Содержание к диссертации
Стр.
Введение 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
I. Общие понятия о структуре хроматина 14
I» Нуклеосомный уровень организации хроматина ..... ,...19
-
Фибриллы нуклеосом 29
-
Супрафибриллярная упаковка хроматина 37
4» Организация супрафибрилл хроматина
в интерфазном ядре 44
5. Упаковка хроматина в метафазных хромосомах 47
II. Негистоновые белки хроматина (НТВ). 52
1« Общая характеристика НЕБ как группы 55
2. НЕБ и процесс транскрипции .59
3« НЕБ, прочно связанные с хроматином ...68
4. Белок А-24 ,. 70
5« Группа белков высокой подвижности
( HMG-- белки) 72
-
Свойства HMS- - белков 74
-
Ткане- и видоспецифичность 79
-
Функция 85
Ш* Структура транскрипционно- активных
участков хроматина 92
I.Использование нуклеаз для изучения
транскрипцинно-активного хроматина 96
2. Недометилирование ДНК и роль отдельных ее
участков в составе активного хроматина 106
** з *
3. Гистон НІ и его роль в организации
активных участков хроматина . *П4
ІУ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 122
-
Получение эритробластической селезенки 122
-
Получение ретикулоцитов 123
-
Выделение мРНК из ретикулоцитов. 123
I. Выделение полисом 124
2» Выделение тотальной РНК 124
3. Хроматография тотальной РНК на колонках
олиго-дТ и "Nttfocctt S » 125
4* Ультрацентрифугирование РНК в линейном
градиенте плотности сахарозы 126
-
Электрофорез РНК в полиакриламидном геле * .126
-
Бесклеточная система синтеза белка из
зародышей пшеницы .. 126
7. Идентификация продуктов трансляции .127
4. Выделение ядер из тканей млекопитающих 128
I. Выделение ядер из яиц плодовой мушки *....... 129
5. Выделение и очистка хроматина из ядер нормальной
и эритробластической селезенки мыши 130
1. фракционирование на легко и прочно
связанные белки хроматина » .ДЗІ
2. Система транскрипции хроматина 131
6. Выделение ДНК 132
-
ДНК из ядер селезенки мыши .... 132
-
Выделение меченной Н ~ тимидином ДНК 133
-
Гибридизация Н3- кДНК глобина мыши с ДНК
клеток эритробластической селезенки 133
7, Обработка ядер нуклеазами 134
8. Фракционирование белков Sj 135
9» Получение индивидуальных фракций
HMS--белков * 136
-
Электрофоретический анализ белков 137
-
Препаративное получение белков
методов электроэлюции ..... . 140
3* Изоэлектрофокусирование белка в пластинах
полиакриламидного геля ..... 141
4, Серебрение белков после электрофореза
и изоэлектрофокусирования . 141
5, Определение аминокислотного состава 142
6. Определение Ш - концевой аминокислоты ..... 143
7, ЕЕ- концевой анализ с последовательным
отщеплением аминокислот 143
8. Определение молекулярной массы
белка 144
9. Исадедование способности образовывать комплексы с
ДНК 145
-
Иодирование белков in Vitro 146
-
Изучение межбелковых взаимодействий 147
-
Нагрузка меченным I125 белком
эритроцитов . .148
10. Радиоавтография клеточных препаратов 149
I. Анализ белка, включившегося в
клетки .149
II* Очистка лимфоцитов человека и
получение из них ядер ......150
-
Сканирование негативов ...... 150
-
Избирательное удаление из ядер
гиотона НІ ...151
I. Экстракция ядер после удаления
гистона НІ .........................151
РЕЗУЛЬТАТЫ И ШСУдаНИВ 153
У» Анализ хроматина нормальной и эритро-
бластической селезенки мыши ........153
I» КГБ нормальной и эритробластической
селезенки мыши 154
2.Транскрипция двух типов хроматина
ІП Vitro ...154
3* Выделение и идентификация глобиновой мРНК
мыши ....ISO
УІ» Анализ белков, высвобождающихся из ядер
при ограниченном их гидролизе нуклеазами .171
1. Анализ белков,высвобождающихся из ядер
под действием микрококковой нуклеазы ...174
2. Сравнение белков, высвобождающихся из ядер
при мягком гидролизе ДНКазой I и микрокок
ковой нуклеазой « ..............179
УП. Характеристика свойств белка P$j 201
1. Выделение и характеристика HMS-1 и 2
белков из селезенки мыши .....201
-
Электрофоре тиче ские свойства Р$ j 205
-
Аминокислотный состав 210
-
Ж - концевая аминокислота 210
-
Молекулярная масса 216
_ 6 -
6« Изоэлектрофокусирование ..... .219
-
Использование серебрения для повышения чувствительности метода изоэлектрофокусирования .......219
-
Взаимодействие с компонентами хроматина 224
9. Кинетика выхода белка Р$у из ядер »231
УІІІ. Микроинъекция белка P$j в
I - клетки мыши 249
IX» Анализ белков, высвободившихся из ядер
клеток разных видов эукариот при огра
ниченном гидролизе нуклеазами .263
I. Содержание белка, сходного с Р!Ц в клетках человека, различающихся по
транскрипционной активности .....273
X. Влияние избирательного удаления гистона HI на экстрагируемость НТВ и гистонов из
ядер 285
I. Изменение экстрагируемости белка
?$т 286
2.-Изменение экстрагируемости гистонов
после обработки ядер ДНКазой I ..290
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 295
ВЫВОДЕ '*.... 301
ЛИТЕРАТУРА 304
- ї -
Введение к работе
Одной из важнейших проблем, исследуемых целым рядом биологических наук - цитологие, биохимией, молекулярной биологией и генетикой, - является проблема дифференциальной экспрессии генетической информации* Этот вопрос включает в себя изучение механизмов и клеточных структур, обеспечивающих безошибочное протекание этого процесса. История исследования этой проблемы насчитывает уже многие десятки лет. За этот период накоплено достаточно большое количество фундаментальных фактов и достигнут существеннейший прогресс в понимании отдельных аспектов сложнейшего процесса регуляции и реализации наследственной информации* В то же время, очевидно, что успешное решение этой проблемы невозможно усилиями какой-либо одной из вышеперечисленных биологических дисциплин* Высокая сложность происходящих в клетке процессов и обеспечивающих эти процессы клеточных структур требует совместного исследования на самых различных уровнях: организменном, клеточном, субклеточном и молекулярном* Использование только какого-либо одного из них без привлечения данных и методов смежных наук сильно снижает возможности исследования и ограничивает интерпретацию получаемых данных*
Усилиями многих исследователей различных специальностей продемонстрировано, что хранение и регуляция экспрессии генетической информации осуществляется в ядре клеток высших организмов, а в реализации ее принимает участие практически весь аппарат клетки* Таким образом, исследование организации ядерных структур и процессов в них происходящих является одной из важнейших проблем, стоящих в настоящее время перед биологией как наукой и ее конкретными выше указанными дисциплинами, в частности*
Актуальность проблемы* Основным компонентом ядер клеток высших организмов является хроматин, состоящий из: носителя генетиче- - * - ской информации ДНК, гистонов, негистоновых белков и небольшого количества РНК. Исследования хроматина на биохимическом уровне были начаты давно, в 1948 г. / Mirsky, Poiiister , 1948 /, а на цитологическом еще раньше - уже в 20-х годах нашего века, когда было продемонстрировано разделение хроматина ядра на две больших фракции: эу- и гетерохроматина / Heitz , 1923 / Однако, необходимо отметить, что основные факты, легшие в основу современных представлений о структуре и функции хроматина, как единого целого, и позволившие в значительной степени понять и переосмыслить целый ряд фактов о структуре и функции отдельных составляющих его компонентов, накопившихся в ранний период его исследований, получены за последние 10 лет.
В 1973-1974 годах рядом исследователей, практически одновременно, были получены цитологические (электронно микроскопические) / Woodcock , 1973; Olins, Olins » 1973 / и биохимические / Hewish, Burgoyne , 1973; Noll » 1974 /данные, прямо указывающие на то, что хроматин в ядре состоит из неки-их регулярно повторяющихся мономерных частиц, организованных в нити. Эти частицы получили название -^тельца / oiins, oiins 1973 / или нуклеосомы / Oudet et ai. > 1974 /
В настоящее время структура этих мономерных частиц достаточно детально изучена. Они состоят из приблизительно 200-парного фрагмента ДНК, накрученного на глобулу, состоящую из октамера т.н. neepR4eBrafflHXw иди "коровых* гистонов (H3-H4)g-(2A-H2B>2* Эти мономеры связаны между собой т.н. межнуклеосомными отрезками ДНК с расположенными на них молекулами гистона HI, и образуют первичную фибриллу хроматина. Сейчас, благодаря усилиям многих исследователей получено много данных, характеризующих свойства и структуру этой первичной фибриллы и позволяющих достаточно четко представить себе ее организацию. - g -
Необходимо отметить существеннейший вклад отечественных исследований В ЭТОЙ Области / Bakayev et al,,1977J Osipova Jet al., Г980; Mirzabekov et al. » 1978 и ИЄЛНЙ рад других работ /. Более того, пионерские работы А.Д.Мирзабекова с сотр. позволили детально расшифровать взаимное расположение отдельных гистонов на ДНК в составе нуклеосомы. Однако, параллельно с этими исследованиями накапливались данные о том, что первичная фибрилла хроматина в составе интерфазного ядра и, тем более, метафаэных хромосом крайне сложно упакована и при функционировании подвергается многочисленным структурным переотройкам. Исследования этих уровней упаковки хроматина в ядре и хромосомах начались относительно недавно, около 5-6-ти лет назад, и к настоящему времени накопилось существенно больше не выясненных и спорных вопросов, чем твердо установленных фактов. Совершенно неясно, каков механизм сворачивания первичной фибриллы; какие компоненты хроматина принимают в нем участие; как они взаимодействуют при этом между собой; и как на уровне столь высоких порядков упаковки осуществляется организация функционально-активных и неактивных участков хроматина. Безусловно, это только часть вопросов, требующих самого пристального исследования в ближайшее время.
Продемонстрированная в ряде работ петельная или доменная организация ТраНСКрипциоННО аКТИВНОГО хроматина ( Igo-Kemenes, Zahau, 1978?Benyajati,Worcel,197 выдвинула,в свою очередь,рад важнейших проблем, которые, несмотря на интенсивные исследования, ведущиеся в этом направлении в последние годы, до сих пор не имеют решения. Одной из важнейших среди них является проблема белкового состава транскрипционно активного хроматина и роли отдельных компонентов этого состава в его организации.
Действительно, если кратко суммировать те факты, которые известны по этому вопросу в настоящий момент, то они оказываются край- -іоне немногочисленными. Известно, что в состав активного хроматина входят ДНК и гистоны (сердцевинные); при этом есть данные о том, что нуклеосомная структура в этих участках сильно изменена. Достаточно достоверно установлено обогащение активного хроматина гипер-ацетилированными формами гистонов и присутствие в нем двух из не-гистоновых белков группы высокой подвижности (НМ6-белков) -HMG 14 и 17. Этими скупыми фактами, собственно, и исчерпываются наши знания о тех компонентах хроматина и их свойствах, которые характерны для его активных участков*
Многочисленными авторами постулировалась роль негистоновых белков в организации транскрипционно активных участков, однако, до сих пор отсутствуют сколько-нибудь достоверные сведения о каких-либо компонентах, претендующих на эту роль. С другой стороны, из общих соображений, очевидно, что если такие белки существуют, т.е. негистоновые белки, принимающие участие в организации транскрипционно активных участков хроматина, то их количество должно быть вполне достаточным для выявления их современными методами исследования, т.к. эти компоненты должны быть общими для множества участков, функционирующих в ядре эукариот. Важность изучения и выявления этих компонентов представляется вполне очевидной.
К одному из интереснейших и неясных вопросов в проблеме структуры транскрипционно активного хроматина относится и роль гистона НІ в организации этих участков. Из всех гистонов хроматина этот компонент, несмотря на интенсивные исследования, остается наиболее загадочным, а его значение в организации тех или иных структур хроматина является предметом для очень широкой дискуссии.
Выявление избирательной чувствительности транскрипционно активного хроматина к ряду нуклеаз (ДНКаза I, микрококковая нуклеа-за и ДНКаза П), и возможность избирательного разрушения этих участков хроматина создает основательные теоретические и методичес- - II -кие предпосылки для исследования проблемы белкового состава транскрипционного хроматина и ряда связанных с ней вопросов» Анализ белков, высвобождаемых при избирательном гидролизе транскрипционно активного хроматина нуклеазами, в принципе, должен быть более эффективным, чем анализ тотальных негистоновых белков хроматина, т.к» сама по себе избирательность предполагает снижение гетерогенности анализируемой фракции. Этот подход и был избран в качестве основного для достижения цели и решения задач, поставленных в данном исследовании.
Цели и задачи исследования. Исходя из изложенных выше проблем, представляющих существенное значение для понимания организации транскрипционно активного хроматина на уровне ядер клеток, основной целью настоящего исследования являлось изучение белкового состава транскрипционно-активного хроматина. Имеющийся к настоящему времени фактический материал, основанный на данных других авторов, и существующий ряд спорных вопросов в этой проблеме предопределили конкретные задачи данной работы: а) проанализировать негис-тоновые белки хроматина ядер по-разному дифференцированных популяций клеток; б) используя в качестве объекта исследования интактные ядра млекопитающих выявить и охарактеризовать негистоновые белки (белок) избирательно высвобождающийся(еся) из ядер при мягком их гидролизе ДНКазой I и микрококковой нуклеазой; в) выделить и охарактеризовать негистоновые белки группы высокой подвижности (НМ6-белки X и 2) из селезенки мыши; г) изучить вопрос о их наличии или отсутствии в составе транскрипционно-активных участков хроматина; д) изучить вопрос участия гистона НІ в организации этих участков и его возможную роль в этом процессе.
Научная новизна и практическая ценность работы. Выделен и охарактеризован новый негистоновый белок хроматина, входящий в состав транскрипционно активных участков. Впервые выделены и очищены - 12, - HMG-I и 2 белки мыши и продемонстрировано их сходство с таковыми других видов эукариот, а также установлено, что эти белки не входят в состав транскрипционно активного хроматина. Показано, что гистон HI либо совсем не содержится в транскрипционно активных участках хроматина, либо содержится в крайне незначительных количествах. Продемонстрировано значение высоких уровней упаковки хроматина в интактных ядрах для поддержания транскрипционно активных участков. Показано, что нарушение этого уровня упаковки приводит к снижению стабильности связывания сердцевинных гистонов этой фракции хроматина. Показано, что удаление гистона HI из ядер также изменяет стабильность связи этих гистонов.
Впервые обоснован и применен новый экспериментальный подход для анализа изменений негистоновых белков в нормальных и патологических клетках человека. Этот подход позволил впервые выявить количественные изменения этого компонента хроматина при наследственной патологии. Впервые в отечественной практике использован метод микроинъекции белка через тени эритроцитов человека. Этот метод может иметь большое практическое значение не только для решения целого ряда экспериментальных задач, но и для лечения целого ряда заболеваний человека, в частности болезней крови. Разработан и внедрен ряд новых методов: использование w р " для выделения мРНК, метод серебрения белков при иэоэлектрофокусировании, а также использование политэтиленгликоля для микроинъекции макромолекул в культуру клеток через тени эритроцитов. Эти методы имеют большое практическое значение для специалистов работающих в области цитологии, биохимии, молекулярной биологии и медицины.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 10 глав собственных результатов и обсуждения, заключения и выводов. Работа содержит Ь&о страниц текста, иллюстрирована 69ри сунками и 12 таблицами. Указатель литературы включает 18 отечественных и 463 работы иностранных авторов. - ІИ -
