Введение к работе
Актуальность проблемы. Формирование симбиотических взаимоотношений
между организмами является одной из закономерностей эволюционного развития
биологических систем и основой качественных изменений в живом мире,
обеспечивающих успешную эволюцию различных групп организмов. Так, широкое
аспространение по земному шару высших растений в значительной мере
обусловлено их способностью к образованию взаимовыгодных симбиозов с
микроорганизмами, которые улучшают минеральное питание растений, а также
обеспечивают адаптации к различным стрессам и защиту от патогенов и фитофагов.
Среди растительно-микробных симбиозов одним из наиболее экологически
значимых является симбиоз между бобовыми растениями (сем. Fabaceae) и
клубеньковыми бактериями, или ризобиями (сем. Rhizobiaceae) (Provorov et al.,
002; Oldroyd, Downie, 2008). Благодаря биологической фиксации азота,
существляемой в специализированных органах растения - симбиотических
губеньках, колонизированных ризобиями, - атмосферный азот переводится в
орму, доступную в дальнейшем для всех живых организмов. Важность бобовых
астений как сельскохозяйственных культур, выращиваемых в различных
шматических поясах, определяет научно-практическое значение бобово-
изобиального симбиоза (Crews, Peoples, 2004).
Бобовые растения, ввиду своей высокой и разносторонней симбиотической ктивности, в наибольшей степени отвечают требованиям современной концепции [аптивного земледелия (Celik et al., 2004). В связи с этим ведется научная работа, аправленная на разработку методов создания наиболее эффективных растительно-икробных систем бобовых, при функционировании которых максимально еализуется потенциал продуктивности растения (Штарк и др. 2006; Борисов и др., 007). Особую актуальность поэтому приобретает изучение систем узнавания артнерами друг друга. Уникальной особенностью каждого конкретного штамма изобий является спектр выделяемых им сигнальных молекул, называемых Nod-акторами (Geurts et al., 1997). Специфичность взаимодействия растения с пределенными штаммами ризобий определяется наличием у растения ысокоспецифичных рецепторов, распознающих структуру Nod-факторов (Limpens t al, 2003; Radutoiu et al., 2003, 2007; Oldroyd, Downie, 2008). Исследования >ироды этих рецепторов, и, в более общем смысле, генетического контроля пецифичности взаимодействия с микроорганизмами со стороны растения, позволят ести научно-обоснованную селекцию наиболее эффективных пар микро- и акросимбионта. Кроме того, изучение последующих стадий развития бобово-изобиального симбиоза (проникновения бактерий в ткани корня и формирование ового органа растения - азотфиксирующего клубенька) позволяет выявить сновные механизмы, лежащие в основе развития и функционирования астительно-микробных систем, что также обогащает фундаментальные основы иологии и генетики развития высших растений.
Изучение генетического контроля развития симбиоза со стороны растения іутем мутационного анализа позволило выявить у 10 видов бобовых растений более
100 генов, ответственных за протекание различных стадий становления симбиоза. К настоящему времени более десятка таких симбиотических генов клонировано и охарактеризовано в отношении их детальной роли в симбиозе (см. обзоры Борисов и др., 2007; Oldroyd, Downee, 2008). Данные исследования проводятся в основном на модельных бобовых растениях лядвенце японском (Lotus japonicus (Regel.) К. Larsen) и диплоидной люцерне (Medicago tnincatula Gaertn.), однако сходная организация (синтения) геномов бобовых растений позволяет использовать накопленные знания и для клонирования симбиотических генов сельскохозяйственно-ценных бобовых, в частности, гороха посевного (Pisum sativum L.) (Kalo et al., 2004; Zhu et al., 2005). Клонирование симбиотических генов гороха необходимо для изучения особенностей его симбиотической системы и понимания механизмов координированного генетического контроля развития симбиоза путем взаимодействия геномов макро- и микросимбионта. Изучение генетического полиморфизма симбиотических генов гороха также облегчит селекцию сортов гороха с высокой симбиотической эффективностью, в полной мере соответствующих концепции адаптивного земледелия, и потому востребованных в России и на мировом рынке.
Таким образом, диссертационная работа соответствует самым современным направлениям мировых научных исследований в области биологии развития и генетики симбиозов, и поставленные цели и задачи представляют передний край мировой биологической науки.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось продолжение анализа генетической системы гороха посевного (P. sativum), обеспечивающей специфичность взаимодействия с клубеньковыми бактериями и контролирующей процесс образования азотфиксирующих клубеньков. В связи с этим, конкретными задачами работы являлись:
-
клонирование генов гороха (Pisum sativum L.), гомологичных симбиотическому гену LjNJrl лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) Larsen), и изучение их роли в формировании бобово-ризобиального симбиоза.
-
изучение полиморфизма генов гороха, кодирующих компоненты рецепторного комплекса, воспринимающего сигнальные молекулы ризобий.
-
отработка методики создания ген-специфичных молекулярных маркеров для генетической локализации симбиотических генов гороха.
-
генетическая локализация симбиотических генов гороха PsCoch, PsCrt и PsSym27 на генетической карте гороха с целью их последующего клонирования.
-
поиск генов диплоидной люцерны (Medicago tnincatula Gaertn.), гомологичных PsCoch, PsCrt и PsSym27, на основании результатов локализации этих генов в геноме гороха.
Здесь и далее первые буквы в названии генов и их белковых продуктов обозначают название вида растения: Lj - Lotus japonicus (Regel.) Larsen; Mt - Medicago tnincatula Gaertn.; Ps - Pisum sativum L.
Научная новизна работы. Впервые с использованием синтении геномов
лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) Larsen) и гороха посевного (Pisum
ativum L.) были клонированы два симбиотических гена гороха PsSym37 и PsKl,
кодирующие рецепторные киназы, содержащие LysM-домены и предположительно
связывающие бактериальный Nod-фактор - важнейшую сигнальную молекулу,
синтезируемую ризобиями. Анализ экспрессии этих генов в различных тканях
астения методом «ГЩР в реальном времени» подтвердил симбиотическую роль
генов PsSym37 и PsKl. Впервые была продемонстрирована роль гена PsSym37 в
определении специфичности взаимодействия растения с ризобиями: была показана
важность аминокислотной замены в последовательности PsSym37 для восприятия
структуры Nod-факторов. Впервые была изучена изменчивость генов PsSym37 и
sKl у серии линий гороха с различным проявлением специфичности к структуре
Nod-факторов, и на основании результатов впервые было выдвинуто предположение
том, что продукт гена PsKl способен выступать в качестве рецептора,
овышающего точность определения структуры Nod-фактора.
Также были разработаны уникальные ген-специфичные молекулярные маркеры ш сопоставления генетических карт гороха и диплоидной люцерны с спользованием генотипов коллекции гороха лаборатории генетики растительно-икробных взаимодействий ПНУ ВНИИСХМ С применением этих маркеров первые было осуществлено точное генетическое картирование генов гороха PsCrt, sCoch и PsSym27, ответственных за регуляцию бобово-ризобиального симбиоза. На сновании данных картирования впервые был клонирован ген PsCoch, емонстрирующий высокую гомологию с генами ВОР1 и ВОР2 Arabidopsis thaliana L.) Heynh., кодирующими регуляторные белки, контролирующие активность еристем растения.
Практическая ценность.. Полученные в диссертационной работе данные,
видетельствующие о вовлечении в сигнальные взаимодействия между бактериями
растениями нескольких рецепторних киназ, повышающих специфичность
заимного узнавания партнеров, а также об участии белковых регуляторов
истемных реакций растения в формировании клубеньковых меристем, будут
спользованы для построения моделей взаимодействия генов (в том числе генов
икроорганизмов и растения) в ходе развития симбиозов. Обнаруженные механизмы
щтроля специфичности взаимодействия макро- и микросимбионта могут
^пользоваться в работе по научно-обоснованному созданию высокоэффективных
астительно-микробных систем в сельском хозяйстве для максимального
спользования потенциала продуктивности сельскохозяйственных растений.
гработанная методика клонирования ключевых генов гороха на основе сходства
номов гороха и модельных бобовых может быть использована для эффективного
юнирования генов сельскохозяйственно-значимых видов бобовых растений,
тветственных за сельскохозяйственно-ценные признаки, например, архитектонику
тебля или старение симбиотических органов растения. Результаты работы
спользуются в материалах курса лекций "Симбиогенетика", читаемого на биолого-
почвенном факультете СП6ТУ, и в реализации селекционной программы «Симбиоз», осуществляемой в ГНУ ВНИИЗБК (Орел, Россия) под руководством проф. Т.С. Наумкиной.
Выполнение работы поддержано грантами CRDF (ST-012-0), РФФИ (04-04-48457, 06-04-01856, 07-04-13566, 07-04-01171, 07-04-01558), NWO 047.018.001, грантом ЕС FOOD-CT-2004-506223, Госконтрактами Миннауки (02.445.11.7492, 02.434.11.7122, 02.512.11.2143, 02.512.11.2149, 02.512.11.2182, НШ-1103.2003.04, НШ-9644.2006.4, НШ-5399.2008) и персональным грантом Travelling Fellowship (The Company of Biologists).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 9-ой, 10-ой и 11-ой Международных школах-конференциях молодых ученых «БИОЛОГИЯ -НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, Россия, 2005, 2006, 2007 гг.); четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007 г.); I Всероссийском конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз-Россия 2008» и Школе - конференции «Биология: традиции и инновации в 21 веке» (Казань, Россия, 2008); Symposium and postgraduate course «Agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Kaunas, Lithuania, 2005; StPetersburg, Russia, 2007); 7th. European Nitrogen Fixation Conference (Aarhus, Denmark, 2006); 15th. International Congress on Nitrogen Fixation (Cape Town, South Africa, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и более 10 тезисов докладов на российских и международных научных конференциях.
Объем и структура диссертации.. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из 266 источников. Работа изложена на 180 страницах и содержит 40 рисунков и 16 таблиц.
Похожие диссертации на Клонирование симбиотических генов гороха посевного (Pisum sativum L.) с использованием синтении геномов бобовых растений
