Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время библиотеки бактериальных искусственных хромосом (bacterial artificial chromosome ВАС) являются одним из ключевых инструментов анализа геномов. Особое значение создание ВАС библиотек имеет для видов с крупными геномами, так как с помощью ВАС векторов можно клонировать и стабильно сохранять последовательности ДНК больших размеров, до 300 т.п.н. (Tao, Zhang, 1998). ВАС система клонирования имеет ряд значительных преимуществ по сравнению с другими способами клонирования ДНК, а именно: высокая эффективность клонирования, небольшой размер вектора, простота выделения и очистки, высокая стабильность клеток и низкий уровень химеризма. ВАС библиотеки внесли ощутимый вклад в проекты по секвенированию геномов.
Геном лука батуна {Allium fistulosum L.) остается слабо изученными по
целому ряду причин, в числе которых: большой размер, высокая частота
дупликаций и повышенная гетерозиготность. Близкородственный вид Allium
сера L. (лук репчатый) является одной из самых важных овощных культур в
мире, второй после томатов (FAO, 2011). Геном лука репчатого активно
изучается. В 2001 году группой японских ученых под руководством Suzuki
была создана ВАС библиотека лука репчатого, покрывающая 30% генома
(Suzuki et al., 2001). Сейчас на сервере международного центра
биотехнологической информации (NCBI) находятся более 5 млн. нуклеотидных
последовательностей лука репчатого. Геном A. fistulosum остается практически
неизученным: в базе NCBI выложено лишь 871 нуклеотидная
последовательность.
Размер генома A. fistulosum на 28 % меньше генома лука репчатого (Narayan, 1988), что делает его более удобным объектом исследования. Более того, существует вероятность получения ВАС клонов A. fistulosum с высоким содержанием генов из-за их предполагаемой концентрации в проксимальном регионе хромосом (Havey et al., 2006). Также A. fistulosum является источником хозяйственно-ценных генов в селекции лука репчатого, генофонд которого оказался довольно обеднённым более чем за 5000 лет его возделывания человеком (Jones, Mann, 1963). A. fistulosum обладает генами устойчивости к луковой листовой гнили (Currah, Maude, 1984), розовой корневой гнили (Netzer et al, 1985) и антракнозу (Galvan et al, 1997), а также к луковой мухе (de Ponti, Inggamer, 1984). Кроме того, лук батун отличается высоким содержанием сухого вещества, более острым вкусом и морозостойкостью, более ранним и более коротким цветением, большей привлекательностью соцветий для насекомых-опылителей (Van der Meer, Van Bennekom, 1978).
Конструирование ВАС библиотеки A. fistulosum создает благоприятные условия для фундаментальных молекулярно-цитогенетических исследований луков. До сих пор остается неизвестной структура теломеры у луковых, в то время как для большинства растений последовательность теломеры хорошо известна (Sykorova et al., 2003с). В конце 2012 года японские ученые выявили
центромерный повтор A. fistulosum (Nagaki et al., 2012a). Однако исследовать его геномную организацию им не удалось. На важность изучения генома А. fistulosum и создания геномной ВАС библиотеки указывает и тот факт, что в 2013 году был начат проект по секвенированию его генома университетом Миссури (USA).
Цели и задачи работы. Цель работы - создание и анализ ВАС клонов генома лука {Allium fistulosum L.) как генетического ресурса для молекулярно-цитогенетических исследований и практической селекции.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Создать библиотеку ВАС клонов A. fistulosum;
-
Разработать ДНК-зонды на основе известных нуклеотидных
последовательностей луков в генетической базе данных NCBI;
3. Провести скрининг ВАС библиотеки A. fistulosum с ДНК-зондами на:
- субтеломерный тандемный повтор;
- видоспецифичные последовательности - субтеломерные и
центромерные;
- центромерные ретротранспозоны;
4. Провести FISH-BAC картирование отобранных ВАС клонов на
физической хромосоме;
-
Провести концевое секвенирование отобранных ВАС клонов;
-
Провести полное секвенирование ВАС клона, несущего
видоспецифичный субтеломерный повтор;
7. Провести полное секвенирование ВАС клона с прицентромерной
локализацией;
8. Провести биоинформатический анализ полученных нуклеотидных
последовательностей;
9. Провести FISH картирование тандемных повторов и
ретротранспозонов, входящих в состав последовательностей ДНК
ВАС клонов, на физической хромосоме. Научная новизна. Впервые сконструирована библиотека ВАС клонов А. fistulosum, на базе которой созданы молекулярно-цитогенетические маркеры на видоспецифичный субтеломерный повтор (AfIT23, 255 п.н.), видо-хромосомоспецифичный прицентромерный повтор (АІЇТ32, 197 п.н.). Выделены ВАС клоны, несущие известный общий для луковых субтеломерный повтор и определена теломерно-центромерная ориентация ДНК-вставок. Выявлен в ВАС клоне 5.12.7 тандемный повтор АІЇТ347 (75 п.н.), определены его копийность в геноме и диспергированная организация на физической хромосоме. Выявлено 7 ВАС клонов, несущих последовательность обратной транскриптазы ТуЗ/gypsy ретротранспозона, и впервые было доказано присутствие в центромерном регионе A. fistulosum ТуЗ/gypsy ретротранспозонов. Проведен сравнительный анализ хромосомной организации ТуЗ/gypsy ретротранспозонов у A. fistulosum и А. сера, определена их копийность в геномах А. сера и A. fistulosum.
Практическая значимость. Сконструированная ВАС библиотека, насчитывающая более 1000 клонов, является ценным генетическим материалом для секвенирования генома A. fistulosum, поиска последовательностей ценных генов, создания молекулярных маркеров для ускорения селекционного процесса и создания новых сортов с заданными свойствами. Созданы хромосом- и видоспецифичные молекулярно-цитогенетические маркеры, которые могут быть использованы в селекционных программах для мониторинга интрогрессии генетического материала в межвидовых гибридах луковых и интегрирования генетических и физических карт A. fistulosum.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIII молодежной научной конференции, секция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2013), XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (Москва, 2013), 6-м Международном симпозиуме по съедобным АШасеае (Фукуока, Япония, 2012), Международной научной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 146-летию Академии имени К.А.Тимирязева (Москва, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 151 странице машинописного текста и включают 44 рисунка, 2 таблицы. Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», «Выводы», «Заключение», «Список литературы» и «Список иллюстративного материала». Список литературы включает 307 источника, из них 298 иностранных.
