Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее опасных и быстрораспрос-
граняющихся в последнее время вирусных заболеваний является инфекция, шзываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция), получившая в разе клинических проявлений название СПИД (синдром приобретенного имму-юдефицита). Со времени появления этого заболевания число заболевших, ю официальным данным на 1994 год, составляло более 3 миллионов чело-іек, а число инфицированных ВИЧ превышало 15 миллионов человек. Этиоло-ический агент СПИД - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к :емейству ретровирусов (подсемейство Lentiviriiiae), был открыт в 1983 оду. Специфической мишенью для этого вируса служат хелаераые Т-тнмфоциты, в которых происходит размножение, вируса. Кроме того, показа-ю, что моноциты и макрофаги также могут быть инфицированы ВИЧ.
Рецептором для ВИЧ на чувствительных к вирусу клетках служит 304-дифференцировочный антиген (CD4 рецептор), с которым взаимодействует юверхностный гликопротеин gpl20 ВИЧ.
Зрелая молекула CD4 рецептора имеет молекулярную массу 55 кД и :остоит из внеклеточного сегмента (372 аминокислоты), представляющего :обой четыре тандемно расположенных иммуноглобулинподобных домена, тра-ісмембранного (23 аминокислоты) и цитоплазматического (38 аминокислот) участков. Кроме того, как большинство мембранных белков, CD4 рецептор шоет лидерный пептид размером в 23 аминокислоты.
Ключевая роль в процессе взаимодействия CD4 рецептора с gpl20 ВИЧ іринадлежнт первым двум иммуноглобулинподобным доменам CD4. Первый им-іуноглобулинподобньїй домен CD4 имеет около 40: гомологии с вариабельными участками легких цепей иммуноглобулинов и аналогичную пространствен-іую структуру.
CD4 рецептор экспрессируется на поверхности хелперных Т-шмфоцитов (50-70% всех циркулирующих лимфоцитов), моноцитов и макрофа-ов. Этот гликопротеин играет важнейшую роль в антигензависимой Т-:леточной активации, участвуя, таким образом, в формировании клеточно-о иммунного ответа. Одним из главных свойств Т-лимфоцитов, экспресси-іуюших CD4 рецептор, является способность взаимодействовать с мишенями, іесущими молекулы II- го класса главного комплекса гистосовместимости. Тредполагается, что молекулы CD4 рецептора, обладая адгезивными свойст-іами, связывают неполиморфный участок антигенов 11-го класса и, таким ібразом, стабилизируют комплекс между этими молекулами, несущими или не іесущими пептидный антиген, и рецептором Т-клетки. До недавнего времени читалось, что Т-клетки, экспрессирующие CD4 рецептор, могут выполнять
в иммунной системе либо хелперную, либо индуцирующую функции, то есть либо проводить сигналы активации к В-лимфоцитам, либо индуцировать Т-лимфоциты, несущие С08-дифференцировочный антиген, для выполнения последними цитотоксической функции. Сейчас функции CD4 рецептора представляются более широкими, так как обнаружены цитотоксические CD4+ клетки, которые могут играть регуляторную роль в иммунной системе. Поскольку, моноклональные антитела на различные участки молекулы CD4 рецептора по разному влияют на все эти функции, можно говорить о том, что CD4 рецептор играет полифункциональную роль в иммунной системе.
Как уже говорилось, молекула CD4 служит рецептором для ВИЧ, и взаимодействие вирусного гликопротеида gpl20 и CD4 является ключевым моментом в патогенезе ВИЧ-инфекции. Высокий аффинитет связывания вирусного белка с CD4 рецептором обусловливает прикрепление и проникновение вирусных частиц в клетку и индуцирует дисфункцию и истощение неинфици-рованных CD4+ Т-лимфоцитов через широкий круг различных механизмов.
Если аминокислотная последовательность и структура самого CD4 рецептора, относящегося к суперсемейству иммуноглобулинподобных белков, известна и достаточно хорошо изучена, то в мировой литературе, до последнего времени, не было никаких данных о нуклеотидной последовательности и структурной организации гена, ответственного за синтез этого белка. Получение такой информации могло бы дать новые сведения об эволюции и механизмах экспрессии гена CD4 рецептора, в частности, и всего суперсемейства иммуноглобулинподобных белков в целом. Исходя из этого, нами были проведены попытки клонирования и изучения структуры гена, ответственного за синтез CD4 рецептора.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования было изучение особенностей структуры и экспрессии гена, ответственного за синтез CD4 рецептора.
Для достижения поставленных целей в ходе работы было необходимо решить следующие задачи:
1. Клонировать участки гена CD4 рецептора и определить нуклео-тидную последовательность клонированых фрагментов этого гена.
2. Провести компьютерный анализ нуклеотидной последовательности и сравнительный анализ с имеющимися последовательностями генов иммуноглобулинподобных белков.
Научная новизна работы. В результате выполнения настоящих исследований получены новые данные имеющие как теоретическое, так и практическое значение.
Получена геномная библиотека ДНК и клонированы участки гена этветственного за синтез CD4 рецептора Т-лимфоцитов человека. Впервые зпределена нуклеотидная последовательность 5'-концевого участка гена 2D4 рецептора, включающего в себя три первых экзона и интрона гена CD4 эецептора, получены данные о структуре этого участка гена.
Идентифицирован новый, ранее не описанный длинный концевой товтор (LTR) эндогенного ретровируса HERV-K. Впервые установлено, что \lu повторяющиеся последовательности могут встраиваться в LTR эндогенных ретровирусов. Показано, что интроны гена CD4 содержат открытые рамки считывания и участки альтернативного сплайсинга для близкородственных белков. Предложена новая вторичная структура Mu-повторяющихся элементов ДНК-
Практическая ценность работы. По материалам диссертации оформ-тяется патент Российской Федерации. Полученные рекомбинантные формы CD4 эецептора могут применяться для аффинной очистки вирусных антигенов *р120 и gpl60 ВИЧ из вирусных лизатов с целью приготовления диагности-іеских тест систем и возможных вакцинных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности
<ДНК CD4 рецептора Т-лимфоцитов человека, конструирование и экспрессия а
E.coli рекомбинантных производных CD4 рецептора.
2. Клонирование участка геномной ДНК Т-лимфоцитов человека (13,1
г. п.н.), включающего в себя 5'-концевой фрагмент гена CD4 рецептора и
определение его нуклеотидной последовательности.
3. Анализ нуклеотидной последовательности клонированного /частка гена С04-рецептора, включающего в себя первый, второй и третий жзоны; первый, второй нитроны и часть третьего интрона этого гена. /становлено, что первые три экзона гена С04-рецептора кодируют нетранс-іируемьій участок мРНК, лидерный пептид и большую часть первого иммуно--лобулинподобного домена С134-рецептора.
-
Анализ структуры экзонов гена С04-рецептора. Обнаружено, іто нуклеотидная последовательность, кодирующая первый иммуноглобулин-юдобный домен CD4-penenTopa, прерывается нитроном, что крайне нехарактерно для белков иммуноглобулинового суперсемейства и дает новые пред-:тавления об эволюции интронов в целом.
-
Анализ структуры интронов гена С04-рецептора. Установлено, 1Т0 нитроны гена С04-рецептора содержат 14 Alu-повторов ДНК в прямой и >братной ориентации, которые могут принимать участие в эволюционных іроцессах и регуляции генов иммуноглобулинподобных рецепторных белков.
В интронах гена С04-рецептора обнаружен новый HERV-K элемент и рамкі считывания для белков с высокой степенью гомологии с белком BCGF і белками DAF и СОМ5 из системы комплемента, с участками альтернативной сплайсинга.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на 3-ей между народной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", май 1995 г. Санкт-Петербург, на внутриинститутской конференции в НИИ вирусных препаратов РАМН, 3 апреля 1996 г., Москва.
Публикация работ. Основные положения диссертации отражены в ( опубликованных научных работах и 5 тезисах конференций, оформляєте] патент РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения обзора литературы, описания материалов и методов, описания результате] и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержи-20 рисунков, 2 таблицы. Библиография включает 194 названия.
