Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
I.I.Общие сведения о составе хроматина 9
1.2. Определение и классификация" НГБ 15
1.3.Методы выделения НГБ 18
1.4.Гетерогенность и тканевая специфич
ность НГБ 24
1.5.Локализация и метаболизм НГБ 28
1.6.Модификации НГБ и участие НГБ
. в хромосомном метаболизме 33
1.7.Биологическая роль НГБ 39
1.8.Белки, активирующие транскрипцию
. хроматина 46
1.9.Белки, ингибирующие транскрипцию ДНК... 49
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
2.1.Характеристика используемого материала. 53
2.2.Выделение хроматина растений 54
2.2.1 .Проращивание семян'. 54
2.2.2.Выделение хроматина 54
2.2.3.Выделение хроматина из ядер ячменя 55
2.3.Выделение негистоновых белков
хроматина растений 56
2.3.1.Диссоциация хроматина и
удаление ДНК 56
2.3.2.Разделение суммарных белков
хроматина на гистоны и НГБ 57
2.3.3.Концентрирование.и хранение
препаратов НГБ 59
2.4.Выделение ДНК и определение физико-
химических характеристик 60
2.4.1.Фрагментирование ДНК 61
2.4.2.Определение молекулярной массы
фрагментов ДНК ультрацентрифугиро-
. . ванием в сахарозном градиенте 62
2.5.Фракционирование ДНК 63
2.6.Приготовление ДНК-целлюлозных колонок... 65
2.7.Аффинная хроматография на ДНК-целлюлозе 66
2.8.Электрофорез НГБ в полиакриламидном геле
в присутствии ДДС-Na 67
2.9.Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, входящих в
состав НГБ 68
2.9.1.Определение активности протеоли
тических ферментов 68
2.9.2.Определение ингибиторов трипсин-
подобных ферментов 69
2.10.Аналитические методы 70
2.10.1.Химический анализ хроматина 70
2.10.2.Определение концентрации белка... 71
2.10.3.Определение концентрации ДНК 72
2.10.4.Определение концентрации РНК 73
2.11.Мечение негистоновых белков
хроматина (1251) 77
ГЛАВА III. ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫДЕЛЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ 78
3.1.Характеристика препаратов хроматина 78
3.2.Характеристика препаратов ДНК 83
3.3.Характеристика препаратов НГБ 86
ГЛАВА ІУ. БИОЛОГИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ НГБ
ХРОМАТИНА ЯЧМЕНЯ 97
4.1.Межвидовая специфичность НГБ хроматина
высших растений 97
4.2.Внутривидовая специфичность НГБ
хроматина ячменя 100
4.3.Онтогенетическая специфичность НГБ
хроматина ячменя 105
4.4.Специфичность ядерной протеиназы,
входящей в состав НГБ хроматина ячменя.. НО
4.5.Внутригеномная специфичность НГБ
хроматина ячменя 125
4.5.1.Выбор матрицы 126
4.5.2.Иммобилизация ДНК 127
4,5.3.Выбор условий элюирования 132
4.5.4.ДНК-целлюлозная хроматография 137
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 159
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ 167
ЛИТЕРАТУРА 169
Введение к работе
Открытие генетической роли ДНК, механизмов кодирования и синтеза белков, а также молекулярных механизмов основных генетических процессов позволило исследовать на молекулярно-генетическом и биохимическом уровнях те процессы, которые считались объектом чисто генетического изучения.
Разработки в этом разделе естествознания имеют большое теоретическое и прикладное значение для дальнейшего развития сельского хозяйства, медицины, ряда отраслей промышленности. Поэтому ЦК КПСС и Совет Министров СССР 19 апреля 1974 года принял постановление № 304 "О мерах по ускоренному развитию молекулярной биологии и молекулярной генетики и использованию их достижений в народном хозяйстве".
Конкретные задания определены в решениях ХХУІ съезда КПСС и майского ( 1982 г ) Пленума ЦК КПСС, где было указано: "...сосредоточить усилия на выведении высокопродуктивных сортов растений, познании механизма физиологических, биохимических, генетических и иммунологических процессов".
В свете этих решений особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение специфичности геномов и механизмов регуляции генного выражения.
В формировании биологической специфичности организма значительная роль принадлежит хромосомным белкам, которые участвуют в контроле генной активности, обеспечивают выражение генетической информации и поддерживают структуру ДНК.
Негистоновые белки хромосом представляют весьма гетерогенную группу, включающую ферменты и белки, прочно связанные с ДНК. Некоторые из них видо- и органоспецифичны. Высокая ге- терогенность негистоновых белков, быстрое обновление и варьирование в разных тканях позволяют судить о важной роли этой группы белков в регуляционных процессах, обусловливающих биологическую специфичность.
В последние годы появился ряд работ, посвященных изучению негистоновых белков хроматина животных. Исследованы состав, структура и функции этой группы белков. Показано, что негистоновые белки выполняют важную роль в поддержании структуры хромосом, участвуют в метаболизме основных компонентов хроматина, являются регуляторами транскрипции ( Уманский, 1976; Ельцина, 1979; Гершун, 1980; Караванов, Афанасьев, 1983).
В то же время негистоновые белки хромосом растений изучены значительно слабее, что связано со специфическими особенностями растительных клеток. Эта информация недостаточна для познания структурной организации генома растений, природы регуляторних процессов, проявления видо- и органоспеци-фичности растительного организма. Исследование этих процессов позволит глубже понять сущность обширного спектра жизненных процессов, таких как рост, развитие, дифференциация, поддержание клеточного фенотипа и т.д.
Изучение особенностей механизмов регуляции выражения генов будет способствовать созданию основ рационального влияния на процессы жизнедеятельности, откроет новые возможности для дальнейшего совершенствования теоретических основ селекции растений.
Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы методами электрофореза, гель- и аффинной хроматографии и др. произвести изучение компонентного состава и специфичности негистоно-
7 вых белков хроматина ячменя.
Для выполнения данной pi боты были поставлены следующие задачи:
I.Усовершенствовать методы выделения негистоновых белков хроматина, применительно к высшим растениям, в частности к ячменю (Hordeum vulgare ).
2.Изучить компонентный состав^ видовую,, внутривидовую и онтогенетическую специфичность негистоновых белков хроматина ячменя.
3.Выяснить специфичность функционирования отдельных представителей класса негистоновых белков хроматина ячменя на примере ядерных протеиназ и их ингибиторов.
4.Изучить специфичность взаимодействия негистоновых белков хроматина ячменя с различными кинетическими фракциями генома.
В результате проведенных исследований показана определённая межвидовая, внутривидовая и онтогенетическая специфичность негистоновых белков хроматина ячменя. Использованные методы позволили выделить и охарактеризовать входящую в состав негистоновых белков протеиназу и сопутствующий -её белковый ингибитор. Обнаружена и охарактеризована внутриге-номная специфичность негистоновых белков.
Исследование негистоновых белков позволило получить существенную информацию об этих белках хроматина ячменя. Изучение компонентного состава негистоновых бегчов и анализ ДНКїбелкового взаимодействия способствовали установлению специфичности организации генома ячменя, что является важным моментом характеристики видов.
Вышеизложенные положения диссертации выносятся на защиту.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Всесоюзного селекционно-генетического института под руководством кандидата сельскохозяйственных наук, старшего научного сотрудника Ю.М.Сиволапа.
Материалы диссертационной работы являются частью тематического плана научных исследований лаборатории.
Основные материалы диссертации доложены и обсувдены на III съезде ВОГиС С Ленинград, 1977), Республиканской конференции молодых учёных ( Одесса, 1977), Межрегиональной конференции Белорусии и Украины "Нуклеиновые кислоты и хроматин растений" С Черновцы, 1978), ІУ Всесоюзном биохимическом съезде С Ленинград, 1979), II Всесоюзном симпозиуме по химии протеолитических ферментов ( Углич, 1979), ІУ съезде ВОГиС ( Кишинев, 1982), I республиканской конференции молодых генетиков и селекционеров Белорусии С Минск, 1982), Республиканском симпозиуме "Ядерные белки и экспрессия генома" ( Канев, 1983), научной конференции "Геном растений" ( Черновцы, 1983).
