Введение к работе
" Актуальность проблемы. Составной частью различных (іункч,ио -нальннх систем хроматина являются биодинамические процессп, механизмы и действующие компонента которнх нсизі'Єстіш. I) з то Я спл-ои, решение вопроса о ядерной локализации аналогов белков ахто-миозиновоЛ системы, специализированной на шліолнениз различных иехано-химических функций, представляется актуальним как с точки зрения проблемы исче'.суллрио» организации генетических про -цессов, так и яглоний биологической подвижности. Первие спедр-ния об актине- и миозипоподобннх белках піі'г'.і^.сзнчх ядер поя -~;::v.:r,:, г, начало АО-х голод (chnlahi ot.al. ,19^Э!І^бл).В настоящее зремя присутствий в них диалогов лттгп*. убедительно доку-ментировано (Галактионов и др., 1935). Ряд данных позволяет предполагать внутриядерную локализацию и миозиношх компонеп -тов. Так, в препаратах хроматина из различных источников, на -ряду с актиноподобннми белками, выявляются пелипептиди, соответствующие по элоктрофорстическои /3J>/ подвижности и некоторым чертям первичной структуры тяжёлым цепям мышечного миозина /TUM/1 Обогащенные чми экстракта обнзрузшвают свойства актимиозина (Leatourgenon et.al.,1975; Зєггіоз et.al.,1У8б). Далее, из хроматина печени был поделен белок о высокой АТРазноЯ активность» к совпадающий по ^-подвижности б неденатурирузщих условиях с нндечіп.'м миозином. Методой дпумерного елекгрофореза показано присутствие в нём тяжслпх, эмигрирующих с ЇЦМ, и лёгких компонентов (Прияткина и др., 1968) . Однако степень структурно-'(>унк'ч;ональнол гомологии итого белка с миозином, его ззап'/о-связь с ядерним актином, локализация и функции л хроматине остаются неизвестными.
Цель и задача исследования. Цель работы состояла в исследовании локализации шозиноподобных белков /І.1ПБ/ в хроматине па ивдизкдуалышх генах с использование гибридизации ДНИ из фракция, ассоциированиях с НПБ, с кодирующими и фланкирующими участками тріштофаіюксигепагшого /ТО/ и тирозшимшютранофераз-ного /ТАТ/ генов. В работе были использованы плазмиды рТ0(Е-3,3) рТО( К-3,?) , рТОС Н/Р-0,6) , полученшз и любезно предостав -лечкые нам Г.И. Чикиряиной, а также шаэкида, содержания ТАТ-ген, предоставленная доктором Г.Шутцем { SohUt2 G.r ФРГ).
Для выполнения поставленной цели решались следующие седа-
- г -
чи:
Получение и рсстрикциоыгое картирование ДНК рекомбикантных плазмид, содержащих фрагменти ТО- и ТАТ-генов.
Получение отдельных фрагментов рестрикции ТО-- и ТАТ-генов с использованием препаративного электрофореза и элюции иг агарозішх гелей, -^р-мечецие ДНК по концам и в реакции пик-трансляции.
Исследование гибридизузмости ДНК фракций хроматина печени и мозга с кодирующими и фланкирующими участками генов ТО и ТАТ.
Исследование связи миозинолодобных белков о фрагментами хроматина, содержащими кодирующие области экспрессируемых генов, с использованием метода электрофореза ДНІ и гибридизации ДНК в агарозішх гелях с радиоактивными ДНК-зондами.
Определение длины ДНК, содержащей кодирующие области гена ТО, в составе фрагментов хроматина, соэкстрагируемых с МПБ ПФ-о'уфером.
Научная новизна. Впервые показано, что ядерный миозино-подобкый белок является компонентом активного хроматина, прочно свяганним с кодирующими областями экспрессируемых генов. Получена высоко обогащенная фракция фрагментов транск-рипцконно-активного хроматина, в которой кодирующие области представлены протяженными отрезками ДНК (2000-11000 н.п.). Показано, что фрагментн транскрибируемых генов представлены в препаратах хроматина в двух формах, в каждой из которых преобладают Зі-аналоги одного из двух главных компонентов актомиозинового комплекса - актина или миозина.
Научно-практическое значение. Разработанный доступный способ получения фракции хроматина, обогащенной в 20 раз протяженными фрагментами зкспреооируимых генов, в сравкз.шш с 'суммарным хроматином, может быть использован, при клонировании еукариотичєских генов, исследовании различных аспектов структурио-функцисналыюй организации хроматина и механизмов транскрипции.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлена в докладах на научных семинарах лаборатории химии бел-
- З -ка и кафедри биохимии Санкт-Петербургского государственного утавероитета, на Х-м Всесоюзном симпозиуме ''Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990 г.).
Публикации, По теми диссертации спубликоиаш <'t рабглда
й--~Л .ЇРХ!ііХ.г'їі_Р2^0ї11і- Диссертация, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения получениях результатов, ','<:; :бс"~''--,с;п,:т, r.::o?o? " тіис-;;а штіронлни":1. ллтеэатури. ?;~:г>огп .чллл.-о.е.ч '? :>:: стран!' цах машинопис ного тсксі-а, содержит 22 рису^'.а л і тг.б.і::цу, Список литературы включает 167 работ.
МАТЕРІАЛУ '.1 МЕТОДЫ И(Хі.')ЕдОгі»пі'ігі
Работу проводили на ядрах печени- и мозга беспородных белых крыс. Фракции растворимого (ДШт) и нерастворимого (остаточного, ДНЛлт) хроматина получали как описано ранее (При-яткина и др., 1983) с применением ультразвуковой фрагмента-^ ции клеточных ядер в растворе бззионной изотонической сахарозы. Миозиноподобные белки (МПБ) получали из фракции ДШт_. Фрагменты хроматина осаждали из раствора добавлением HgCl2 до 5 м" н'осадок экстрагировали 0,005 " трлс- і:сі -буфером с рН 0.0, содержащим 0.15 '>! NaCl , 0,020 М тетрапиро-фоефат К0 (ПФ) и 0,005 М і%Сі2 (ПФ - буфер), дальнейшую очистку проводили в соответствии с нанес иредлокеннон схемок (Прияткина и др., 1988).
Ллазмидныо ДНК и ДНК фракций хроматина депротсинизиро-зали в стандартных условиях (Маниатис и др., I98'f). Диск-электрофорез белков в системе с додецилсульфатом На проводили по Томас и Корнбергу ( Thooas, Kornberg, 1975); электрофорез ДНК - в горизонтальных 0,8-2,0? агарозных гелях (Маниатис и др., 1984).
В работе были использованы методи оестрикционного кар-
тнрования, Р-мечения ДНЇС в реакции ник-транолячии и по
концам с использованием фрагмента Кленова ДЫ'-полимеразы,
капиллярного переноса ДНК с агарозных гелей на нитроцеллу-
лозные фильтры С з-probs, "Bio-Had" ), блст- и дот-
гибридизации ДНК фракция хроматина с рестриктами генов ТО и ТАТ, радиоавтография и др., которые выполняли в соответствии о руководством (Маниатис и др., 1984).
- Ц -
