Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Классификация родов Triticum L. я Aegilops L 17
1.2. Эволюция рода Triticum 22
1.2.1 .Диплоидные предшественники полиплоидных пшениц 23
1.2.2. Дивергенция геномов тетраплоидных пшениц 25
1.2.3, Этапы эволюции видов Triticum и Aegilops 29
1.3. Методы анализа генома растений 31
1.3.1. Цитологические методы анализа 31
1.3.1 Л. Изучение кариотипа злаковых культур 31
1.3.1.2, Изучение уровня гомологии хромосом у видов Triticeae 35
1.3.2. Биохимические методы анализа 36
1.3.3. Молекулярно-генетический анализ 39
1.3.3.1. Маркеры индивидуальных локусов 41
1.3.3.2. Маркеры множественных локусов 47
1.3.3.3. Основные критерии отбора молекулярных маркеров для генетических исследований 50
1.3.3.4. Построение молекулярно-генетических карт 51
1.4. Организация генома растений 55
1.4.1. Основные классы повторяющихся последовательностей генома растений 56
1.4.1.1. Дисперсные повторяющие последовательности 57
1.4.1.2. Тандемные повторяющиеся последовательности 59
1.4.1.2.1. Макросателлиты или сателлиты 60
1.4.1.2.2. Гены рибосомальных РНК
как семейство тандемных повторов 74
1.4.1.2.3. Микросателлиты 78
1.4.2. Сравнительное картирование ядерных геномов семейства Роасеае 88
1.5. Заключение 94
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Растительный материал 97
2.1.1. Диплоидные и аллополиплоидые формы Aegilops и Triticum 97
2.1.2. Ячменно-пшеничные гибриды 99
2.1.3. Андрогенные регенеранты и их потомство 100
2.1.4. Сферококкоидные мутантные линии мягкой пшеницы 100
2.1.5. Растения беккроссных поколений от скрещивания линий
мягкой пшеницы 101
2.1.6. Популяции F2 от скрещивания образцов пшеницы группы Timopheevi 101
2.2. ДНК-маркеры 102
2.2.1. Рекомбинантые плазмиды 102
2.2.2. ПЦР-маркеры 102
2.3. Выделение ДНК 105
2.3.1. Выделение ДНК растений с использованием протеиназы "К"... 105
2.3.2. Экспресс-метод выделения ДНК растений 106
2.3.3. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса 107
2.4. Клонирование последовательностей Speltl и Spelt52 107
2.5. Методы гибридизации 108
2.5.1. Гибридизация по Саузерну 108
2.5.2. Дот-гибридизация 110
2.5.3. Гибридизация бактериальных колоний на фильтрах 111
2.5.4. 'Squash'-дот-гибридизация 111
2.5.5. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) 112
2.6. Методы ПНР 113
2.6.1. RAPD-анализ 113
2.6.2. Микросателлитный анализ 114
Глава 3. Результаты
3.1. Общая характеристика макросателлитов Ае. speltoides 115
3.1.1. Speltl - новое семейство субтеломерных тандемных повторов Ае. speltoides 115
3.1.1.1. Клонирование, анализ первичной структуры, геномная организация последовательностей Speltl 115
3.1.1.2. Распространенность повторов Speltl в геномах
диплоидных видов Triticeae 117
3.1.1.3. Анализ структурной организации последовательностей
Speltl в геномах видов Aegilops 123
3.1.2. Spelt52 - семейство субтеломерных тандемных повторов
Ае. speltoides, Ае. longissima, Ае. sharonensis 127
3.1.2.1, Использование ПЦР-подхода для анализа Spelt52-последовательностей и прилегающих к ним участков ДНК 127
3.1.2.2, Организация Spelt52.1 и Spelt52.2 в геноме различных видов Aegilops 133
3.1.3. Локализация Speltl и Spelt52 на хромосомах Ае. speltoides, Ае. longissima, Ае. sharonensis 136
3.1.3.1. /и situ гибридизация Speltl и Spelt52 на хромосомы Ае. speltoides 137
3.1.3.2. In situ гибридизация Spelt52 на хромосомы Ае. longissima жАе. sharonensis 140
3.1.4. Организация последовательностей Speltl и Spelt52 в геномах полиплоидных пшениц 142
3.1.4.1. Организация повторов Speltl у полиплоидных видов рода Triticum 143
3.1,4.2, Реорганизация субтеломерных тандемнвіх повторов на
ранних этапах образования аллополиплоидов Triticum-Aegilops 148 3.1.5. Генетические расстояния между образцами видов Aegilops и
ТгШсит по данным RAPD-анализа 154
3.2. Характеристика микросателлитных (SSR) локусов пшеницы 159
3.2.1. Анализ межвидового и внутривидового полиморфизма SSR
локусов у Т. aestivumn Т. timopheevii 159
3.2.1.1. Полиморфизм длинві SSR-локусов у сортов мягкой пшеницы 159
3.2.1.2. Сравнительный анализ SSR-локусов различных образцов Т. timopheevii 161
3.2.2. Стабильность микросателлитных локусов при отдаленной гибридизации злаков и при культивировании in vitro 165
3.2.2.1. Анализ длины микросателлитных локусов у межродовых гибридов и их потомков 166
3.2.2.2. Анализ длины микросателлитных локусов у андрогенных растений-реген ер антов 170
3.2.3. Использование SSR в качестве ДНК-маркеров 172
3.2.3.1. Картирование генов индуцированных сферококкоидных мутантов Т. aestivitm 173
3.2.3.2. SSR-анализ беккроссных потомков 176
3.2.3.3. SSR-картирование генома Т. timopheevii 180
Глава 4. Обсуждение
4.1. Организация и эволюция семейств повторов Speltl и Spelt52 194
4.1.1. Сравнение Speltl и Spelt52 и других семейств повторов Triticeae 194
4.1.2. Динамика изменений семейств повторов Speltl и Spelt52 в процессе дивергенции видов и при образовании аллополиплоидов.. 197
4.1.2.1 Реконструкция филогении видов Aegilops секции Sitopsis 197
4.1.2.2. Геномная организация Speltl и Spelt52 у диплоидных видов 198
4.1.2.3. Организация Speltl и Spelt52 у аллополиплоидов рода Triticum 202
4.1.2.4. Геномные изменения у экспериментально полученных аллополиплоидов 206
4.1.2.5. Тандемные повторы в эволюции диплоидных и аллополиплоидных видов Triticum и Aegilops 210
4.2. Эволюция микросателлитных локусов рода ТгШсит 212
4.2.1. Дивергенция микросателлитных локусов в процессе эволюции трибы Triticeae 213
4.2.2. Варьирование длины микросателлитов под воздействием стрессовых факторов и в процессе эволюции 216
4.3. Хромосомные перестройки в процессе эволюции рода Triticum 219
4.3.1. Коллинеарность хромосом геномов А и А1, В и G 221
4.3.2, Эволюционное происхождение структурных перестроек хромосом 4Al, 5А1, 6Af 225
4.4. Использование микросателлитов как маркеров для решения ряда задач генетики и селекции 228
4.4.1. SSR-маркирование генетических локусов 228
4.4.2. Использование SSR маркеров для контролирования процессов скрещивания 230
4.4.3. Молекулярно-генетическая паспортизация сортов мягкой пшеницы на основе SSR-анализа 232
Заключение 235
Выводы 238
Список литературы
- Классификация родов Triticum L. я Aegilops L
- Диплоидные и аллополиплоидые формы Aegilops и Triticum
- Speltl - новое семейство субтеломерных тандемных повторов Ае. speltoides
- Организация и эволюция семейств повторов Speltl и Spelt52
Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к изучению генома культурных злаков в первую очередь связан с тем, что данные виды являются важнейшими сельскохозяйственными культурами. Как генетический объект пшеница (род Triticum) занимает особое положение среди злаков, и это обусловлено как различным уровнем гаюидности пшениц, так и их широкой адаптацией в различных эколого-географических регионах мира. Многочисленные исследования по происхождению полиплоидных пшениц обеспечивают возможность сравнительного анализа геномов полиплоидных видов пшениц и их предполагаемых доноров, позволяют моделировать процессы эволюции.
Род Triticum включает в себя диплоидные, тетраплоидные и гексаплоидные виды с базовым числом хромосом кратным 7 (х = 7). Хлебная (мягкая) пшеница Triticum aestivum L. (In = 42) является естественным аллополиплоидом с геномной формулой BBAADD (Feldman, 2001), в образовании которого принимали участие диплоидные виды Triticum и Aegilops. Triticum urartu Thum. является донором генома А, геном D ведет свое происхождение от Aegilops tauschii Coss., а наиболее вероятным донором генома В из пяти видов Aegilops секции Sitopsis является Ае. speltoides Tausch. Сире (Sears, 1954, 1966) показал, что хромосомы трех геномов мягкой пшеницы можно разбить на семь гомеологических групп, внутри которых одна хромосома в экстра- (тетра-) дозе компенсирует нарушения, обусловленные отсутствием другой. Способность гомеологичных хромосом служить буфером при потере хромосом или их фрагментов привело к созданию коллекций анеуплоидных и делециоиных линий, что способствовало интенсивному развитию генетических и молекулярных работ по анализу генома пшеницы.
Первый этап таких работ был связан с использованием серии анеуплоидных линий, мягкой пшеницы, которые позволили охарактеризовать
9 хромосомы по их принадлежности к определенному геному (А, В или D) и к гомеологическои группе. Это использовалось в дальнейших работах для изучения генетического вклада каждой хромосомы в наследование различных признаков пшеницы, для локализации и распределения маркеров и генов по группам сцепления, для анализа взаимодействия отдельных генов при формировании признаков (Майстренко и др., 1971; Plaschke et al., 1996).
Разработка новых коллекций, основанных на стабильности генома полиплоидных форм при потере отдельных участков хромосом, связана с созданием серии делеционных линий. Коллекции перекрывающихся делеционных линий по каждому хромосомному плечу были тщательно охарактеризованы цитологическими методами (Germplasm/Deletions/). Создание такого генетического материала явилось необходимым инструментом для анализа генома растений. Во-первых, это позволило сопоставлять генетические и физические карты хромосом; во-вторых, стало основой для масштабной интеграции в хромосомные карты экспрессирующихся последовательностей ДНК. В качестве примера можно привести опубликованные в 2004 г. результаты по картированию 16099 EST (expressed sequence tag) локусов (Lazo et al., 2004). Эти работы являются стартовой точкой для развития исследований по структурно-функциональной геномике пшеницы, которые включают в себя сравнительный анализ структуры и эволюции хромосом злаков, изоляцию генов и позиционное секвестрование такого крупного генома, как геном пшеницы,
Интенсивное изучение генома пшениц проводилось также с использованием анализа меиотическои конъюгации хромосом межвидовых гибридов, кариотипированием хромосом методами дифференциальной окраски и гибридизации in situ. Определенный вклад в развитие современных представлений о структуре генома пшеницы и ее сородичей внесли работы по сравнительному генетическому картированию хромосом. С использованием молекулярных маркеров данные работы стали развиваться,
10 начиная с 1990 гг.. По последним данным на хромосомные карты пшеницы нанесено более 11500 генов/маркеров (). В то же время хромосомы ряда видов ТгШсит, имеющих важное значение как для изучения эволюции аллополиплоидных пшениц, так для их использования в качестве доноров хозяйственно ценных признаков, еще не картированы. Так, не построены молекулярно-генетические карты хромосом видов группы Timopheevi (Т. timopheevii Zhuk., Т. militinae Zhuk. et. Migusch., Т. araraticum Jakubz., геномный состав GGAlAl), представляющих одну их двух эволюционных линий рода Triticum.
Геном гексаплоидной пшеницы содержит около 17,3 х 109 пн ДНК, из которых 80% приходится на повторяющиеся последовательности (Smith, Flavell, 1975; Bennett, Leitch, 1995). Это объясняет тот факт, что большая часть семейств повторов видов Triticum и видов Aegilops, еще не изучена. Отдельные копии повторяющихся последовательностей могут иметь дисперсную локализацию в геноме, а могут тандемно повторяться, образуя протяженные области повторяющейся ДНК. К тандемным повторам относятся как микросателлиты (simple sequence repeats - SSR, длина мономера не превышает 6 пн), так и макросателлиты (или сателлитная ДНК, наиболее распространенная длина мономера в геноме злаков - от 150 до 400 пн), Особенностью повторяющейся некодирующей фракции ДНК является ее более высокая скорость эволюционной изменчивости по сравнению с кодирующими последовательностями ДНК. Дивергенция геномов злаков сопровождается реорганизацией во фракции тандемных повторов, связанной с делециями и амплификациями различных семейств повторов, дивергенцией первичной структуры мономера и последующей его реамплификацией (Flavell et al, 1980). Варьирование числа мономеров в кластере тандемных повторов и высокий уровень дивергенции первичной структуры последовательностей ДНК лежит в основе использования тандемных повторов в качестве высокополиморфных генетических маркеров.
У трибы Triticeae, в состав которой входят виды рода ТгШсит и Aegilops, наиболее изучена повторяющаяся ДНК рода Secale (рожь). Кроме того, детально охарактеризованы тандемные повторы, локализующиеся преимущественно в субтеломерных и интеркалярных районах Ае. tauschu и D генома Т. aestivum (Bebrook et al., 1980; Rayburn, Gill, 1986; Vershmin et al., 1994, 1995), Структура и эволюция тандемных повторов других геномов аллополиплоидных пшениц и их диплоидных предшественников изучены недостаточно.
Полиплоидные серии видов ТгШсит, а также диплоидные виды ТгШсит и Aegilops, участвовавшие в их образовании, являются удобной моделью для анализа реорганизации структуры генома в процессе эволюции. Использование различных молекулярно-генетических и цитологических подходов позволило детально охарактеризовать хромосомные перестройки, произошедшие в процессе эволюции пшениц группы Emmer (тетраплоидов -Т. dicoccoides Коегп., Т. dicoccum Schrank, Т. durum Desf. ~ с геномной формулой ВВАА и гексаплоидной пшеницы Т, aestivum). Настоящая работа направлена на изучение структуры и эволюции геномов пшениц группы Timopheevi (Т. timopheevii и Т. militinae, геномная формула GGA^) и видов Aegilops секции Sitopsis, предшественников В и G геномов полиплоидных пшениц. Данное исследование будет способствовать более глубокому пониманию процессов геномной дивергенции, связанных с видообразованием диплоидных и аллополиплоидных форм злаков.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение
структуры и реорганизации геномов диплоидных видов Aegilops секции
Sitopsis и аллополиплоидных пшениц в процессе эволюции с использованием
макро- и микросателлитов. В работе были поставлены следующие задачи:
1. Характеристика макросателлитных последовательностей ДНК
Ае. speltoides. Изучение особенностей распределения выделенных
повторов Speltl и Spelt52 в кариотипах видов Aegilops секции Sitopsis.
12 Анализ популяционного полиморфизма последовательностей Spelt 1 и Spelt52 у диплоидных видов Aegilops и Triticum.
Изучение динамики эволюционных преобразований семейств повторов Spelt 1 и Spelt52, локализованных в субтеломерных районах хромосом, в процессе дивергенции видов секции Sitopsis.
Изучение распространенности и структурной организации субтеломерных тандемных повторов Spelt 1 и Spelt52 у тетраплоидных и гексаплоидных видов Triticum. Анализ реорганизации данных семейств повторов в геномах экспериментально полученных полиплоидов Triticum-Aegilops на ранних стадиях образования амфиплоидного ядра.
Идентификация микросателлитных локусов мягкой пшеницы Т. aestivum в геноме Т. timopheevii. Оценка внутри- и межвидового полиморфизма по длине микросателлитных локусов у Т. aestivum и Т. timopheevii. Изучение уровня дивергенции последовательностей ДНК в районах, прилегающих к микросателлитному мотиву в процессе эволюции трибы ТгШсеае.
Анализ уровня изменчивости длины микро сателлитов в зависимости от их структуры. Изучение воздействия стрессовых факторов в процессе отдаленной гибридизации и при культивировании in vitro на длину микросателлитов.
Использование SSR (микросателлитных) маркеров для построения молекулярно-генетических карт хромосом геномов G и А1 Т. timopheevii и их сравнение с аналогичными картами хромосом геномов В и А полиплоидных пшениц. Изучение причин и времени возникновения нарушения коллинеарности (порядка расположения) маркеров на хромосомах в процессе эволюции рода Triticum.
Изучение эффективности использования микросателлитов для маркирования генов, для контроля и ускорения процессов создания
13 новых генотипов злаков с необходимым комплексом признаков и для паспортизации сортов мягкой пшеницы.
Научная новизна работы. При выполнении настоящей работы получен ряд новых приоритетных результатов.
Выделено и изучено новое семейство тандемных повторов Triticeae -Spelt 1, составляющее до 2% генома Ае. speltoides, и детально охарактеризовано семейство Spelt52, специфичное для геномов Ае. speltoides, Ле. longissima я Ае. sharonensis. Показано, что эволюция видов Aegilops секции Sitopsis сопровождалась изменениями в структурной организации, числе копий и локализации семейств повторов Spelt! и Spelt52 в дистальных районах хромосом. Впервые на экспериментально полученных аллополиплоидах выявлено, что повторы Speltl имеют тенденцию к элиминации, a Spelt52 - к амплификации на ранних стадиях образования полиплоидов. Показано, что различия в распределении макросателлитов у естественных аллополиплоидов связаны как с исходным распределением Speltl и Spelt52 у предковых диплоидных форм, так и с реорганизацией данных повторов на стадии образования полиплоидов и в ходе последующей эволюции.
Впервые проведена оценка амплификации 743 микросателлитных маркеров Т. aestivum в геноме Т. timopheevii. Выявлено, что более 60% микросателлитных локусов мягкой пшеницы Т. aestivum присутствуют в геноме Т. timopheevii. Показано, что микросателлитные локусы, содержащие повтор CT(GA), имеют более высокий уровень изменчивости в геноме Т. timopheevii по сравнению с локусами, содержащими повтор CA(GT), а степень повторяемости динуклеотида, по-видимому, не влияет на полиморфизм локуса.
Использование микросателлитных маркеров позволило впервые построить молекулярно-генетические карты хромосом геномов G и А и сравнить их с аналогичными картами хромосом геномов В и А,
14 соответственно. Показано, что образование и эволюция аллополиплоидных видов сопровождалась транслокациями, инверсиями и другими событиями, приводящими к изменению порядка расположения маркеров на хромосомах. Реорганизация хромосом происходила как при дивергенции диплоидных предшественников, так и при образовании тетраплоидных форм и их последующей эволюции.
Практическая ценность работы. Создан банк данных, включающий информацию по составу и длине микросателлитных локусов пшеницы: 1) для сорта Саратовская 29 (321 локус) и для трех тестерных линий мягкой пшеницы - ЧаЙниз Спринг (Chinese Spring; 692 локуса), Опата 85 (Opata 85; 635 локусов) и Синтетик W7984 (Synthetic W7984; 488 локусов); 2) для четырех образцов Т. timopheevii (743 локуса).
Показано, что микросателлиты являются идеальными маркерами для картирования генов и геномов, для контроля и ускорения процессов создания новых генотипов злаков с необходимым комплексом признаков, для паспортизации сортов.
Разработан образец геномного микросателлитного (SSR) паспорта для сортов мягкой пшеницы.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Семейства субтеломерных макросателлитов (Speltl и Spelt52) возникают в процессе дивергенции диплоидных видов независимо друг от друга и при образовании одной или нескольких таксономических групп. Различия в распределении повторов Speltl и Speit52 в аллополиплоидыом геноме связаны как с распределением их у исходных предковых диплоидных форм, так и с реорганизацией тандемных повторов на стадии образования полиплоидов и в ходе последующей эволюции.
Т. aestivum (геномная формула BBAADD) и Т. timopheevii (GGA!A!) имеют общие SSR-локусы, Дивергенция ДНК в районах, прилегающих к микросателлитам, находится в прямой зависимости от времени
15 расхождения диплоидных предшественников данных видов. Уровень полиморфизма SSR-локуса зависит от нуклеотидного состава микросателлитного повтора.
Порядок расположения (коллинеарность) маркеров на хромосомах сохраняется в гомеологичных геномах (G и В, А и А1) за исключением районов хромосом, вовлеченных в транслокации и инверсии у диплоидов и тетраплоидов.
Микросателлиты являются эффективными маркерами для картирования генов, для контроля и ускорения процессов создания новых генотипов злаков с необходимым комплексом признаков и для паспортизации сортов.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на 29 международных, всесоюзных и всероссийских съездах, симпозиумах, конгрессах, совещаниях и семинарах, в том числе на 50-ом симпозиуме по экспериментальной биологии (Норвич, Великобритания, 1995); 3-й, 4-й и 6-й исследовательских конференциях Гатерслебена (Германия, 1996, 1999, 2000); 5-й и 6-й международных конференциях по пшенице (Анкара, Турция, 1996; Бухарест, Венгрия, 2000); 9-ом международном симпозиуме по генетике пшеницы (Саскатун, Канада, 1998); Международной конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998); Международном симпозиуме "Биотехнология и in vitro биология в 21 веке" (Кенес, Израиль, 1998); Всероссийском симпозиуме "Изучение генома и генетическая трансформация растений" (Иркутск, 1999); 4-ом съезде Общества Физиологов Растений России (Москва, 1999); Международной конференции «Биоразнообразие и динамика экосистем в северной Евразии» (Новосибирск, 2000); 4-ом международном симпозиуме по Triticeae (Кордова, Испания, 2001); Международной конференции «Генетические коллекции, изогенные и аллоплазматические линии» (Новосибирск, 2001); 10-й, 11-й, 12-й, 13-й EWAC конференциях (Витербо, Италия, 1997; Новосибирск, 2000; Иорвич,
Англия, 2002; Прага, Чехия, 2005); Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва-Минск, 2001); 1-й и 3-й Конференциях по геномике растений (Берлин, Германия, 2002; Лион, Франция, 2004); Международном рабочем совещании «Применение молекулярных маркеров растений» (Варшава, Польша, 2002); 3-й и 4-й Конференциях BGRS (Новосибирск 2002, 2004); II конференции МОГиС (Москва, 2003); Международной конференции по полиплоидии (Лондон, Великобритания, 2003); III съезде ВОГиС (Москва, 2004); V международном совещании по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений (Санкт-Петербург, 2005); Международной конференции, посвященной Тимофееву-Рессовскому (Ереван, Армения, 2005).
Публикации. Материал диссертации опубликован в 39 статьях в ведущих международных (15), отечественных (16) научных журналах и в реферируемых сборниках международных конференций (8).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 331 странице, включая 51 рисунок и 36 таблиц, Список литературы содержит 516 работ.
Классификация родов Triticum L. я Aegilops L
Семейство злаковых Poaceae Barnhart (Gramineae Juss.) объединяет многие важные сельскохозяйственные культуры, среди которых пшеница (Triticum L.), рожь (Secale L.), ячмень (Hordeum L.), кукуруза (Zea L.), рис (Oryza L.), просо (Panicum L.) (Цвелев, 1976). Роды Triticum, Aegilops L., Secale и Hordeum входят в состав трибы Triticeae Dum. семейства злаковых. Рис и кукуруза относятся к трибам Oryzeae Dura. Andropogoneae Dura., соответственно. Триба Triticeae подразделяется на подтрибу Triticinae Trin. ex Griseb. (Цвелев, 1976) или другое ее название Frumentaceaea Dum. (Дорофеев и др., 1979; Гончаров, 2002), куда входят виды Triticum, Aegilops и Secale. Род Hordeum входит в состав другой подтрибы Hordeinae Dum..
В 1913 году Шульц (Schulz, 1913), описывая историю зерновых культур, разделил род Triticum на три основных таксономических группы: однозернянки, эммеры и спельты. Данная классификация была поддержана работой Сакамура (Sakamura, 1918), в которой впервые было правильно установлено число хромосом у разных видов пшениц. Сакамура показал, что три группы, описанные Шульцом, отличаются по числу хромосом; однозернянки являются диплоидами (2и= 14), эммеры - тетраплоидами (2я 28), и спельты - гексаплоидами (2п=А1). Дальнейшие цитогенетические исследования (для обзора см. Feldman et al., 1995) показали, что различные полиплоидные виды пшеницы имеют основное число хромосом кратное 7 (х 7). Современная классификация пшеницы включает в себя диплоидные, тетраплоидные и гексаплоидные виды.
Система классификации пшениц находится в постоянной ревизии еще со времен Ж. Турнефора и К. Линнея (начало 18 века) (для обзора см. Дорофеев и др., 1979; Гончаров, 2002). В своей работе мы будем придерживаться систематики рода Triticum, предложенной Дорофеевым с сотрудниками (1979) (табл. 1), основы которой, разработаны рядом и затем переработаны и дополнены Н.И. Вавиловым (1935) и К.А. Фляксбергером (1935).
Систематика, принятая Дорофеевым с сотрудниками (1979), базируется на учете геномного состава видов и наличии или отсутствии ряда главных генов в доминантном состоянии. Последний критерий стал причиной существенных разногласий в современной систематике пшениц. Многие европейские и американские ученые в последнее десятилетие придерживаются точки зрения, что все приведенные в таблице 1 тетраллоидные виды с геномом AUB , являются подвидами вида Т. turgidum, с геномом A G - Т. timopheevii, а гексаплоидные - с геномом A"BD-подвидами Т. aestivum. Данная точка зрения основывается на взглядах Мак Кея (Mac Key, 1966), который считал, что различие по одному гену ие может быть достаточным критерием для возведения формы пшеницы в ранг вида. Дорофеев возражал против такой точки зрения, обосновывая это тем, что действия главных генов (Q, Р, С, S), меняют не только фенотип колоса, но и кардинально влияет на хозяйственную характеристику пшеницы, делая ее рентабельной или наоборот, невыгодной для возделывания (Дорофеев и др., 1979). В систематике, предложенной Дорофеевым с сотрудниками, род Triticum L. включает все виды дикой и культурной пшеницы, но исключает виды пырея и эгилопса (Дорофеев и др., 1979).
Вопрос о систематическом родстве Triticum и Aegilops поднимался регулярно, начиная с работ Линнея (Linnaeus, 1753), который выделил эгилопсы в самостоятельный род. В то же время существовали различные попытки объединения пшениц и эгилопсов. Некоторые исследователи объединяли Triticum и Aegilops в один род (для обзора см. Дорофеев и др., 1979), другие - предлагали отнести к роду Triticum не все эгилопсы, а лишь виды, входящие в состав секции Sitopsis, с которой пшеница связана своим происхождением (Chennaveeraiah, 1960). Третьи, предлагали рассматривать Triticum и Aegilops как отдельные роды, генетически объединенные в группу Triticum-Aegilops (Zohary, Feldman, 1962). В современной систематике род Aegilops рассматривается как самостоятельный род, входящий вместе с родом ТгШсит в одну подтрибу Triticinae (см. выше). При классификации рода Aegilops большинство ученых используют классификацию, предложенную Кихара и Танака (Kihara, Tanaka, 1970). Эта классификация с небольшими модификациями использовалась в последующих работах (Chennaveeraiah, 1960; Hammer, 1980; van Slageren, 1994; Гончаров, 2002).
Диплоидные и аллополиплоидые формы Aegilops и Triticum
Виды Aegilops и Triticum, используемые для изучения популяционного полиморфизма повторов Spelt 1 и Spelt52, были любезно предоставлены д.б.н. Н.П. Гончаровым (ИЦиГ, Новосибирск). Изучено 86 образцов диплоидных видов (Ае. speltoides, Ае. longissima, Ае. sharonensis, Ае. bicornis, Ае, searsii, Ае. heldrechii, Ае. caudata, Ае. uniaristata, Ае. tauschii, Т. Ьоеоіісит, Т. топососсит, Т. urartu), 91 образец тетраплоидных видов (Т. timopheevii, Т. militinae, Т. araraticum, Т. turanicum, Т. carthlicum, Т. polonicum, Т. aethiopicum, Т. dicoccoides, Т. dicoccum, Т. turgidum, Т. durum) и 109 образцов гексаплоидных видов (Т. compaction, Т. sphaerococcum, Т. spelta, Т. petropavlovskyi, Т. aestivum). При анализе диплоидных видов основное внимание было сосредоточено на видах Aegilops секции Sitopsis: Ае. speltoides, Ае. longissima, Ае. sharonensis, Ае. bicornis и Ае. searsii. Каталожные номера и происхождение изученных образцов Aegilops и Triticum указаны в приложении (табл. 1). Видовое название пшениц дано по Дорофееву с сотрудниками (1979), геномные формулы приведены по Фельдману (Feldman, 2001) (табл. 1). Видовое название Aegilops и их геномные формулы даны по Слагерену (Slageren, 1994) (табл. 2).
Аллополиплоиды Triticum-Aegilops, полученные в результате скрещивания, и их родительские формы, а также ряд образцов видов Aegilops секции Sitopsis были любезно предоставлены проф. М. Фельдманом (М. Feldman, Вейсмановский институт науки, Израиль).
Аллополиплоиды были получены путем колхицинирования гибридов F] (стадия So). Семена, полученные от самоопыления растений So, т.е. после мейоза, и растения, выращенные из этих семян, обозначены как S( и S2..
В работе использовали F( ячменно-пшеничные гибриды Я vulgare х Т. aestivum комбинаций сортов Неполегающий х Саратовская 29 (Н х С29) и Неполегающий х Пиротрикс 28 (Н х П28), а также растения первого беккросса (ВСі), полученные от (Н х С29) в результате беккроссирования Саратовской 29 и Пиротриксом 28. Гибридные растения Fi содержали в соматических клетках но 7 хромосом ячменя и 21 хромосоме мягкой пшеницы, что соответствует геномной формуле HABD и числу хромосом 2« = 28. Растения BQ имели геномную формулу HAABBDD и число хромосом 2п 49, Гибридный материал был любезно предоставлен проф. Першиной Л.А. (ИЦиГ, Новосибирск).
Андрогенные регенеранти и их потомство
Андрогенные регенеранти (RQ) И ИХ потомство (К{) были получены при культивировании пыльников сорта Саратовская 29 (С29) и пяти различных пшенично-ржаных замещенных линий (2«=42), у которых отдельные пары хромосом гексаплоидной пшеницы сорта С29 были замещены гомеологичными парами хромосом ржи (S. cereale L., геномная формула RR, 2и=14) (табл. 7). Данные растения были любезно предоставлены к.б.н. Добровольской О.Б. и проф. Першиной Л.А. (ИЦиГ, Новосибирск). Число и характеристика образцов, взятых в анализ, перечислены в таблице 7. Более детально методы получения регенерантов описаны у Добровольской (2003).
Индуцированные сферококкоидные мутантные линии мягкой пшеницы (Т. aestivum) сорта Саратовская 29 (МС 3287, МС 1453) и сорта Скала (МСК 2454) имели генотипы Sl/Sl, S3/S3 и S2/S2, соответственно (Майстренко и др., 1998). Для картирования генов S1, S3 и S2 было проведено скрещивание сферококкоидных мутантных линий Т. aestivum сортов Саратовская 29, Скала с сортом Новосибирская 67 и последующее самоопыление растений первого поколения (Fi). Данная работа была выполнена к.б.н. Лайковой Л.И. (ИЦиГ, Новосибирск). Для картирования генов S1 и S3 было выращено по 72 растения, а для S2 - 96 растений второго поколения (F2). Для 240 Р2-растений была проведена оценка формы колоса (нормальный, промежуточный и сферококкоидный) и проведен анализ геномной ДНК с использованием SSR-маркеров.
Растения беккроссных поколений от скрещивания линий мягкой пшеницы
Растения первого (BCj) и третьего беккросса (ВС3) от скрещивания замещенных линий Саратовская 29/Мироновская 808 5А (С29/М808 5А) и Диамант/Мироновская 808 5А (Дм/М808 5А) с сортом озимой пшеницы Безостая 1 (Бз1) были получены и любезно предоставлены для анализа к.б.н. Ефремовой Т.Т. На каждом этапе беккроссирования с Бзі, в скрещивание включали яровые растения, выбранные случайным образом. Донором гена яровизации являлись замещенные линии С29/М808 5А и Дм/М808 5А. В данных линиях хромосома 5А, несущая ген Vrn-Al, яровых сортов С29 и Дм была замещена на гомологичную хромосому озимого сорта М808, в результате чего замещенные линии несут единственный доминантный ген Vrn-Bl в хромосоме 5В. Микросателлитный анализ проводили на 8 яровых растениях из ВСз (Бз1 х Дм/М808 5А). В анализ также были взяты 7 яровых растений из ВС] (Бз1 х С29/М808 5А) и 5 яровых растений из BCj (Бз1 х Дм/М808 5А). Растения BCj и ВС3 от скрещивания Бз1 х Дм/М808 5А являлись сестринскими линиями.
Популяции F2 от скрещивания образцов пшеницы группы Timopheevi Семена Ргпоколения ниже перечисленных гибридов были получены Т.Т. Ефремовой. Всего получено 7 популяций F2 от скрещивания 4 образцов Т. timopheevii и одного образца Т. militinae:
Speltl - новое семейство субтеломерных тандемных повторов Ае. speltoides
Ае. speltoides - вид, имеющий крупные блоки теломерного гетерохроматина. До настоящего момента было клонирована только одна тандемно организованная последовательность pAesKB52, которая локализуется в субтеломерных районах хромосом (Anamthawat-Jonsson, Heslop-Harrison, 1993). Однако данное семейство повторов полностью не охватывает все районы теломерного гетерохроматина. В связи с этим, нами была предпринята попытка выделения и клонирования нового тандемного семейства повторов, ассоциированного с теломерным гетерохроматином.
Существует два подхода для клонирования фракции ДНК, обогащенной тандемными повторами. Первый метод основан на изоляции повторов из фракции "реликтовой ДНК", т.е. ДНК остающейся негидролизованной после обработки эндонуклеазами рестрикции (Bedbrook et al., 1980). Другой метод основан на выделении метилированной фракции ДНК, так как большая часть ПП находится в геноме в метилированном состоянии (Sano et al., 1988). Мы совместили два описанных выше метода для более эффективного клонирования тандемных повторов из генома Ае. speltoides (см. 2.4). В результате проделанной работы были клонированы четыре последовательности, дающие сильный сигнал гибридизации с ДНК Ае. speltoides, которые были обозначены как Speltl.l, Speltl.4, Spelt 1.10 и Speltl.15.
Саузерн-гибридизация показала, что все четыре клонированные последовательности имеют одинаковую организацию в геноме Ае. speltoides.
Так, при обработке геномной ДНК Ае. speltoides различными эндонуклеазами рестрикции (часть из них представлена на рис. 17), в трех случаях (Rsal, Tagl и НаеШ) была выявлена классическая тандемная организации последовательностей Speltl в виде «лесенки» с длиной мономерной единицы около 170 пн. длины в пн
Анализ первичной структуры показал высокий уровень гомологии клонированных последовательностей (рис. 18). Содержание АТ-нуклеотидов у последовательностей Speltl составляло 54,7%, что соответствует известному среднему содержанию данных нуклеотидов в геноме растений (Rivinetal., 1986). Сравнение первичной структуры Speltl. 1 с последовательностями из базы данных DDBJ, EMBL и GenBank при помощи программы "BLASTN"
(Altchul et al., 1990) не выявило гомологии с какими-либо последовательностями ДНК. Последовательность Speltl.l была зарегистрирована в банке данных DDBJ, EMBL и GenBank под номером Y09217. На основании вышеизложенного можно говорить о том, что все четыре клонированные последовательности являются членами одного нового семейства повторов злаков, которое мы обозначили как Spelt 1.
In situ гибридизация последовательности Spelt 1 на хромосомы Ae. speltoides (К-389) показала, что данное семейство повторов локализуется в районах теломерного гетерохроматина и присутствует практически на всех хромосомах данного образца Ae. speltoides (рис 19).
Для изучения количественного содержания повторов Spelt 1 в геномах диплоидных видов были использованы методы дот- и squash -дот-гибридизации.
Дот-гибридизация была проведена для 22 образцов злаков, входящих в состав 13 видов. Наиболее детально была изучена секция Sitopsis, в состав которой входит Ae. speltoides (табл. 9). Большинство изученных образцов Ае. speltoides (за исключением TS01) содержат от 1,5-3,0 х 105 копий последовательности Spelt 1 на гаплоидный геном. Содержание данного повтора в геноме других видов секции Sitopsis не выявлялось данным методом гибридизации.
Помимо видов Sitopsis, дот-гибридизация была проведена также с другими диплоидными видами трибы Triticeae, включая виды ТгШсит (Т. топососсит, Т. urartu), виды Aegilops {Ae. tauschii, Ae. mutica, Ae. caudata и Ae. cylindrica), ячмень (#. vulgare) и рожь (S. cereale). Данные дот-гибридизации повторов Speltl с некоторыми видами представлены на рисунке 20. По сравнению с Ae. speltoides число копий Speltl, уменьшается у Т. топососсит в 400 раз и у остальных исследованных видов в 1200-2400 раз или не выявляется методами дот-гибридизации.
Организация и эволюция семейств повторов Speltl и Spelt52
Speltl и Spelt52 относятся к фракции тандемно организованных последовательностей ДЬЖ трибы Triticeae. В настоящий момент, включая и полученные нами результаты, для трибы Triticeae можно описать несколько семейств тандемных повторов, каждое из которых объединяет гомологичные повторяющихся последовательностей ДНК, выделенные и изученные для разных видов злаков;
1) Семейство повторов pAsl/Afa/pHcKB6/dpTal (Rayburn, Gill, 1986; Nagaki et al., 1995, 1998b; Anamthawat- Jonsson, Heslop-Harrison, 1993; Vershmin et al., 1994), локализующееся преимущественно в субтеломерных и интеркалярных районах хромосом Ае. tauschii, D-генома Т. aestivum, видов рода Hordeum., Efymus trachycaulus и некоторых других видов (для обзора см. Sharma, Raina, 2005).
2) Семейство повторов 120 nH/pSc!19.2 (Bedbrook et al., 1980; Appels et al., 1986; Mclntyre et al., 1990). Широко распространено в субтеломерных и интеркалярных районах хромосом у многих видов трибы Triticeae и в близкородственной трибе Avenae (Mukai et al., 1993; Cuadrado et al., 1995; Vershinin et al., 1995; Katsiotis et al., 1997; Badaeva et al, 1996a; Contento et al., 2005). Данное семейство повторов было впервые выделено из Secale cereale и описано как одно из семейств теломерного гетерохроматина ржи (Bedbrook et al, 1980).
3) Tail тандемное семейство повторов, локализованное у большинства видов Triticiae в субтеломерных областях, в то время как у ТгШсит и Aegilops оно располагается в центромерной области (Kishii, Tsujimoto, 2002).
4) Семейство повторов 350 rm/pSc200/pSc74 и pSc250, основные тандемные повторы теломерного гетерохроматина ржи Secede cereale (Bedbrook et al., 1980; Appels et aL, 1986; Vershinin et al., 1995). В процессе эволюции данные последовательности амплифицировались в геноме отдельных видов Secale, а также у отдельных видов родов Agropyron nDasypyrum трибы Triticeae (Vershinin et al., 1996).
5) HvRT - последовательности ДНК, ассоциированные с теломерами хромосом Hordeum vulgare (Kihan, Kleinhofs, 1992).
6) pAesKB52/pGClR-l/Spelt52, тандемные повторы субтеломерных районов хромосом Ае. speltoides, Ае. longissima, Ае. sharonensis (Anamthawat- Jonsson, Heslop-Harrison, 1993, Zhang et al., 2002; Salina et al, 2004a; рис. 31, 32).
7) Spelt 1 - геном-специфичная последовательность, ассоциированная с теломерным гетерохроматином Ae.speltoides (Salina et ah, 1998; рис. 31, 32). Последовательности данного семейства пока не обнаружены методами гибридизации в геномах других видов Triticeae, за исключением Т. топососсит (слабый сигнал гибридизации; рис. 20) и полиплоидных видов, в формировании которых принимал участие Ае. speltoides (Zhang et al., 2002; рис. 34-36).
Для повторов Spelt 1 и Spelt52 характерны черты, отмеченные ранее при изучении тандемных повторов из других семейств Triticeae, а именно:
1) Длина мономера в пределах 170-185 пн (Speltl) и 350-380 пн (Spelt52) (рис. 23, 28), что соответствует однократной или двукратной длине укладки ДНК вокруг нуклеосомы (Trifonov, 1985; Vershinin, Heslop-Harrison, 1998), хотя не все тандемные повторы укладываются в данные интервалы длины (для обзора см. Sharma, Raina, 2005).
2) Различная организация мономерных единиц от простой (отсутствуют субсемейства повторов), как у повтора Speltl, до более сложноорганизованной как у семейства Spelt52, которое состоит их двух типов мономеров Spelt52.1 и Spelt52.2 (рис. 26). Данные мономеры имеют общую консервативную часть длиной 280 пн и негомологичные последовательности длиной 96 пн и 110 пн, соответственно. На основании анализа первых работ по тандемно организованным повторам у различных видов растений была предложена циклическая модель эволюции повторяющихся последовательностей ДНК, объясняющая появление сложноорганизованных повторов и различных вариантов в пределах одного семейства (Flavell et al, 1982; см. главу 1.4.1.2).
3) Различный уровень гомологии внутри различных семейств тандемных повторов, который зависит от скорости гомогенизации повторов внутри одного кластера тандемов, внутри одного генома и вида. Spelt 1 семейство высоко консервативно, по крайней мере секвенирование 10 Spelt 1-последовательностей, выделенных из различных видов Aegilops указывает на высокий уровень гомологии между ними (98%) (табл. 11). Такой же высокий уровень гомологии был отмечен для центромерных тандемных повторов риса, расположенных внутри одного кластера (Wu et al., 2003; Zhang Y. et al, 2004). Spelt52 более вариабельное семейство повторов. Даже внутри одного вида гомология консервативной части мономеров не превышает 84% (см. главу 3.1.2.1). Высокий уровень гетерогенности был отмечен также для 120 гш/pSc 119.2 семейства. Анализ 90 последовательностей из различных видов Triticeae не выявил участия процессов гомогенизации во внутривидовой эволюции данного семейства повторов (Contento et al., 2005).
