Содержание к диссертации
Введение
I. Значение фитаз для кормопроизводства 9
II. Источники ФИТАЗ 10
2.1. Скрининг фитаз у микроорганизмов 10
2.2. Фитазы грибного происхождения 11
2.2.1. Фитаза PhyA Asprergillus niger 13
2.2.2. Фитазы из A terreus и базидиошщетов 13
2.2.3. Термостабильная фитаза Aspergillus jutnigatus 14
2.2.4. Дрожжевые фитазы 15
2.3. Бактериальные фитазы 15
23.1. Фитаза АррА Е. сой 16
2.3.2. Фитазы бактерий родов Klebsiella Я Citrobacter 17
2.3.3. Фитазы бацилл 18
3. Филогенетическая классификация фитаз 19
4. Различные механизмы действия фитаз из разных белковых семейств 21
4.1. Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз. 21
4.2. Бациллярные щелочные фитазы 24
4.3. Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз. 25
5. Биохимические свойства фитаз и их пгомышленно важные характеристики 26
6. Изменение свойств белков при помощи методов белковой инженерии 31
6.1. Принципы рационального конструирования белков, 31
6.2. Методы «направленной эволюции» 33
6.3. Концепция «консенсусний» последовательности 34
6.4. ИзменениерН профиля белков 37
7. Экспрессия фитаз в различных системах 39
7. /, Экспрессия фитаз в бактериях 39
7.2. Экспрессия фитаз в дрожжах 40
7.3. Экспрессия фитаз в грибах , 41
III. Материалы и методы . . 43
1. Средни условия культивирования 43
2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды 43
3. Приготовление образцов фитаз 47
4. Свойства ферментов 48
5. Конструирование штаммов К coll с делецией аррА 49
6. Гибридизация ДНК с радиоактивным зондом и изоляция фрагмента ДНК, содержащего ген phyX, гомологичный гену аррА 49
7. Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность 50
8. Конструирование геномной библиотека и отбор клонов с искомой вставкой 51
9. Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз 51
10. Определение N-концевой аминокислотной последовательности белка 52
11. Анализ аминокислотных последовательностей 53
IV. Результаты и обсуждение .54
1. Поиск новых фитаз, продуцируемых бактериями 54
1.1. Поиск секретируемых фитаз бактерий 54
1.1.1. Поиск фитаз у природных изолятов 54
1.1.2. Поиск фитаз у коллекционных штаммов 55
1.2. Поиск внутриклеточных фитаз у грамотрицательных бактерий 56
1.2.1. Поиск внутриклеточных фитаз у ксллекциошшх штаммов , 56
1.2.2. Исследование фитаз у представителей природных популяций Е. coli 57
2. Клонигование гена phyx, имеющего сходство с арра е. coli, но кодирующего фермент С
неизвестной функцией 59
2.1. Поиск генов, гомологичных аррА у бактерий синтезирующих внутриклеточные фитазы 59
2.1.1. Поиск гомологичных генов с использованием ГЩР 59
2.1.2. Поиск гомологичных генов с использованием метода гибридизации 59
2.1.3. Рестрикционного анализ фрагмента хромосомы О. protem В5477, содержащих phyX 60
2.1.4. Исследование других штаммов О. proieus на наличие гена phyX 61
2.3. Изоляция и секвенирование фрагмента из хромосомы О. proteus, содержащего ген phyX. 62
2.3.1 Создание мутанта с полной делецией в хромосоме гена аррА для отбора гомологичных аррА генов 62
2.3.2. Изоляция гена phyX с неизвестной функцией, гомологичного аррА Е. coii, из хромосомы О. proteus 63
2.3.3. Последовательность фрагмента, содержащего veviphyX. 63
2.3.4. Экспрессия гена phyX в Е. coli 65
2.3.5. Замена концевой короткой С-концевой части РЬуХ приводит к воссозданию фитазной активности 65
3. Клонирование генов, кодирующих внутриклеточные фит азы бактерий 68
3.1. Изоляция, характеризация и экспрессия гена из бактерии Obesumbacterium proteus 68
3.1.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки 68
3.1.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента 70
3.1.3. Изоляция генов фитаз из других штаммов О. proteus 72
3.2. Изоляция гена фитазы из бактерии Citrobacter jreundii 73
3.2.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки 73
3.2.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента 75
3.2.3. Изоляция гена фитазы из штамма С. Jreundii Е3638 76
3.3. Изоляция гена фитазы из бактерии К cloaceae 77
3.3.1. Отбор клонов е фитазной активностью из геномной библиотеки 77
4. Анализ аминокислотных последовательностей клонированных генов 79
4.1. Выравнивание последовательностей белков-гомологов 79
4.1.1. Консервативность аминокислотных остатков активного центра 82
4.1.2. Консервативность дисульфидньгх связей 83
4.1.3. Сигнальные неї ггиды 84
4.1.4. Вторичная структура 84
4.1.5. Филогенетическое дерево 85
4.2. Вычисление «консенсусных» последовательностей на основе имеющихся последовательностей фитаз. 87
5. Экспрессия генов фитаз 88
5.1. Экспресиия фитаз в Е. coli BL21 (DE3) 89
5.1.1. Описание системы. 89
5.1.2. Определение удельной активности ферментов 89
5.1.3.Изучение свойств ферментов 92
5.1.4. Субстратная специфичность ферментов 95
5.2. Экспрессия фитаз в дрожжах. 96
5.2.1. Экспрессия АррА. coli в различных дрожжевых системах 96
5.2.2. Экспрессия фитаз С. fieundii и О. proteus в P. pastoris 98
5.2.3. Свойства рекомОинантных фитаз из P. pastoris 99
V. Заключение..., „.,„ , 101
VL Выводы . „„„ 105
VII Список литературы . 106
- Различные механизмы действия фитаз из разных белковых семейств
- Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность
- Создание мутанта с полной делецией в хромосоме гена аррА для отбора гомологичных аррА генов
- Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки
Введение к работе
Актуальность темы
Фитат (мио-инозитол гексакисфосфат) является преобладающей формой накопления фосфора в зерне, семенах масличных и бобовых [133]. Животные с однокамерным желудком не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия или низкого уровня фитазной активности в гастроэнтеральном тракте животных [14]. Кроме того, фитаты уменьшают доступность белков и микроэлементов в кормах. Не усвоенные фитаты, попадая в почву и водоемы, вызывают загрязнение окружающей среды [66].
Ферменты фитазы отщепляют фосфатные группы от фитатов и с успехом используются в животноводстве в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвояемость фосфора.
С развитием соевой промышленности доля рыбной муки в кормопроизводстве уменьшается, в то время как доля кормов растительного происхождения возрастает, и, следовательно, возрастает потребность кормопроизводства в пищевых добавках, содержащих фитазы.
Для практического использования препараты фитаз должны быть устойчивы к высушиванию и действию высоких температур в процессе приготовления комбикормов, а также приспособлены к действию в среде желудка животных (наличие активности при низких значениях рН и устойчивость к протеолитическим ферментам) [66]. Все известные фитазы имеют разные технологические характеристики, причем у каждого фермента есть свои преимущества и недостатки. В настоящее время требуются новые, более совершенные фитазы.
По данным литературы известно около 40 различных фитаз, которые относятся к трем семействам ферментов, имеющих разные типы строения молекул и активного центра. Большинство известных фитаз принадлежат к семейству кислых гистидиновых фосфатаз [118]. У всех аминокислотных последовательностей семейства есть консервативный мотив, содержащий остаток гистидина, который участвует в нуклеофильной атаке на отщепляемую фосфатную группу [43]. В семействе кислых гистидиновых фосфатаз была выделена группа грибных фитаз [39,104]. Фитазы из этой группы имеют хорошие технологические характеристики и используются для практических целей. Общим недостатком грибных фитаз является невысокая удельная активность. Бактериальные фитазы имеют более высокую удельную активность. Самая высокая удельная активность из всех изученных фитаз у фитазы АррА Е. colt — около
2000 ед/мг белка - [51]. Недостатком бактериальных фитаз является низкая термостабильность. Методы белковой инженерии позволяют повысить термостабильности белков [48, 86]. Для реализации этих методов требуется изучение ряда гомологичных аминокислотных последовательностей. Эффективность методов возрастает при увеличении количества изученных гомологичных последовательностей, поэтому поиск новых последовательностей является актуальной задачей. Наибольший интерес для данного подхода представляют фитазы, имеющие гомологию к фитазе АррА Е, coli, поэтому в данной работе был предпринят поиск именно таких последовательностей.
Цели и задачи работы
Данная работа посвящена поиску и изучению новых бактериальных фитаз, перспективных для применения в животноводстве. В связи с этим ставились следующие задачи:
1. Поиск и изучение бактериальных фитаз, имеющих промышленно ценные
свойства.
2. Клонирование генов фитаз, имеющих наиболее перспективные
технологические характеристики.
3. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей
обнаруженных фитаз. Вычисление «консенсусной» последовательности, на основе
полученного ряда гомологичных последовательностей фитаз.
4. Сверхэкспрессия клонированных генов фитаз в бактериальных и дрожжевых
системах и изучение их свойств.
Научная новизна
Впервые проведен скрининг продуцентов внутриклеточных фитаз среди грамотрицательных бактерий, выделенных из почвы и компоста. Внутриклеточные фитазы обнаружены у представителей нескольких видов из семейства Enterobacteriaceae и рода Pseudomonas. Также изучены внутриклеточные фитазы у 200 различных штаммов Е. coli, выделенных из разных источников. Проведено сравнение свойств новых фитаз с уже известными фитазами. Фитаза из Citrobacter freundii, обнаруженная в ходе
проведения данной работы, имеет более высокую удельную активность по сравнению с фитазами, известными в литературе.
Гены внутриклеточных фитаз из О. proteus, С. freundii и Е. cloaceae были клонированы. Их нуклеотидные последовательности были расшифрованы и отправлены в ГенБанк (NCBI). Было показано, что нуклеотидные последовательности генов, кодирующих новые фитазы, не имеют гомологии с известными генами. Однако их аминокислотные последовательности имеют гомологию с последовательностями других известных бактериальных фитаз. Вместе они формируют отдельную группу «бактериальных фитаз» в семействе кислых гистидиновых фосфатаз. В данной работе показано, что добавление новых членов значительно расширяет группу «бактериальных фитаз» и подтверждает обособленность этой группы от группы «грибных фитаз». Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей бактериальных и грибных фитаз.
На основе аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз была вычислена «консенсусная» последовательность. «Консенсусный» белок имеет большую термостабильность, чем его предшественники.
Определено, что фитазы из Obesumbacterium proteus и С. freundii обладают высоким сродством к фитату, в то время как первоначально описанная фитаза из Enterobacter cloaceae является глюкозо-1 -фосфатазо й. Кроме того, в хромосоме О. proteus обнаружен ген phyX, нуклеотидная последовательность которого гомологична последовательности гена аррА Е. colt. Ген ркуХ кодирует белок, функция которого неизвестна. Определено, что отсутствие фитазной активности у белка PhyX связано со строением С-концевой части белка. При замене короткой С-концевой части PhyX на С-концевую часть АррА у PhyX появляется фитазная активность.
Для последовательностей клонированных фитаз были предсказаны структуры молекул и определено положение аминокислотных остатков активного центра. Были определены сайты отщепления сигнальных пептидов, что дает возможность проведения корректной экспрессии зрелой части фермента в гетерогенных системах.
В данной работе показана возможность экспрессии генов бактериальных фитаз в дрожжах и секреции зрелых белков с использованием сигнальных пептидов дрожжей.
Практическая значимость
Фитазы используются в животноводстве в качестве ферментой добавки, улучшающей качество кормов. Предпочтение отдается фитазам, имеющим лучшие характеристики. Фитазы, обнаруженные в данной работе, не только не уступают по своим характеристикам уже известным фитазам, но и превосходят их по таким показателям, как, например, удельная активность фермента.
Аминокислотные последовательности фитаз, обнаруженных в данной работе, составляют единую группу с фитазой Е. coli. Расширение арсенала бактериальных фитаз, гомологичных между собой, дает возможность создания на их базе более совершенных ферментов при помощи методов белковой инженерии, таких как «DNA shuffling» [157], метода «консенсусной последовательности» [86], а также сайт-направленного мутагенеза [29].
Для продукции промышленных ферментов необходимо создание высокоэффективных продуцентов. В данной работе осуществлена экспрессия фитаз в бактериальных и дрожжевых системах, позволяющая нарабатывать ферменты в большом количестве.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Значение фитаз для кормопроизводства
Фитат (мио-инозитол гексакисфосфат) является преобладающей формой накопления фосфора в зерне, семенах масличных и бобовых. В виде фитата накапливается 60-80% от всего фосфора семян [137]. При прорастании семян фитаты уменьшают токсичный эффект свободного железа [135]. Фитаты выполняют также и другие важные функции для растений: в виде фитатов запасается энергия; фитаты участвуют в процессах регуляции фосфорного и минерального обмена [13, 26].
Животные с однокамерным желудком и человек, такие как свиньи, птицы и рыбы, не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия или низкого уровня фитазной активности в гастроэнтериальном тракте [14, 146].
Фитаты рассматриваются как фактор, понижающий качество кормов т.к. они связывают некоторые мул ьти валентные ионы металлов, в том числе важные микроэлементы, в недоступные комплексы, прикрепляются к молекулам белков, что затрудняет расщепление протеазами [17,66]. Кроме того, неусвоенные фитаты попадают в окружающую среду с фекалиями животных. Высвобождающиеся при этом фосфаты вызывают эфтрофикацию поверхностных вод и водоемов. Этот процесс приводит к значительному загрязнению окружающей среды [68,74,159].
Ферменты фитазы отщепляют фосфатные группы от фитатов и с успехом используются в качестве кормовой добавки, значительно повышая усваиваемость фосфора [6, 8, 28, 53].
По классификации Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) фитазы принадлежат к классу гидролаз фосфорных моноэфирных связей или фосфатаз (ЕС 3.1.3: ЕС 3 - гидролазы, ЕС 3.1 -гидролазы эфирных связей). Фитазы образуют несколько семейств ферментов в этом классе (описано ниже). В данной работе термин «фитаза» употребляется для обозначения ферментов, имеющих большее сродство к фитату, чем к другим фосфорилированным соединениям.
С развитием соевой промышленности во второй половине двадцатого века доля рыбной муки в кормопроизводстве уменьшается, в то время как допя сои и семян возрастает. Корма растительного происхождения содержат фитат, следовательно, возрастает потребность кормопроизводства в пищевых добавках, содержащих фитазы.
При этом состав ферментов, входящие в состав добавок, в том числе и фитазы, постоянно изменяются так, что предпочтение отдается новым ферментам, лучшим по своим характеристикам. Кроме того, увеличивается разнообразие и количество добавляемых ферментов. В случае фитаз применяются одновременно смеси ферментов, имеющих разные характеристики для достижения максимально высокой суммарной эффективности. Эта эффективность достигается за счет работы ферментов в разных условиях пищеварительной среды, а также различных механизмов отщепления фосфатных групп, позволяющих комплексу ферментов гидролизовать большее количество фосфатных групп.
Известно несколько крупных компаний, занимающихся производством кормовых добавок, содержащих фитазы [125]. До последнего времени большая часть препаратов фитаз была представлена препаратом марки «Natuphos» представляющий собой фитазы разных штаммов гриба Aspergillus niger. По оценкам компании Cenzon [ 125] мировыми лидерами производства этой марки являются голландская компания Gist-Brocades и финская компания Finnfeeds. В настоящее время другие биотехнологические компании также ведут разработку технологий для производства препаратов, содержащих фитазы.
В условиях конкуренции применение будут находить препараты фитаз, имеющие лучшие характеристики. Совершенствование фитаз возможно посредством направленного поиска новых ферментов, а также при помощи технологий изменения свойств ферментов методами генной инженерии.
2. Источники фитаз
2.1. Скрининг фитаз у микроорганизмов
Попадая в почву, фитаты постепенно разлагаются пулом фитаз микробного происхождения. Следовательно, почвенные микроорганизмы перспективны с точки зрения поиска фитаз. Секретируемые фитазы были обнаружены у многих почвенных микроорганизмов. В основном эти организмы были представлены различными грибами и бациллами [1, 2, 175]. Почвенные микроорганизмы могут не проявлять фитазную активность в обычных условиях, при выращивании на богатой среде. Однако фитазы в этом случае можно обнаружить, если провести индукцию ферментов. Наиболее логично предположить, что индуцирующими факторами являются фосфорное голодание и наличие в среде фитатов. Этим методом удалось обнаружить несколько фитаз бактерий,
отсутствующих в обычных условиях [138]. В нескольких работах [21, 86, 144] исследователи отбирали из почвенных микроорганизмов только те, которые могут использовать фитаты в качестве единственного источника фосфора, методом обогащения на селективных средах. Отбираться при таком подходе должны микроорганизмы, заведомо продуцирующие фитазы. Однако подобные исследования дали скудные результаты. Только несколько видов бактерий и грибов оказались способны к росту на средах, содержащих фитат в качестве единственного источника фосфора, хотя фитазную активность имеют представители значительно большего количества видов микроорганизмов.
В работе [185] секретируемые фитазы искали у микроорганизмов, обитающих в различных отделах пищеварительного тракта животных, где так же, как и в почве, имеется пул фитазной активности. Этот пул имеет три составляющие: собственные фитазы животных; фитазы, секретируемыми кишечными микроорганизмами, а также внутриклеточные фитазы микроорганизмов, лизированных в результате пищеварительной деятельности животного. Секретируемые фитазы были обнаружены у представителей нескольких видов кишечных микроорганизмов. Самая высокая активность была у представителей видов Selenomonas ruminantium и Mitsuoketla multiacidans, которые являются облигатными анаэробами.
При поиске фитаз у определенных групп микроорганизмов были обнаружены ферменты с определенными свойствами. Например, у микроорганизмов-термофилов были обнаружены термостабильные фитазы [12, 142]. У микроорганизмов родственных таксономических групп вероятно существование гомологичных ферментов с похожими свойствами. Внутриклеточная фитаза АррА из Е. coli имеет самую высокую удельную активность фермента, среди всех известных фитаз, устойчива к пепсину и активна при низких значениях рН. Возможно, у различных штаммов Е. coli или у других видов бактерий, родственных Е. coli, принадлежащих семейству Enterobacteriaceae, внутриклеточные фитазы также имеют похожие свойства.
2,2. Фитазы грибного происхождения
Самые первые сведения о фитазах микроорганизмов появились в результате скрининга изолятов почвенных микроорганизмов (грибов и бактерий) на фитазную активность [149]. Активность была обнаружена только у 30 из 2000 исследуемых изолятов. Все активные штаммы принадлежали грибному царству, причем 28 из них
относились к роду Aspergillus, а два оставшихся - к родам Penicillium и Мисог. У всех исследованных почвенных бактерий в этой работе фитазной активности не обнаружено. Поиск фитаз у почвенных микроорганизмов проводился и в других работах, и независимо разными авторами было отмечено, что у изолятов почвенных грибов секретируемые фитазы встречаются значительно чаще, чем у бактерий [2].
В работе [1] фитазная активность исследовалась у музейных микроорганизмов и почвенных изолятов. Фитазы были обнаружены у представителей шести видов почвенных грибов. В работе [179] было исследовано 200 грибных штаммов с двухступенчатым отбором штаммов, продуцирующих высокое количество фермента. Наибольшее количество фитазы около 2 ед/мл сегрегировалось в культуральную жидкость представителями рода Aspergillus. В работе [175] было исследовано 132 природных грибных штамма и обнаружены фитазы у представителей разных видов рода Aspergillus.
В работе [2] были исследованы 524 грибных изолята из разнообразных почв и компостов, а также 263 грибных коллекционных штаммов, включающие 76 родов и 149 видов, из коллекции ВКПМ. В этой работе у фитаз были изучены свойства, важные для использования ферментов в кормопроизводстве, такие как значения рН оптимума, устойчивость к действию высокой температуры и протеазам желудочного сока сельскохозяйственных животных. Фитазная активность обнаружена у представителей 41 рода грибов из 76 исследуемых, что говорит об очень большом таксономическом разнообразии грибных фитаз. Активными оказались 494 штамма, или 63% из всех исследуемых. Наибольшая доля активных штаммов обнаружена у представителей родов Aspergillus, Penicillium и Armillaria. Фитазы, продуцируемые этими штаммами, оказались также наиболее пригодными для использования в кормопроизводстве.
2.2.1. Фитаза PhyA Asprergillus niger
До настоящего времени в кормовых добавках в качестве фитаз использовался в основном препарат марки «Natuphos», содержащий фитазу PhyA штамма A. niger NRRL 3135 (также называемого A.ficuum) [20, 125]. Впервые способность A. niger к гидролизу фитата обнаружена в работе [149]. Несколько позднее [49] был описан штамм A. niger NRRL 3135 с более высокой (около 5 ед/мл) фитазной активностью, чем у других известных в то время грибных штаммов. Внеклеточная фитаза этого гриба гликозилирована, состоит из 467 аминокислот и имеет молекулярную массу около 85
кДа. Удельная активность очищенного белка, по разным оценкам, 100-120 ед/мг белка [179]. Дегликозилированный белок имеет молекулярную массу около 50 кДа. Данная фитаза имеет ряд преимуществ: достаточно высокую термостабильность, устойчивость к действию трипсина и пепсина. Рабочий диапазон фермента (рН 1.5-6.5) соответствуют кислотности среды желудка животных.
Эта самая первая фитаза, ген которой был клонирован и секвенирован. Фрагмент, включающий ген фитазы был изолирован из библиотеки на основе вектора Lambda FIX II [52]. В качестве зонда для гибридизации использовался ПЦР продукт, наработанный с вырожденных праймеров, составленных по последовательностям концевых участков белка. Впоследствии для клонирования генов грибных фитаз вырожденные праймеры составлялись по консервативным последовательностям участков фитазы PhyA, имеющим минимальную вырожденность. При этом в дальнейшем работа по клонированию существенно облегчалась за счет исключения этапа по очистке и секвенированию белков. После клонирования PhyA A. niger стало возможно использовать последовательность гена phyA для включения в мультикопийные системы экспрессии, значительно повысив уровень продукции фермента.
Структурный анализ PhyA был выполнен в работе [83], что сделало этот фермент наиболее изученной фитазой.
2.2.2. Фитазы из Л. terreus и базидиомицетов
Желаемой для кормопроизводства характеристикой фитаз является высокая удельная активность. Грибные фитазы, при всем разнообразии, имеют относительно низкое значение этого показателя (1-100 ед/мг белка) [179]. У PhyA A. terreus была обнаружена более высокая удельная активность - около 200 ед/мг белка [104]. Это значение было самым высоким среди грибных фитаз на то время. Кодирующая часть PhyA Л. terreus составляет 466 аминокислот и включает единственный короткий интрон длиной в 48 аминокислот. Ближайшим гомологом PhyA A. terreus является PhyA А. niger. Значение идентичности их аминокислотных последовательностей составляет около 70%. По аминокислотным последовательностям этих фитаз изучалось влияние аминокислотных остатков активного центра на увеличение удельной активности фермента [163]. PhyA A. terreus способна гидролизовать различные фосфорилированные соединения, но со значительно меньшей специфичностью и при более низких значениях рН. Если сравнивать промышленные характеристики PhyA A. terreus и PhyA A. niger, то
последняя имеет несколько более широкий, особенно для кислой области, диапазон рН, но в два раза уступает в удельной активности фермента. В работе [164] при помощи сайт-направленного мутагенеза была увеличена активность фитазы PhyA A. terreus при низких значениях рН.
Недавно в работе [88] были клонированы и охарактеризованы пять фитаз из четырех базидиомицетных грибов. Эти фитазы оказались гомологами известных ранее фитаз из аскомицетов с идентичность около 50% по аминокислотной последовательности. Свойства базидиомицетных фитаз оказались также в целом схожими со свойствами аскомицетных фитаз. Однако по таким промышленным характеристикам, как термостабильность и особенно удельная активность фитазы базидиомицетов оказались лучше. Наиболее перспективной оказалась фитаза из Peniohora lycii, у которой удельная активность была около 1000 ед/мг белка, а термостабильность выше, чем у фитазы из A. niger.
2.2.3. Термостабильная фитаза Asprergillus fumigatus
Одним из требований кормопроизводства к фитазам является термоустойчивость ферментов, добавляемых в комбикорма, поскольку в процессе приготовления корма подвергаются высушиванию при повышенных температурах. PhyA A. fumigatus является самой термостабильной из всех известных фитаз [19]. Это единственная фитаза, которая выдерживает кипячение: при 20-минутном прогреве этой фитазы в буферном растворе при Ю0С теряется только 10% активности от исходной. Для сравнения, фитаза PhyA А, niger теряет около 70% от исходной активности при 20-минутном прогреве при 70 "С PhyA A. fumigatus имеет 7 сайтов гликозилирования, молекулярная масса варьирует от 60 до 100 кДа в зависимости от степени гликозилированности белка. Фитаза имеет и другие характеристики, соответствующие требованиям кормопроизводителей. Фермент активен при значениях рН от 3.5 до 6.5. Существенным недостатком фермента является относительно низкая удельная активность — 26 ед/мг белка. Однако термостабильность -величина, очень сильно зависящая от условий эксперимента и может варьировать у разных авторов. Так, например, в работе [107] термостабильность фитаз A. niger и А. fumigatus не различались. Возможной причиной понижения термостабильности фитазы A. fumigatus в этой работе является действие предварительных процедур очистки или инкубации при 4 С [95]. Этот пример может быть демонстрацией того, что
характеристики очищенного фермента, которые измеряются в лабораторных условиях, могут не соответствовать реальными условиями кормопроизводства.
При помощи методов сайт-направленного мутагенеза на основе PhyA A.fumigatus и гомологичных аминокислотных последовательностей и PhyA A. terreus PhyA A. niger были созданы гибридные белки, сочетающие высокую термостабильность и удельную активность [162, 163].
2.2.4. Дрожжевые фитазы
Скрининг фитаз у дрожжей проводился в работах [86, 144], с использованием штаммов из дрожжевой коллекции CBS. В работе [86]. Фитазная активность была обнаружена у представителей 8 из 20 исследуемых видов. Все активные штаммы проявили способность роста на средах с фитатом как с единственным источником фосфора (минимальные количества неорганического фосфата добавлялись в начале культивирования). Наибольшая фитазная активность обнаружена у представителей вида Schvanniomyces castellii В другой работе [144] исследователи ужесточили условия отбора. 1200 музейных штаммов из коллекции CBS были тестированы на способность роста на среде, содержащей фитат как единственный источник фосфора и углерода. Подавляющее большинство штаммов не дали роста, некоторые штаммы дали слабый рост за счет внутренних фосфатных ресурсов инакулята. Один из штаммов Arxula adeninivorans оказался способным к росту в таких условиях. Это говорит о способности ферментов этого штамма расщеплять все шесть фосфатных групп фитата. Возможно, фитат расщеплялся несколькими ферментами, представленными широкоспецифичными фосфатазами.
Недавно ген фитазы из P. anomala [175] был клонирован, секвенирован и изучены. Эта дрожжевая фитаза оказалась очень широко специфичными фосфатазой, и имела низкую удельную активность по отношению к фитату.
2.3. Бактериальные фитазы
Как уже отмечалось выше, у бактерий, в отличие от грибов, фитазы встречаются реже. Секретируемые фитазы отсутствовали у подавляющего большинства исследованных бактериальных образцов из почвы. В работе [138] почвенные бактерии, продуцирующие фитазы, отбирались методами обогащения на селективных средах,
содержащих фитат в качестве единственного источника фосфора. Исследователям удалось выделить всего четыре активных штамма из 438 образцов, выросших после первичного обогащения. Они все принадлежали к роду Pseudomonas. Два из них были способны утилизировать фитат, как единственный источник углерода. Фитазы этих штаммов не были очищены и изучены, и поэтому нельзя приписать отщепление всех 6 фосфатных групп какой-то одной определенной фитазе. Вероятно, в этом случае действовал комплекс ферментов фосфатаз, имеющих слабую специфичность и невысокую активность, поскольку утилизация фитата происходила очень медленно.
В других работах при скрининге секретируемых фитаз у почвенных микроорганизмов были обнаружены несколько активных штаммов, принадлежащих к роду Bacillus [149, 133]. Фитазы этих бактерий активны при нейтральных или слабощелочных значениях рН. При инкубации в кислой среде желудочного сока происходила быстрая и необратимая инактивация этих ферментов. Таким образом, фитазы этих бацилл оказались не пригодными при добавлении их в качестве кормовой давки, однако они могут быть с успехом применены при экспрессии в трансгенных растениях [170] или в бактериях, обитающих в кишечнике животных [76].
В другой экологической нише - пищеварительном тракте животных также обнаружены бактерии, продуцирующие фитазы [4, 31, 185]. Особенно большое количество разнообразных бактерий, секретирующих фитазы, обнаружено среди изолятов из рубца жвачных животных. Эти бактерии - облигатные анаэробы и требуют специальных условий для культивирования. Всего обнаружено 27 активных штаммов, принадлежащих к 4 разным видам бактерий Самая высокая активность была отмечена у представителей двух видов: Selenomonas rumimntium и Mitsuokella multiacidus.
Некоторые штаммы из группы молочнокислых бактерий оказались способными утилизировать фитат [188] У нескольких штаммов бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, были обнаружены внутриклеточные фитазы [38]. Как правило, эти фитазы имели перспективные с практической точки зрения характеристики.
2.3.1. Фитаза АррА Е. coli
Фермент, кодируемый геном аррА Е. coli первоначально был описан не как фитаза, а как «рН 2.5 кислая фосфатаза», гидролизующая п-нитрофенилфосфат [32]. Тем не менее, это не помешало исследователям провести изучение активного центра фермента и механизмов регуляции гена аррА клетками хозяина, поскольку гидролиз фосфатных
групп у фитата и других фосфорилированных соединений происходит по одинаковому механизму [44]. Ген аррА располагается на 22 минуте карты Е. coli в составе оперона аррС-аррА. Другие гены этого оперона аррВ и аррС кодируют ферменты оксидаз I и П, соответственно [7]. Биохимические свойства АррА и его способность расщеплять различные фосфорилированные соединения были изучены в работах [33, 35]. Последовательность гена аррА была расшифрована в раброте [32]. На участке ДНК, предшествующем аррА идентифицированы возможные —10 и -35 сайты инициации транскрипции, а также определено положение аррА внутри последовательности генов полицистронного оперона. Таким образом, транскрипция аррА регулируется как собственным промотором, так и промотором оперона, расположенным на расстоянии 3 тпн от начала аррА [32].
Фермент АррА был отнесен к семейству кислых гистидиновых фосфатаз [122]. Термин «кислая гистидин фосфатаза» введен для обозначения тех фосфатаз, у которых действие определяется нуклеофильным остатком гистидина. В этом семействе последовательности. содержат консервативный мотив RHGXRXP. Высокая степень консервативности в этом семействе также характерна для аргинина и гистидина, соответствующих 92 и 3 03 позициям в аминокислотной последовательности АррА. Как показано в работе [122], замена аминокислотных остатков в положениях His-17, His-303, Arg-16, Arg-20 и Arg-92 приводит к существенному снижению фосфатазной активности фермента. Молекулы аргинина и гистидина заряжены положительно и могут удерживать отрицательно заряженные молекулы фитата при помощи водородных связей, причем при замене Arg-20 и Arg-92 значения Vm« и Кт изменяются для разных фосфорилированных соединений в разной степени. Предположено, что этим остаткам принадлежит роль связывания фосфатных групп субстрата, которые для разных субстратов могут иметь разное положение в пространстве. Замена оставшихся His-17, His-303, Arg-16 уменьшает активность фермента до нуля, и, по мнению авторов, эти остатки задействованы непосредственно в нуклеофильной атаке на отщепляемую фосфатную группу.
2.3.2. Фитазы бактерий родов Klebsiella и Citrobacter
Из других фитаз, продуцируемых бактериями семейства Enterobacteriaceae, известны фитазы Klebsiella terrigena (Raoultella terrigena) [57], Klebsiella pneumonia [148] и совсем недавно была очищена и изучена фитаза из Citrobacter braakii [79]. Фитазы
рода Klebsiella были не только очищены, но и их гены были клонированы и секвенированы. Их аминокислотные последовательности гомологичны последовательности фитазы Е. coli, но с низкой степенью идентичности (около 30%). Тем не менее, фитазы Е. coli и бактерий рода Klebsiella похожи по свойствам: у них схожие рН профили, температурный оптимум, они отщепляли фосфатные группы фитата, начиная с D-6 позиции. Похожие свойства характерны для фитазы из С. braakii. единственное отличие фитаз из бактерий рода Klebsiella, по сравнению с фитазами из Е. coli и С, braakii, более широкая субстратная специфичность и меньшая удельная активность.
2.3.3. Фитазы бацилл
Фитазы бацилл хорошо изучены и известны давно. Они были описаны одновременно с первыми грибными фитазами [133]. Фитазы бацилл отличаются от всех других известных типов фитаз. Фитазы бацилл активны при значениях рН больше 7.0, т. е. бациллярные фитазы являются «щелочными» фитазами. Бациллярные фитазы имеют относительно низкую молекулярную массу белка - около 38 кДа. Это значения может увеличивается примерно на 10% за счет включения в состав фитаз молекул воды из-за высокой гигроскопичности белка [80]. Несмотря на низкую удельную активность, около 10 ед/мг в очищенном препарате, фитаза В. subtilis оказывается специфична только по отношению к фитату, а не к другим фосфорилированным соединениям [23], т.е. является истиной фитазой. Все известные бациллярные фитазы очень похожи друг на друга по своим характеристикам.
Фитазы бацилл были первыми клонированными и секвенироваными бактериальными фитазами. Независимо друг от друга одновременно были опубликованы последовательности фитаз В. subtilis и Bacillus sp. [75, 80]. Аминокислотные последовательности обеих клонированных фитазах различаются всего на 3%. При поиске гомологии в ГенБанке ничего похожего на эти белки не обнаруживается. У этих фитаз отсутствует даже консервативный участок RHGXRXP, свойственный всему семейству кислых гистидиновых фосфатаз. Поэтому фитазы бацилл отнесены к новому семейству белков независимо в двух работах [75, 80]. В этих работах фитазы охарактеризованы как перспективные для использования в кормопроизводстве, т. к. ферменты имеют высокую термостабильность. Однако эти фитазы могут инактивируются в кислой среде желудочного сока. В этом случае ферменты не
эффективны для применения в качестве кормовой добавки. Термостабильность этих фитаз оказывается совершенно бессмысленной характеристикой. Фитазы бацилл могут быть перспективны для использования в генетически модифицированных растениях, а также при экспрессии в микроорганизмах-пробиотиках, обитающих в кишечнике животных. В этом случае значения рН их области действия соответствует требуемым условиям.
3. Филогенетическая классификация фитаз
Все фитазы способны отщеплять от фитата фосфатные группы, однако разные фитазы могут не иметь сходства по аминокислотным последовательностям и по филогенетическому происхождению.
Большинство известных фитаз относятся к семейству кислых гистидиновых фосфатаз ЕС 3.1.3.2 (Рис. II-1). Общим признаком этого семейства являются два консервативных мотива RHGXRXP и HD, содержащие аминокислотные остатки активного центра [122]. Все белки из этого семейства делятся на две большие группы, члены которых гомологичны между собой, но не имеют гомологии с членами другой группы, единственное сходство между последовательностями из этих групп — это консервативные сайты мотивов активного центра. Первая группа представлена фитазами грибного происхождения. Идентичность последовательностей этой группы очень высокая, варьирует примерно от 50 до 90%. Последовательности второй группы имеют меньше сходства (идентичны между собой примерно на 15-50%). Представлены фитазы второй группы в основном бактериальными фитазами или фосфатазами. Исключение составляют фосфатазы эукариотического происхождения, которые имеют очень отдаленную гомологию с грибными фитазами - всего около 15%, точнее около 10%, если рассчитывать по всей длине последовательностей при выравнивании. Тем не менее, трехмерные структуры белков с такой маленькой гомологией очень похожи [96]. По мнению авторов, трехмерные структуры фитаз из второй группы (фитаз бактерий и фосфатаз млекопитающих) и первой группы (фитаз грибов) имеют различное строение. Возможно, белки этих групп имеют различное филогенетическое происхождение, а последовательности активных сайтов либо возникли в ходе эволюции независимо, либо были каким-то образом перенесены из одной группы в другую.
Поскольку группе бактериальных фитаз свойственна большая разнородность между отдельными членами, принадлежащих не родственным бактериальным группам,
то, очевидно, что бактериальные фитазы в большей степени подвержены эволюционной изменчивости. Это значит, что последовательности фитаз родственных бактерий, вероятно, достаточно сильно отличатся друг от друга. Поэтому искать фитазы, гомологичные фитазе Е, coli, следует у близкородственных Е. coli бактерий.
Magnaporthe grisea Tataramyces thermophilus Penicillium oxalicum Aspergillus terreus Aspergillus fumigatus Aspergillus Niger Aspergillus oryzae Emericella nidttlans Myceliophthora thermophila Neurospora crassa Peniophora lycii Agrocybe pediades Trametes pubescens Ceriporia sp.l Ceriporia sp.2
Рис. П-1. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей грибных фитаз. Полоска масштаба отражает замену 1 из 10 аминокислотных остатков.
E.coli-Agp
Yersinia enterocolitica
Yersinia pestis
ExolbAppA
Xanthomonas axonopodis Caulobacter crescentus Pseudomonas syringael Pseudomonas syringae2 Raoultella terrigena Klebsiella pneumoniae
0.1
Рис П-2. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз. Полоска масштаба отражает замену 1 из 10 аминокислотных остатков.
Остальные известные в настоящее время фитазы входят в состав других семейств белков; фитазы бациллярного происхождения входят в состав семейства пирофосфатаз, или щелочных фитаз (ЕС 3.1.3.1). Все бациллярные фитазы имеют очень большую степень идентичности между собой и похожи по биохимическим свойствам. Фитазы из семян растений входят в семейство пурпурных кислых фосфатаз, или 5-фитаз (ЕС 3.1.3.71). Последовательность фитазы из анаэробной бактерии Selenomonas ruminantium вообще не имеет гомологов в ГенБанке, поэтому не входит ни в какое из известных семейств белков. Так или иначе, все фитазы трех последних таксономических классов на данный момент не имеют большого практического значения по причине не достаточно благоприятных технологических характеристик. Перспективны с практической точки зрения представители только одного семейства - кислых гистидиновых фосфатаз. Особенно перспективны бактериальные фитазы, близкие по свойствам к фитазе АррА Е. coli
4. Различные механизмы действия фитаз из разных белковых
семейств
Известно множество генов, кодирующих фитазы, однако не все эти ферменты похожи друг на друга по структуре молекулы и механизму гидролиза фосфатных групп. Поэтому было выделено несколько семейств ферментов, к которым относятся фитазы. Эти семейства представлены семейством кислых гистидиновых фосфатаз, пирофосфотаз (р-пропеллерных фитаз) и пурпурных кислых фосфатаз.
В зависимости от значения рН и содержания в растворе ионов металлов фитат может существовать в свободной форме или в виде металл-фитатного комплекса с двухвалентными катионами кальция и магния [118]. В зависимости от формы, в которой существует фитатг гидролиз фосфатных групп проходит по различным механизмам. Разные классы фитаз характеризируются разными механизмами гидролиза фосфатных групп, общими для всех членов каждого класса.
4.1, Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз
Большинство известных фитаз принадлежат к семейству кислых гистидиновых фосфатаз (ЕС 3.1.3.2) [43]. Все члены этого семейства имеют консервативный мотив RHGXRXP, который содержит аминокислотные остатки активного сайта ферментов.
Среди них только остаток гистидина участвует в нуклеофильной атаке фосфатной группы и формировании промежуточного ковалентного фосфогистидинового комплекса [96]. Вторая часть каталитического центра кислых гистидиновых фосфатаз - это HD консервативный мотив, расположенный в С-концевой части молекулы. Остаток аспарагиновой кислоты из этого мотива служит донором протона для атома кислорода отщепляемой фосфатной группы. Все фитазы этого семейства имеют одинаковый механизм гидролиза фосфатных групп. Реакция гидролиза фосфатных групп при данном механизме реакции возможна, если субстрат находится в свободной от ионов металлов форме, которая существует при кислых значениях рН. При нейтральных и щелочных значениях рН фитат существует в форме комплекса с металлами, который не будет гидролизоваться фитазами семейства кислых гистидиновых фосфатаз. При всем разнообразии фитаз семейства кислых гистидиновых фосфатаз не существует ни одной такой фитазы, которая активна при значениях рН, больших 7.0. Вещества, хелатизирующие металлы, такие как ЭДТА, должны способствовать увеличению активности фитаз этого класса при более высоких значениях рН [118].
Субстратная специфичность ферментов семейства кислых гистидиновых фосфатаз зависит от строения сайта связывания субстрата. Большое значение имеет состав аминокислотных остатков, составляющих этот сайт. Состав этих остатков разный у различных фитаз семейства кислых гистидиновых фосфатаз и проявляется это в разной субстрат специфичности ферментов. В работе [118] среди грибных фитаз выделено две подгруппы ферментов. Ферменты первой подгруппы имели широкую субстратная специфичность, при этом низкую фитазную активность, ферменты второй подгруппы, наоборот, имели узкую субстратная специфичность, но высокую специфичность в отношении фитата. Когда была изучена трехмерная структура фитазы PhyA A. niger [83], то стало возможно определить остатки сайта, связывающего субстрат. Это шесть остатков, окружающие полость активного центра фермента. Как было определено в работе [106] различие между двумя подгруппами фитаз, различающихся по субстрат специфичности, определяется только одним из этих остатков, соответствующих К300 А. niger. Эффективное связывание субстрата объясняется оптимальным распределением заряженных остатков, связывающих отрицательно заряженный фитат. Влияние заряженных остатков субстрат-связывающего сайта на субстратная специфичность продемонстрировано на примере еше одной фитазы, PhyB из A. niger [40]. Эта фитаза имеет гораздо меньшую субстратная специфичность по сравнению с первой фитазой PhyA A. niger. Два остатка субстрат-связывающего сайта у PhyB отличаются от их
аналогов в PhyA. У PhyB они меньше ионизированы и, следовательно, активный сайт у PhyB меньше заряжен, что позволяет ему лучше связывать субстраты широкого спектра. Фитат же связывается с таким сайтом хуже [83]. Фитазы PhyA и PhyB гидролизируют в первую очередь ту фосфатную группу, которая находится в D-3 позиции молекулы фитата. Другие грибные фитазы, исследованные на стереоспецифичность, также являются 3-фитазами. Начиная с этой позиции, фитазы отщепляют последовательно фосфатные группы, оставляя не отщепленной только одну фосфатную группу.
Хотя все фитазы, принадлежащие к семейству кислых гистидиновых фосфатаз, имеют в целом одинаковый механизм действия, но различаются по строению и некоторым особенностям механизма действия фермента. Бактериальные фитазы отличаются по строению и особенностям механизма каталитической реакции от грибных фитаз и образуют отдельную группу гомологичных между собой аминокислотных последовательностей. Группу бактериальных фитаз можно разделить на две подгруппы на основе субстрат специфичности ферментов и строения активного центра. Из каждой подгруппы лучше всего изучены два фермента Е. coli: АррА и Agp. Фитазы подгруппы АррА имеют узкую субстратная специфичность и высокую специфичность по отношению к фитату. Фитазы подгруппы Agp имеют широкую субстратная специфичность и низкую специфичность по отношению к фитату. Вероятно, это различие определяется особенностями строения связывающей части активного центра, аминокислотные остатки которых разные у ферментов из разных подгрупп. Каталитические части сайтов активного центра у ферментов обеих подгрупп имеют одинаковое строение.
Особенностью фитаз бактериальной группы является то, что эти ферменты гидролизуют в первую очередь фосфатную группу, в другой позиции, чем грибные фитазы, а именно в D-6 позиции молекулы фитата. Другие внутриклеточные бактериальные фитазы, исследованные на стереоспецифичность, также являются 6-фитазами. Начиная с этой позиции, бактериальные фитазы отщепляют последовательно фосфатные группы, оставляя не отщепленной только одну фосфатную группу.
Активность ферментов из групп грибных и бактериальных фитаз в разной степени зависит от степени гликозилирования белка. Степень гликозилирования различных фитаз была определена как разница молекулярной массы, полученной с помощью SDS-* PAGE электрофореза, и значения теоретически рассчитанной молекулярной массы [179, 118]. PhyA A. niger дикого типа гликозилирована. При проведении экспрессии phyA в Е. coli продуцируемый рекомбинантный фермент не был гликозилирован и не имел
фитазной активности [131]. В этой же работе белок PhyA A, /tiger дикого типа, продуцируемый грибами A. niger, был очищен и дегликозилирован. У полученного белка также отсутствовала фитазная активность. Следовательно, от гликозилирования зависит активность phyA A. niger. Предположительно гликозилирование как-то затрагивает пространственную структуру фермента A. niger [131]. При экспрессии фитазы PhyA A. niger в дрожжах P. pastoris [63] и 5. cerevisiae [64] рекомбинантный белок был гликозилирован в большей степени, Однако свойства рекомбинантного PhyA существенно не изменились.
Активность представителей групп бактериальных фитаз, наоборот, не зависит от гликозилирования. Эти фитазы активны, как при экспрессии в бактериях, так и в дрожжах. При введении в их молекулу дополнительных сайтов гликозилирования происходит увеличение степени гликозилирования при экспрессии в P. pastoris, что, однако существенно не влияет на активность ферментов, по сравнению с негликозилированным вариантом [139].
4.2. Бациллярные щелочные фитазы
Бациллярные щелочные фитазы принадлежат к семейству пирофосфатаз или щелочных фитаз (ЕС 3.1.3.1), и имеют особенный механизм гидролиза субстрата. Эти фитазы продуцируются различными штаммами Bacillus subtilis [75] и Bacillus amiloliquefaciens [80]. Поиск в базе данных белков не обнаружил ни одного белка, гомологичного этим фитазами как по аминокислотной последовательности, так и по консервативному мотиву фосфатаз. Сами же фитазы имеют друг с другом очень много сходства в строении. Их аминокислотные последовательности идентичны на 90-99%. Для выяснения каталитического механизма этих фитаз был изучена пространственная структура фитазы Bacillus amiloliquefaciens [61, 62] и проведен сайт-направленный мутагенез, затрагивающий остатки активного центра [117]. Трехмерная структура этих молекул имеет строение, напоминающее пропеллер с шестью лопастями, образованными р слоями молекулы [62].
Бациллярные фитазы являются металлозависимыми ферментами. В реакции гидролиза этих ферментов принимают участие ионы кальция. Изучение трехмерной структуры активного центра молекулы показало, что положительно заряженный комплекс Са-фитат окружен отрицательно заряженными остатками активного центра [150]. Фосфатная группа субстрата подвергается нуклеофильной атаке молекулы воды
благодаря воздействию двух ионов кальция, связанных в активном сайте. Каталитический механизм подтверждается результатами сайт-направленно го мутагенеза [117]. Во-первых, замена аланином трех аминокислот Glu211, Glu260, Asp314 из сайта связывания субстрата ведет к полной потере активности фермента [117]. Во-вторых, показано, что ионы фтора способны вытеснить связанный кальцием гидроксид ион в активном центре молекулы [150]. В-третьих, в активном сайте молекулы отсутствуют другие нуклеофильные группы [62]. Подобного рода нуклеофильные атаки связанной с ионом металла молекулы воды или гидроксида очень распространены среди других металлогидролаз [118].
Активный центр бациллярных фитаз имеет два сайта: гидролиза и связывания субстрата. Аминокислотные остатки первого сайта при взаимодействии с ионами кальция участвуют непосредственно в расщеплении субстрата. Остатки второго сайта «афинности» увеличивают сродство связываемого субстрата и фермента. Ионы кальция усиливают связывание, создавая благоприятное электростатическое окружение. Недавно было обнаружено некоторое сходство в последовательностях фитаз бацилл и белков семейства пирофосфатаз, которые по механизму реакции являются металлофосфатазами.
В отличие от кислых гистидиновых фосфатаз, щелочные бациллярные фитазы демонстрируют очень узкую субстратная специфичность и не способны расщеплять никакие другие соединения, кроме фитата. Более того, эти фитазы способны расщеплять фитат только при нейтральных значениях рН среды. Очевидно, в природе не существуют фитазы семейства пирофосфатаз, активные при кислых значениях рН. Однако в отсутствии ионов кальция реакция гидролиза также проходить не будет даже при оптимальных значениях рН. Хелатизирующие кальций агенты, такие как EDTA, ингибируют реакцию. При кислых значениях рН фитат может существовать только в свободной от металлов форме.
Бациллярные фитазы начинают отщеплять фосфатные группы, начиная с D-3 положения фитата, однако расщепление фитазами этой группы проходит всего до третьей фосфатной группы из шести имеющихся [150]..
4.3. Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз
Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз или 5-фитаз (ЕС 3.1.3.72), отличаются от всех предыдущих. Построена трехмерная структура одного из белков этого семейства [60] и предположен вероятный механизм действия этих ферментов.
Ферменты этого семейства известны у растений, грибов и бактерий. Однако многие из них являются фосфатазами и не имеют фитазной активности. Только у некоторых ферментов из семян бобов и кукурузы известна фитазная активность [10, 59, 60, 69, 85]. Лучше всего изучен представитель этого класса фитаз пурпурная кислая фосфатаза GmPhy из бобов Glycine max L. Merr [50]. Эта фитаза имеет общий мотив активного сайта со многими другими белками из семейства пурпурных кислых фосфатаз. Удельная активность этих фитаз очень низкая, это может быть обусловлено тем, что фитаза продуцируется в семенах бобов во время прорастания, а этот процесс требует постепенного, не быстрого высвобождения фосфора в течение нескольких дней. Из-за маленькой удельной активности ферменты этого класса не нашли применения в качестве кормовой добавки.
5. Биохимические свойства фитаз и их промышленно важные
ха рактеристики
Структурное строение фермента и механизм его действия отражаются на свойствах фермента. Биохимические свойства фитаз, описанных в литературе приведены в Табл. П-1 и на Рис. П-2 и П-3.
Таблица П-1. Некоторые биохимические свойства различных фитаз.
-Е. nidulans -М. thermophita -P. a noma la
- В. amybliqucfaciens S. ruminantium -P. syringae
Рис. II-2. Зависимость фитазной активности от рН для различных фитаз.
E. coli Agp
Ш IS SS
A. niger PhyA
Рис. П-3 (начало). Субстратная специфичность различных фитаз. На графиках по оси ординат отложено значение активности. По оси абсцисс цифрами обозначены следующие субстраты. 1 - фитат, 2 - п-нитрофенил фосфат, 3 - фенил фосфат, 4 -фруктозо-1,6-бисфосфат, 5 - фруктозо-6-фосфат, 6 - глюкозо-6-фосфат, 7 - рибозо-5-фосфат, 8 - глицерофосфат, 9 - глюкозо-1-фосфат, 10 - АМФ, 11 - АДФ, 12 - АТФ, 13 -маннозо-6-фосфат, 14-пирофосфат.
A. terreus
A. fumifatus
Рис. П-З (продолжение). Субстратная специфичность различных фитаз. На графиках по оси ординат отложено значение активности. По оси абсцисс цифрами обозначены следующие субстраты: 1 - фитат, 2 - п-нитрофенил фосфат, 3 - фенил фосфат, 4 -фруктозо-1,6-бисфосфат, 5 - фруктозо-6-фосфат, 6 - глюкозо-6-фосфат, 7 - рибозо-5-фосфат, 8 - глицерофосфат, 9 - глюкозо-1-фосфат, 10 - АМФ, 11 - АДФ, 12 - АТФ, 13 -маннозо-6-фосфат, 14 - пирофосфат.
Практически все биохимические свойства фитаз имеют значение для кормопроизводства. Такими свойствами являются: рН оптимум, удельная активность, устойчивость к действию температуры и протеаз, количество отщепляемых фосфатных групп.
Однако некоторые свойства не столь значимы для кормопроизводства. К ним относятся: температурный оптимум фермента, субстратная специфичность, относительная молекулярная масса, степень гликозилирования, Кт, температура денатурации, позиция первой атакуемой фосфатной группы.
Многие важные характеристики фитаз связаны с особенностями их строения механизмом действия фитаз. Например, фитазы бацилл имеют сходные друг с другом аминокислотные последовательности. Пространственная структура молекул фитаз бацилл относится к типу р пропеллерных фитаз, как было показано в предыдущих
Различные механизмы действия фитаз из разных белковых семейств
Большинство известных фитаз принадлежат к семейству кислых гистидиновых фосфатаз (ЕС 3.1.3.2) [43]. Все члены этого семейства имеют консервативный мотив RHGXRXP, который содержит аминокислотные остатки активного сайта ферментов.
Среди них только остаток гистидина участвует в нуклеофильной атаке фосфатной группы и формировании промежуточного ковалентного фосфогистидинового комплекса [96]. Вторая часть каталитического центра кислых гистидиновых фосфатаз - это HD консервативный мотив, расположенный в С-концевой части молекулы. Остаток аспарагиновой кислоты из этого мотива служит донором протона для атома кислорода отщепляемой фосфатной группы. Все фитазы этого семейства имеют одинаковый механизм гидролиза фосфатных групп. Реакция гидролиза фосфатных групп при данном механизме реакции возможна, если субстрат находится в свободной от ионов металлов форме, которая существует при кислых значениях рН. При нейтральных и щелочных значениях рН фитат существует в форме комплекса с металлами, который не будет гидролизоваться фитазами семейства кислых гистидиновых фосфатаз. При всем разнообразии фитаз семейства кислых гистидиновых фосфатаз не существует ни одной такой фитазы, которая активна при значениях рН, больших 7.0. Вещества, хелатизирующие металлы, такие как ЭДТА, должны способствовать увеличению активности фитаз этого класса при более высоких значениях рН [118].
Субстратная специфичность ферментов семейства кислых гистидиновых фосфатаз зависит от строения сайта связывания субстрата. Большое значение имеет состав аминокислотных остатков, составляющих этот сайт. Состав этих остатков разный у различных фитаз семейства кислых гистидиновых фосфатаз и проявляется это в разной субстрат специфичности ферментов. В работе [118] среди грибных фитаз выделено две подгруппы ферментов. Ферменты первой подгруппы имели широкую субстратная специфичность, при этом низкую фитазную активность, ферменты второй подгруппы, наоборот, имели узкую субстратная специфичность, но высокую специфичность в отношении фитата. Когда была изучена трехмерная структура фитазы PhyA A. niger [83], то стало возможно определить остатки сайта, связывающего субстрат. Это шесть остатков, окружающие полость активного центра фермента. Как было определено в работе [106] различие между двумя подгруппами фитаз, различающихся по субстрат специфичности, определяется только одним из этих остатков, соответствующих К300 А. niger. Эффективное связывание субстрата объясняется оптимальным распределением заряженных остатков, связывающих отрицательно заряженный фитат. Влияние заряженных остатков субстрат-связывающего сайта на субстратная специфичность продемонстрировано на примере еше одной фитазы, PhyB из A. niger [40]. Эта фитаза имеет гораздо меньшую субстратная специфичность по сравнению с первой фитазой PhyA A. niger. Два остатка субстрат-связывающего сайта у PhyB отличаются от их аналогов в PhyA. У PhyB они меньше ионизированы и, следовательно, активный сайт у PhyB меньше заряжен, что позволяет ему лучше связывать субстраты широкого спектра. Фитат же связывается с таким сайтом хуже [83]. Фитазы PhyA и PhyB гидролизируют в первую очередь ту фосфатную группу, которая находится в D-3 позиции молекулы фитата. Другие грибные фитазы, исследованные на стереоспецифичность, также являются 3-фитазами. Начиная с этой позиции, фитазы отщепляют последовательно фосфатные группы, оставляя не отщепленной только одну фосфатную группу.
Хотя все фитазы, принадлежащие к семейству кислых гистидиновых фосфатаз, имеют в целом одинаковый механизм действия, но различаются по строению и некоторым особенностям механизма действия фермента. Бактериальные фитазы отличаются по строению и особенностям механизма каталитической реакции от грибных фитаз и образуют отдельную группу гомологичных между собой аминокислотных последовательностей. Группу бактериальных фитаз можно разделить на две подгруппы на основе субстрат специфичности ферментов и строения активного центра. Из каждой подгруппы лучше всего изучены два фермента Е. coli: АррА и Agp. Фитазы подгруппы АррА имеют узкую субстратная специфичность и высокую специфичность по отношению к фитату. Фитазы подгруппы Agp имеют широкую субстратная специфичность и низкую специфичность по отношению к фитату. Вероятно, это различие определяется особенностями строения связывающей части активного центра, аминокислотные остатки которых разные у ферментов из разных подгрупп. Каталитические части сайтов активного центра у ферментов обеих подгрупп имеют одинаковое строение.
Особенностью фитаз бактериальной группы является то, что эти ферменты гидролизуют в первую очередь фосфатную группу, в другой позиции, чем грибные фитазы, а именно в D-6 позиции молекулы фитата. Другие внутриклеточные бактериальные фитазы, исследованные на стереоспецифичность, также являются 6-фитазами. Начиная с этой позиции, бактериальные фитазы отщепляют последовательно фосфатные группы, оставляя не отщепленной только одну фосфатную группу.
Активность ферментов из групп грибных и бактериальных фитаз в разной степени зависит от степени гликозилирования белка. Степень гликозилирования различных фитаз была определена как разница молекулярной массы, полученной с помощью SDS- PAGE электрофореза, и значения теоретически рассчитанной молекулярной массы [179, 118]. PhyA A. niger дикого типа гликозилирована. При проведении экспрессии phyA в Е. coli продуцируемый рекомбинантный фермент не был гликозилирован и не имел фитазной активности [131]. В этой же работе белок PhyA A, /tiger дикого типа, продуцируемый грибами A. niger, был очищен и дегликозилирован. У полученного белка также отсутствовала фитазная активность. Следовательно, от гликозилирования зависит активность phyA A. niger. Предположительно гликозилирование как-то затрагивает пространственную структуру фермента A. niger [131]. При экспрессии фитазы PhyA A. niger в дрожжах P. pastoris [63] и 5. cerevisiae [64] рекомбинантный белок был гликозилирован в большей степени, Однако свойства рекомбинантного PhyA существенно не изменились.
Активность представителей групп бактериальных фитаз, наоборот, не зависит от гликозилирования. Эти фитазы активны, как при экспрессии в бактериях, так и в дрожжах. При введении в их молекулу дополнительных сайтов гликозилирования происходит увеличение степени гликозилирования при экспрессии в P. pastoris, что, однако существенно не влияет на активность ферментов, по сравнению с негликозилированным вариантом [139].
Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность
Колонии трансформантов Е. coli выращивали на чашке в течение суток при 37С. Затем сверху заливали верхний слой с мутной взвесью фитата кальция (ВС-Ф), следующего состава: 1% агарозы, 1% Na фитата и 0.5% СаСЬ, 0.2 М Na ацетат-уксусная кислота рН 5.0. Верхний слой был сначала расплавлен (5 мин при 100С), затем охлажден перед заливкой до 42С. Хотя клетки колоний продуцировали внутриклеточные фитазы, часть клеток разрушалась и внутриклеточные ферменты могли свободно диффундировать в агарозный гель вокруг колонии. Чем больше фитазы выделялось вокруг колонии, тем быстрее появлялась зона просветления в верхнем слое. Если клетки колонии несли мультикопийную плазмиду, содержащую ген фитазы, то зона просветления появлялась уже через 1-6 часов (если ген фитазы на плазмиде отсутствовал, то зона просветления появлялась только через двое суток за счет экспрессии гена аррА хромосомы Е. coli). Таким образом, можно было различить «активные» клоны. Эти клоны извлекали петлей прямо из под верхнего слоя. На одной чашке диаметром 10 см тестировали до 1000 колоний.
Хромосома штамма О. proteus В6893 была частично разрезана эндонуклеазой Mphl43I. Фрагменты ДНК размером около 3-6 кб были вырезаны из агарозного геля после электрофореза и очищены при помощи «DNA extraction Kit» (Fementas). Полученная таким образом смесь фрагментов ДНК была лигирована с ДНК вектора pUC19, разрезанной эндонуклеазой ВатШ, и трансформирована в Е. coli XL1 (Blue). Плазмиды, в которых были фрагменты ДНК, содержащие ген фитазы, были названы pUC-OPl. Трансформанты были тестированы на фитазную активность при помощи верхнего слоя ВС-Ф.
По идентичной схеме были сконструированы геномные библиотеки штаммов О. proteus В6897, С. Jreundii В4090 и Е. cloaceae В2254. Плазмиды, в которых были фрагменты ДНК, кодирующие гены фитазы из хромосомы этих штаммов, были названы pUC-OP2, pUC-CFl, pUC-EC, соответственно. Размер вставки у плазмиды pUC-OPl был минимизирован с использованием эндонуклеазы МрЫ431 также как при конструкции геномной библиотеки, за исключением того, что рестрикции подвергали плазмиду со вставкой 4.2 кб, содержащей ген фитазы. Полученную таким образом ДНК размером фрагментов около 2.0-2.6 кб лигировали с вектором pUC19 разрезанным эндонуклеазой ВатШ и трансформирована в Е. coli ХЫ (Blue). Плазмиды, в которых были фрагменты ДНК, кодирующие активную фитазу, были названы pUC-OPlm.
Для экспрессии в Е, coli была проведена ПЦР-амплификация фрагментов ДНК, соответствующих ORF генов фитаз, следующих штаммов: О, proteus В6798, С. freundii В4090 и Е. coli W3350 с использованием следующих пар праймеров: (PET-OPF, РЕТ-OPR), (PET-CFF, PET-ECF) и (PET-ECF, PET-ECR) соответственно (Табл. Ш-3). В качестве матрицы для ПЦР использовались хромосомные
ДНК из соответствующих штаммов бактерий. Амплифицированные фрагменты ДНК были разрезаны эндонуклеазами Ndel и EcoRJ и лигированы с ДНК вектора рЕТ22Ь+, разрезанной по тем же сайтам. Полученные плазмиды названы рЕТ-ОР, рЕТ- CF и pET-EC соответственно. Эти плазмиды были трансформированы в штамм Е. coli BL21(DE3).
Для экспрессии в P. pastoris была проведена ПЦР амплификация фрагментов ДНК соответствующих кодирующей части ORF генов фитаз, следующих штаммов О. proteus В6798 С. freundii В4090 и Е. coli W3350 с использованием следующих пар праймеров: (PPIC-OPF, PPIC-OPR), (PPIC-CFF, PPIC-ECF) и (PPIC-ECF, PPIC-ECR) соответственно (Табл, ІЇІ-3), В качестве матрицы для ПЦР использовались хромосомные ДНК из соответствующих штаммов бактерий. Амплифицированные фрагменты ДНК были разрезаны эндонуклеазами EcoRI и Notl и лигированы с ДНК вектора рР1С9, разрезанной по тем же сайтам. Полученные плазмиды названы pPIC-OP, pPIC-CF и рР1С-ЕС, соответственно. Эти плазмиды были разрезаны эндонуклеазой Bglll и трансформированы в штамм P. pastoris GS115, согласно протоколу Kit #28662 (Invitxogen).
Экспрессия генов фитаз из С. freundii и Е. coli в P. pastoris была проведена с
использованием последовательности промотора глицеральдегид-3 -фосфат
дегидрогеназы (GAP) из Р: pastoris [177]. Для этого сначала последовательность ДНК промотора была амплифицирована из хромосомы штамма P. pastoris GSH5 с использованием праймеров PGAPF и PGAPR, и клонирована в полилинкер вектора pSP72 по сайтам ВатШ и Bglll. Эта плазмида названа pSP72-GAP. Затем из pSP72-GAP фрагмент ДНК промотора GAP был вырезан с помощью эндонуклеаз BamHl и Bglll и перенесен в сайт BamHl плазмид pPIC-CF и рР1С-ЕС. Полученные плазмиды названы pPIC-GCF и pPIC-GEC соответственно.
Экспрессия гена фитазы аррА из штамма Е. coli W3350 была проведена в дрожжах S. cerevisiae и К. lactis. Для этого кодирующая часть ORF аррА была амплифицирована с использованием праймеров: PSK-ECF PSK-ECF (Табл. Ш-3). В качестве матрицы для ПЦР использовалась хромосомная ДНК из Е. coli W3350. Амплифицированный фрагмент ДНК был разрезан эндонуклеазами ВатШ и Bglll и лигирован с ДНК векторов pScer и pKlac (Табл. Ш-2), разрезанных по сайту BamHl. Полученные плазмиды названы pSCer-ЕС и рК1ас-ЕС, соответственно. 10. Определение N-концевон аминокислотной последовательности белка Образцы для секвенирования концевой части белка были приготовлены следующим образом: Образцы очищенных фитаз нанесли на SDS-PAGE гель, провели электрофорез, затем перенесли белки фитазы из полоски при помощи электроблотинга на мембрану иммубулон-Р. Мембраны были окрашены по методу Брэдфорда [18]. Окрашенную полоску белков вырезали и отмывали от красителя 96% этанолом. Секвенирование проводили с использованием вырезанных полосок иммубулона-Р по Эдману с помощью Applied Biosystems Precise cLC instrument. Положение сигнального пептида было предсказано с использованием программы SignalP [http://wwwcbs.dtu.dk/services/SignalP/] [И 5]. Молекулярная масса последовательностей зрелых белков определена с использованием программы PeptideMass [http://cn.expasy.org/tools/peptide-mass.html]. Поиск гомологичных последовательностей проведен с помощью программы BLAST [http://www.ncbi.nIm.nih.gov/BLAST/] [3]. Множественное выравнивание белковых последовательностей было проведено с помощью ClustalW [http://www.ebi.ac.uk/clustalw/] [160]. Филогенетический анализ гомологичных последовательностей проведен при помощи различных программ (SeqBoot, Protdist, Protpars, Neighbor, Consense), входящих в PHYLYP (Phylogeny Inference Package) version 3.6b [45]. Эволюционное дерево было нарисовано с помощью программы TreeView software version 1.6.6 [http://taxonomy.zoology.gla.za] [123]. Последовательности вторичных структур белков определены при помощи программы SOPHMA [http://npsa-pbil.ibcp.fr]
Создание мутанта с полной делецией в хромосоме гена аррА для отбора гомологичных аррА генов
Последовательности предполагаемых генов, окружающих phyA-Cl, кодируют другие белки: предполагаемый ген, предшествующий phyA-Cl кодирует белок, гомологичный UmuC Е. coli ("SOS mutagenesis and repair protein") с идентичностью около 70%. У Е. coli этот ген расположен далеко от гена фитазы. Часть предполагаемого гена, которая следует за phyA-Cl С. freundii соответствует N-концевой части короткого белка "conserved cytoplasmic protein", имеющегося в геномах многих бактерий. Порядок расположения фитазы phyA-Cl С. freundii и окружающих последовательностей предолагаемых генов, таким образом, является уникальным.
При поиске генов гомологичных phyA-C\ по нуклеотидной последовательности в ГенБанке не было обнаружено ни одного гомолога. Поиск в ГенБанке по аминокислотной последовательности PhyA-Cl обнаружил, что ближайшими гомологами PhyA-Cl в ГенБанке являются последовательности белков и АррА Е. coli (67% идентичности), phyA-Ol (02, ОЗ) О. proteus (47% идентичности) и фитазе из Y. pestis (46% идентичности).
Наиболее вероятное положения сайта отщепления сигнального пептида - А22-Е23 на N-концевой части белка было определено с использованием программы StgnalP. Последовательность предполагаемой N-концевой части зрелого белка С. freundii совпадает с N-концевой части зрелого белка Citrobacter braakii, у которого N-концевая последовательность белка (EEQNGMKLER) была секвенирована в работе [79]. Это косвенно подтверждает правильность предсказанного программой SignalP сайта отщепления сигнального пептида PhyA-Cl.
Фитазу из штамма С. freundii В3638 мы изолировали более простым способом -при помощи PCR - амплификации, с использованием праймеров CitPhyAl-Fl: (прямой: 5 -GGGAATTCGATATGACCATTCAAAATC-3 ) и CitPhyAl-Rl (обратный: 5 -CGAArrCCCTAATTAAGGGAAAGG-3 ) (последовательность сайта EcoRl подчеркнута у обоих праймеров), соответствующих участкам ДНК, внешним по отношению к гену фитазы. Последовательности праймеров были составлены по нуклеотидной последовательности штамма С. freundii В4090, который очень близок к штамму С. freundii В3638. Амплифицированный фрагмент клонировали в EcoRl сайт pUC 19 и секеенировали и содержащуюся в нем ORF гена фитазы назвали phyA-C2. При выравнивании нуклеотидных последовательностей phyA-Cl и PhyA-C2 обнаружена высокая степень идентичности 99.5 %. Последовательности генов отличались всего пятью нуклеотидами и тремя аминокислотами (ввиду вырожденности генетического кода). Замены располагались в несущественных местах, не затрагивающих активный центр.
Таким образом, фитазная активность разных штаммов С. freundii определяется одним геном фитазы, последовательность которого немного варьирует для разных штаммов. Однако последовательность этого гена сильно отличается от других известных генов фитаз, а значит, является геном новой фитазы.
У штаммов Е. cloacae уровень фитазной активности намного ниже, чем у штаммов Е. coli, О. proteus и С. freundii. Для того, чтобы проверить, связано это с низким уровнем экспрессии фитазы Е. cloaceae или низкой субстат-специфичностью фермента к фитату, можно оценить при экспрессии гена этой фитазы в составе мультикопийной плазмиды. Для этого сначала было проведено клонирование гена фитазы из геномной библиотеки Е. cloaceae.
У штамма Е. cloaceae В2256 фитазная активность была измерена количественно при разных значениях рН и оказалась всего около 0.03 ед/мг общего белка. Хромосома этого штамма была использована для создания геномной библиотеки. Фитазная активность была обнаружена у 4 из 10000 клонов геномной библиотеки Е. cloaceae. Зоны просветления у активных клонов были значительно меньше, чем ранее полученные в библиотеках С. freundii и О. proteus. Мы смогли отобрать только небольшое количество клонов, меньше, чем должно быть по расчету частоты гена в данной библиотеке, из-за плохой различимости активных клонов на общем фоне. Эти клоны содержали клонированные фрагменты ДНК хромосомы Е. cloaceae размером от 5.2 до 8.0 кб. Фитазная активность у всех клонов была измерена и оказалась около 1 ед/мг белка. Это значение превышает активность штамма Е. coli ХІД Blue всего в 3-4 раза, В данном случае есть вероятность, что клонированный фрагмент содержит ген не фитазы из Е. cloaceae, а какой-нибудь ген, влияющий на уровень экспрессии фитазы аррА хозяина, увеличивающий продукцию фитазы аррА примерно в три раза. Чтобы проверить, какая из этих версий верна, мы перетрансформировали плазмиды из клонов библиотеки в штамм Е. coli СбООаррА, который не имеет собственного гена фитазы аррА. Во всех трансформантах фитазная активность стала около 1 ед/мг за счет экспрессии содержащихся на плазмиде pPhoA-E4 генов. Поскольку у штамма Е. coli СбООаррА нет своего гена фитазы аррА, то появление фитазной активности не связано с увеличением продукции АррА хозяина. Следовательно, плазмида pPhoA-E4 несет ген фитазы из Е. сіоасеае. Для секвенирования мы выбрали клон, несущий плазмиду pPhoA-E4 с наименьшим размером вставки - 3.3 кб. Секвенс фрагмента депонирован в ГенБанке под номером AJ783768.
Поиск гомологии в ГенБанке с использованием программы BLAST помог обнаружить внутри фрагмента 3.3 кб ORF размером 1.3 кб, имеющую гомологию с геном фосфатазы agp Exoli. Ген, который соответствует этой ORF мы назвали phoA. Идентичность PhoA и Agp очень высокая - 93%. Вообще, в ГенБанке известны ферменты, идентичные в высокой степени PhoA и Agp, и встречаются они у некоторых грамотрицательных бактерий, таких как Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Salmonella enterica.
Фосфатаза Agp E. coli хорошо изучена [27]. Фермент имеет большую специфичность к другим фосфорилированными соединениям, чем к фитату. Мы измерили специфичность фосфатазы PhoA из Е. сіоасеае с использованием нескольких субстратов и сравнили со специфичностью Agp из Е. coli (табл. IV-4, IV-5). Доминирование фосфатазной активности PhoA Е. сіоасеае над фитазной свидельствует о том, что этот фермент является истиной фосфатазой. Для исследования наличия гена phoA у остальных 3 клонов из библиотеки с фитазной активностью мы провели ПЦР анализ по внутреннему участку phoA (праймеры TGACGCAAACCATGCGCGACGTA и CATCTGGCATGCCCTGCGCATA). В результате этого анализа было показано, что все 4 клона несут плазмиды, содержащие ген phoA. Следовательно, в данной геномной библиотеке имеется только один ген фосфатазы, phoA, который и определяет фитазную активность этой бактерии. Таким образом, низкий уровень активности Е. сіоасеае, на порядок меньше, чем уровень активности К coli, О. proteus и С. freundii, связан с отсутствием гена высокоспецифичной фитазы у Е. сіоасеае и определяется неспецифическим действием фосфатазы PhoA
Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки
Наиболее изученным белком из подсемейства «бактериальных кислых гистидиновых фосфатаз» является фитаза аррА Е. соїі. У этого фермента известны все аминокислотные остатки активного центра, участвующие в отщеплении фосфатной группы или связывающие субстрат [96]. На схеме выравнивания (Рис. IV-10) эти остатки у АррА Е. coliy выделены жирным шрифтом. Полностью совпадают у всех последовательностей только 8 из 15 остатков. Практически все 15 остатков совпадают только у последовательностей фитаз О. proteus, С. freundii, S. flexneri, Y. pestis и Y. enterocolitica. У остальных ферментов совпадает 8-12 остатков активного центра. Субстратная специфичность у этих ферментов более широкая, а специфичность к фитату меньше. Больше всего консервативны остатки, участвующие в реакции гидролиза фосфатной группы. Изменения затрагивают остатки, связывающие субстрат. Вероятно, состав остатков активного центра, связывающих субстрат, и определяет специфичность этих ферментов по отношению к фитату или к другим фосфорилированным соединениям.
У последовательностей PhyA-Cl С. freundii и АррА совпадают все 15 остатков активного центра. Значения удельной активности PhyA-Cl и АррА по отношению к фитату самые высокие - 3000 и 1500 ед/мг белка. У последовательностей PhyA-Ol, PhyA-02 О. proteus различается только один остаток активного центра (Glu у PhyA-Ol,2 вместо Ser АррА в 212 положении). Удельная активность PhyA-Ol значительно меньше - около 300 ед/мг белка. Однако сродство PhyA-Ol к фитату значительно выше, чем к другим фосфорилированным соединениям. У более широкоспецифичных фитаз из Р. syringae и К. terrigena значения удельной активности выше - 700 и 400 ед/мг белка. У этих последовательностей в соответствующем Ser212 положении находится именно этот остаток, у них есть различия в трех других остатков активного центра. Вероятно, остаток Ser212 активного центра оказывает большое влияние на значение удельной активности по отношению к фитату.
Наряду с аминокислотными остатками активного центра консервативными являются цистеиновые остатки, на Рис. IV-10 выделены цветом. Из восьми цистеиновых остатков шесть абсолютно консервативны для всех выровненных последовательностей (Рис. IV-10).
У фитазы АррА известно строение пространственной структуры, в которой можно увидеть наличие четырех дисульфидных связей, образуемых восемью остатками цистеина. Две связи Cysl78-Cysl88 и Cys382-Cys390 участвуют в образовании коротких обращенных наружу петель. Оставшиеся 2 связи Cys77-Cysl88 и Cysl33-Cys408 связывают между собой отдаленные участки белка. У последовательностей белков из Е. coli, О. proteus, Y. pestis, S. flexneri и С. freundii все восемь остатков цистеина расположены в идентичных положениях и в других положениях не встречаются. По-видимому, этот факт отражает идентичность расположения дисульфидных связей во всех ферментах этой группы. Это является еще одним аргументом в пользу идентичности и большой схожести пространственных структур данных белков.
У всех остальных гомологичных последовательностей остатки цистеина, соответствующие Cys382-Cys390 и Cys77-Cysl88, расположены в идентичных положениях. Еще два остатка цистеина, соответствующие связи Cysl78-Cysl88, расположены во всех этих последовательностях не строго идентично, но почти в тех же положениях. Оставшиеся остатки, соответствующие связи Cysl33-Cys408, отсутствуют одновременно во всех этих последовательностях. Вероятно, это говорит о наличии по крайней мере трех аналогичных дисульфидных связей во всех ферментах этой группы.
Присутствие в молекулах фитаз дисульфидных связей вносит значительный вклад в стабилизацию их пространственной структуры. Поскольку при низких значениях рН дисульфидные связи не разрушаются, они могут способствовать сохранению пространственной структуре белка и, следовательно, препятствовать денатурации. Так, при очень низких значениях рН (2,0-3.0) внутримолекулярные ионные связи молекул белков разрушаются, и многие растворимые белки денатурируют и выпадают в осадок, в то время как белки фитаз сохраняются в не измененном виде. Высокая кислотоустойчивость фитаз энтеробактерий может оказаться полезна при использовании в кормопроизводстве, поскольку эти фитазы устойчивы к экстремально кислой среде желудка сельскохозяйственных животных.
Анализ аминокислотных последовательностей первичного продукта трансляции генов фитаз позволяет идентифицировать в ее N-концевой части предполагаемые сигнальные пептиды, обеспечивающие транспорт ферментов в периплазму, процессирующихся в ходе секреции. Последовательности сигнальных пептидов, сайты отщепления которых определены экспериментально, выделены курсивом (Рис. IV-10).
Характерно, что, в отличие от зрелых ферментов, секреторные лидеры разных видов практически не имеют сходства последовательностей и различаются даже по числу остатков. Последовательности сигнальных пептидов являются самым вариабельным участком у последовательностей, выравниваемых белков. Тем не менее, они имеют одну общую функцию - доставку фермента в периплазму и могут выполнять свою функцию в клетках другого вида бактерий. В нашей работе в разделе по экспрессии фитаз в Е. coli было показано, что в сигнальный пептид фитазы PhyA-Ol выполнял свою функцию также и в клетках Е. coli.
Данные о расположении N-конца зрелого белков фитаз являются необходимой предпосылкой для разработки гетерологичных систем экспрессии этого фермента, в том числе, в дрожжах, поскольку создание таких систем требует точного сочленения гетерологичного л ядерного пептида со зрелым PhyA-Ol, либо аккуратного удаления всей последовательности лидерного пептида без захвата части зрелого фермента.
Наиболее вероятное положение сайта отщепления сигнального пептида, предсказанное при помощи программы SignalP для PhyA-Ol совпадает с данными полученными в при секвенировании N-концевой части зрелого PhyA-Ol. Для остальных последовательностей фитаз сайты отщепления сигнальных пептидов были рассчитаны только теоритически. Однако при экспрессии в дрожжевых системах при использовании этих теоретических данных мы получили успешную продукцию активных фитаз.
