получение растительных АМП с помощью методов генетической инженерии является перспективным путем решения этой проблемы. Предложенную нами систему гетерологичной экспрессии генов цистеинбогатых АМП в клетках прокариот предполагается использовать для разработки технологии производства АМП.
Основные положения, выносимые на защиту
1. глиадины, кодируемые генами одного кластера, локализованного на коротких плечах хромосом первой гомеологичной группы: хромосомы 1D (блок 1D1) и хромосомы 1В (блок 1В1), существенно различаются по N-концевым аминокислотным последовательностям. Это означает, что в процессе эволюции у предков пшеницы произошло объединение в один кластер генов, кодирующих - и -глиадины. N-концевые аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых геномом D, значительно дивергировали от последовательностей -глиадинов генома В. В то же время аминокислотные последовательности -глиадинов, кодируемых хромосомами А, В и D, существенно более консервативны. Хромосомы шестой гомеологичной группы, по всей видимости, кодируют проламины, значительно отличающиеся от проламинов хромосом первой гомеологичной группы.
2. расположение дисульфидных связей – важнейших пост-трансляционных модификаций белков- в двух группах запасных белков суперсемейства проламинов, глиадинах и 2S альбуминах, сходно, но отличается от такового у других членов суперсемейства - ингибиторов -амилаз и трипсина злаков. Эти различия, по всей вероятности, связаны с необходимостью взаимодействия между ингибиторами и активными центрами ферментов-мишеней;
3. полиморфизм субъединиц кукурбитина, основного запасного глобулина семян тыквенных культур, контролируемого четырьмя локусами, выявляемый с помощью электрофореза, может эффективно использоваться в качестве экспресс-метода определения сортовой чистоты представителей семейства Cucurbitaceae;
4. у растений табака и томатов, содержащих различные гены устойчивости к ВТМ (гены N и N табака и гены Tm-1, Tm-2 и Tm-22 томата), в ответ на вирусную инфекцию синтезируются специфические PR-белки, относящиеся к защитной системе растений и отражающие особенности действия генов устойчивости, которые могут быть использованы в качестве маркеров соответствующих генов в селекционном процессе;
5. высокий молекулярный полиморфизм защитных пептидов у вида пшеницы Triticum kiharae Dorof. et Migusch, реализуемый как на генном, так и на пост-транскрипционном уровнях, обеспечивает эффективную защиту от разнообразных патогенов и стрессовых факторов среды, что обусловливает адаптацию пшеницы к неблагоприятным условиям окружающей среды и объясняет ее широкое распространение по всем континентам и климатическим зонам Земного шара. Детерминанты антифунгальной активности дефензинов семейства Poaceae локализованы в С-концевой области их молекул;
6. набор защитных полипептидов, участвующих в борьбе растений с патогенами и абиотическим стрессом («защитный арсенал» растений), видоспецифичен и уникален для каждого вида растений.
Апробация работы
Основные материалы диссертации были представлены на I национальной конференции по иммуногенетике растений (София, Болгария, 1986), III международном совещании по белкам клейковины (Будапешт, Венгрия, 1987), III международном симпозиуме по биохимической идентификации сортов (Ленинград, 1987), VI Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1987), Всероссийской конференции “Физиолого-биохимические основы иммунитета” (Уфа, 1988), II съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997), международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997), международном симпозиуме по взаимодействиям белковых комплексов (Берлин, Германия, 1997), VII международной конференции по белкам клейковины (Бристоль, Великобритания, 2000), II международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2004), III сьезде общества биотехнологов России (Москва, 2005), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), международном симпозиуме "Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете" (Казань, 2006), II Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), III международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2007), международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, Россия, 2007), международной конференции. «Научное наследие Н.И. Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), 2-й Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (С.-Петербург, 2007), Отчетных сессиях по программе Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (подпрограмма II «Динамика генофондов») (Москва, 2005, 2006, 2007, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008), II Всероссийской конференции «Современные проблемы иммунитета растений к вредным организмам» (С.-Петербург, 2008), IV Российского симпозиума «Белки и пептиды» (Казань, 2009), V съезде ВОГИС (Москва, 2009), V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), международном симпозиуме по взаимоотношениям растений с патогенами (Квебек, Канада, 2009).
Декларация личного участия автора
В диссертационной работе использованы экспериментальные материалы, полученные лично автором. Автор лично принимал участие в разработке методологии, а также в разделении и структурном анализе всех представленных в диссертации групп белков: проламинов пшеницы, альбуминов и глобулинов тыквенных культур, PR-белков и антимикробных белков и пептидов. Автор лично проводил биохимический анализ хлоропластов при вирусной инфекции и анализ трансгенных растений, экспрессирующих двунитевую РНК. Автор принимал активное участие в разработке системы гетерологичной экспрессии антимикробных пептидов и клонировании гена одного из них. Автор лично оформлял результаты своих исследований в виде статей. Суммарное личное участие автора составило ~85%.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 49 статей, глава в зарубежной монографии, один патент и два авторских свидетельства.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 454 страницах, содержит 74 рисунка и 41 таблиц, имеет традиционную структуру и состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 813 источников, и приложения.
