Введение к работе
Актуальность проблемы. Стресс - одно из важнейших свойств организма, позволяющее сохранять гомеостаз в экстремальных ситуациях. В то же время длительное действие стрессора может привести к истощению организма, необратимым преобразованиям и смерти (Селье, 1979). Поэтому при продолжительном сохранении изменившихся условий пониженная стресс-реактивность, вероятно, является одним из основных критериев приспособленности (Беляев, Бородин, 1982). В этом ключе, представляет особенный интерес эксперимент по доместикации животных, который проводится в Институте цитологии и генетики СО РАН. По мнению Д. К. Беляева, при историческом одомашнивании решающим фактором являлся отбор по поведению по отношению к человеку, который, по-видимому, включал в себя отбор на стресс-реактивность (Науменко, Беляев, 1981).
Показано, что отбор на доместикацию снижает функциональную активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) (Дыгало и др., 1985; Naumenko et al., 1987; Оськина, Плюснина, 2000), являющейся ключевой в развитии стресс-ответа. У серых крыс, селекционируемых на элиминацию и усиление агрессивного поведения по отношению к человеку («ручные» и «агрессивные», соответственно), выявлены различия в динамике стресс-реакции, а также в базальном и стресс-индуцированном уровнях глюкокортикоидов (конечного звена ГГНС) в крови. Установлено, что у ручных крыс уровень глюкокортикоидов в плазме крови ниже, чем у агрессивных (Дыгало и др. 1985; Naumenko et al., 1989; Оськина, Плюснина, 2000). В регуляции стресс-ответа ведущее место занимают рецепторы глюкокортикоидов (ГР) гиппокампа. Они участвуют в отрицательной обратной связи ГГНС, купируя стресс-реакцию (Pfaff et al., 2004). Установлено, что у крыс, селекционируемых на контрастное поведение по отношению к человеку, количество ГР в гиппокампе различно (Оськина, Плюснина, 2000).
Наиболее исследованным путём регуляции ГР у крыс, влияющий на ГГНС, является механизм, связанный с альтернативным сплайсингом мРНК ГР (McCormick et al., 2000). Он описан при неонатальных воздействиях, которые вызывают повышение количества ГР в гиппокампе и снижение активности ГГНС (Meaney et al., 1996). Это наводит на мысль о схожести механизмов изменения стресс-реактивности при отборе по поведению и вследствие неонатальных влияний. Показано, что уровень транскрипции гена ГР под контролем промотора альтернативного экзона I7 повышается в гиппокампе под влиянием раннего опыта (Weaver et al., 2004), что связывают с деметилиро-ванием этого промотора. Если же вводить в мозг крысам, подвергнутым таким воздействиям, метионин, то уровень метилирования ДНК повышается, что вызывает снижение экспрессии гена ГР и усиление активность ГГНС (Weaver et al., 2004). Полагают, что подобный механизм задействован и при пренатальних влияниях (Seckl, Holmes, 2007). С другой стороны, содержание крыс во время беременности на малобелковых диетах влияет на уровень мРНК ГР с экзоном 1ю в печени их потомков (Lillycrop et al., 2007). Транскрипция под контролем промотора этого экзона составляет более 60% от общей транскрипции гена ГР
(McCormick et al., 2000) и регулируется метилированием ДНК (Lillycrop et al., 2007). Однако в пренатальный период развития не было исследовано влияние метионина на экспрессию гена ГР. В то же время известно, что материнская метилобогащённая диета вызывает различные изменения в формировании центральной нервной системы и в профиле метилирования некоторых генов у потомков (Cooney et al., 2002; Van den Veyver, 2002).
Эксперимент по содержанию крыс во время беременности на метилобогащённой диете, проведённый на крысах, селекционируемых на контрастное поведение по отношению к человеку, позволяет оценить влияние метионина в эмбриональный период развития на уровень метилирования промотора гена ГР и экспрессию этого гена во взрослом состоянии. Результаты эксперимента также дают возможность выяснить, являются ли схожими механизмы изменения активности ГТНС при отборе по поведению и перинатальных воздействиях.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение экспрессии гена рецептора глюкокортикоидов у серых крыс, селекционируемых на ручное и агрессивное поведение, и исследование механизмов возможных различий.
Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
Оценить общую экспрессию гена ГР в гиппокампе и периферических органах у ручных и агрессивных крыс.
Исследовать активность периферических звеньев ГГНС и общую экспрессию гена ГР у первого и второго поколений потомков ручных и агрессивных серых крыс, содержавшихся на метилобогащённой диете в период беременности.
Проанализировать профиль метилирования промотора экзона Ь гена ГР и количество мРНК ГР с альтернативным экзоном І7 в гиппокампе у потомков крыс, содержащихся на метилобогащённой диете или стандартном питании во время беременности.
Определить уровень мРНК ГР с альтернативным экзоном 1 ю в гиппокампе у крыс, матери которых содержались на стандартном питании во время беременности, а также у первого и второго поколений потомков животных, получавших в период беременности метилсодержащие добавки. Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе
впервые изучено влияние отбора по поведению на экспрессию гена ГР у крыс. Отбор на ручное поведение повышает количество мРНК ГР в гиппокампе, однако не затрагивает мРНК ГР в печени и селезёнке. Впервые исследовано влияние материнской метилобогащённой диеты на активность ГГНС и экспрессию гена ГР у потомков. Материнская диета у животных из ручной популяции приводит к более позднему возвращению уровня кортикостерона в крови к базальным показателям после рестрикционного стресса и к снижению общего количества мРНК ГР и уровня мРНК ГР с экзоном 1ю в гиппокампе, что свидетельствует об ослаблении отрицательной обратной связи ГТНС. В то же время, достоверных влияний пренатальной диеты на динамику стресс-ответа и экспрессию гена ГР у животных из популяции, селекционируемой на усиление агрессивного поведения по отношению к человеку, выявлено не было.
Обнаружено отличное от описанного ранее метилирование промотора экзона I7 гена ГР крысы в гиппокампе. Выявлено гипометилирование участка ДНК, считавшегося ранее гиперметилированым у крыс. Данная работа расширяет представления о механизмах изменения активности ГГНС при эволюционных преобразованиях животных вследствие отбора по поведению. Кроме того, освещается вопрос о влиянии пренатальной метилобогащённой диеты на экспрессию гена ГР и о зависимости эффектов диеты от генотипа животных. Полученные данные могут иметь значение в исследованиях патологий раннего развития. Результаты исследования используются в качестве материала для курса лекций И. 3. Плюсниной «Нейробологические и нейрофизиологические закономерности поведения», читаемого на 4 курсе ФЕН НГУ. Положения, выносимые на защиту:
Отбор серых крыс на доместикационное поведение повышает уровень экспрессии гена ГР в гиппокампе.
Выявлены различия в эффекте материнской метилобогащённой диеты на экспрессию гена ГР в гиппокампе у потомков крыс, селекционируемых на элиминацию и усиление агрессивно-оборонительной реакции по отношению к человеку, свидетельствующие о роли метилирования ДНК в эффектах отбора по поведению.
Установлен значительный вклад мРНК с экзоном 1ц> в регуляцию экспрессии гена ГР в гиппокампе и активности ГГНС под влиянием пренатальной метилобогащённой диеты.
Выдвинуто предположение, что метилирование промотора экзона 17, на котором основан ранее описанный механизм регуляции экспрессии гена ГР и активности ГГНС, является эктопическим.
Апробация работы. Материалы диссертации обсуждались на XX съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), Международной конференции «Current Evolution Thinking in Biology, Medicine and Sociology International Conference Dedicated to 90 Anniversary of Prof. Dmitry K. Belyaev» (Новосибирск, 2007), IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), международном конгрессе «The 7th International Congress of Neuroendocrinology» (Руан, Франция, 2010) и XXI съезде Физиологического общества им. И. П. Павлова. Также полученные результаты были представлены и обсуждены на отчётной сессии по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Новосибирск, 2009) и отчётной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Уровень кортикостерона в крови животных определялся к.б.н. Оськиной И. Н. Тестирование и отбор по поведению серых крыс проводились к.б.н. Плюсниной И.З.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы. Работа
