Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
Введение 6
Обзор литературы 9
Глава 1. Уровни ком пакти зац и и хроматина 9
-
Гистоновые белки, первичный уровень укладки хроматина 9
-
Нуклеосомные фибриллы 11
-
Пстельно-доменный уровень компактизации хроматина 13
-
Негистоновые белки хроматина 16
Глава 2. Регуляция структуры хроматина и ее влияние на
экспрессию генов 18
2.1 Факторы, регулирующие структуру хроматина 18
-
ЛТФ-зависимые ремоделирующие комплексы 19
-
Сравнение ремоделирующих комплексов по способности ремоделировать хроматин.20
2.1.3. Механизм ремоделирования хроматина .22
2.2 Реіуляция структуры хроматина белком Rb 24
-
pRb и деацетилазы гистонов 25
-
pRb и ремоделирующие комплексы SWI/SNF 28
-
Взаимодействие между ферментами модификации гистонов и АТФ-зависимыми комплексами, ремоделиующими нуклеосомы 30
-
Роль отдельных pRb содержащих репрессорных комплексов на разных фазах клеточного цикла , 33
-
pRb и другие корепрессорьт 34
Глава 3. Модели и механизмы клеточного старения 35
-
Репликативное старение, модель Хайфлика (Hayflick's model) 36
-
Регуляция клеточного цикла и теломерные последовательности 37
-
Дисфункция тсломер и индуция клеточного старения 38
-
Репликативное старение как ответ на стресс при культивировании..,,40
-
Дополнительные пути клеточного старения 41
Глава 4. Регуляция процессов старения: роль ядерных телец
PML 42
-
Роль белка PML в процессе старения 47
-
PML каксупрессор канцерогенеза 50
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 53
Культивирование клеток U20S и\138 53
Инфекция клеток WI38 ретровирусами. Селекция инфицированных
клеток с помощью антибиотиков пуромицина и G418 (неомицина) 53
Оценку динамики роста клеток в культуре 53
Кратковременная гиперэкспрессия белков в культуре зукариотических
клеток 54
Синхронизацию культуры клеток WI38 54
Получение поликлональных антител к белку ASFla 54
Сочетаиную реакцию транскрипции-трансляции in vitro .* 54
Иммунопреципитация 54
Кратковременная гиперэкспрессия белков в культуре эукариотических
клеток 55
Иммуноблотинг 55
Дрожжеван двухгибриднан система 55
Цитоиммунофлуоресцентный анализ 55
Анализ клеточного цикла 55
ПЦРи направленный мутагенез 56
Получение полноразмерной копни гена ASFla 58
Анализ структуры комплекса белка ASFla с пептидом 59
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 60
Белок HIRA взаимодействует с белком ASFla 60
Во взаимодействии белков HIRA и ASFla принимают участие как
электростатические, так и гидрофобные взаимодействия 62
Формирование островков гетерохроматина связано с изменением ядерной
локализации белков HIRA 68
ASFla имеет внутриядерное распределение, тип которого меняется в
зависимости от фазы клеточного цикла 73
HIRA и ASFla могут индуцировать формирование ОГ 80
Для индукции образования ОГ необходимо взаимодействие между H1RA и
ASFla 81
Обсуждение 83
HIRA и ASFla определяют частоту и необходимость формирования ОГ...83
ЯтРМЬ, HIRA, ASFla и супрессия туморогенеза 84
ВЫВОДЫ 86
БЛАГОДАРНОСТИ 88
Список использованной литературы 89
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
А.а.-аминокислота
БСА - бычий сывороточный альбумин ДТТ - дитиотреитол ДНК - дечокси рибонуклеиновая кислота ДМСО - диметил сульфоксид РНК - рибонуклеиновая кислота кшРНК - короткая шпилечная РНК РНКи - малая интерферирующая РНК ПЦР - полимеразная цепная реакция П.о.- пар оснований УД-удвоение популяции Ят- Ядерные тельца ФБС - фетальная бычья сыворотка ОГ-Островки гетерохроматина УП- Удвоение Популяции
Введение к работе
Старение - это необратимое прекращение пролиферации клеток при достижении определенного числа удвоений популяции (числа Хайфлика), контролируемое уровнями экспрессии специфических генов. Выяснение природы этих генов не только необходимо для понимания молекулярных основ жизнедеятельности, но и является принципиальным для создания стратегии подавления неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток.
Недавно проведенные исследования (Narita et al, 2003) показали, что в стареющих клетках гены, ответственные за пролиферацию, кластеризованы в районе гетерохроматина, получившем название островков гстерохроматина (ОГ). Как известно, гетерохроматип представляет собой транскрипционно неактивный хроматин, и включение генов в подобный хроматин обуславливает стабильную репрессию их транскрипции. Различают конститутивный и факультативный типы гетерохроматина. Конститутивный гетерохроматип находится в конденсированном состоянии на протяжении всего клеточного цикла и располагается в участках ДНК, содержащих многочисленные повторы, таких как перицентромерный район хромосом. Обычно такое состояние хроматина характеризуется гипоацетилированисм гистонов, метилированием гистона 113 по остатку Lys9 и связыванием белка 1 гетерохроматина (НР1) (Maison at al, 2004). Факультативный гетерохроматип является индуцибельным и наиболее часто присутствует в одной из Х-хромосом женщин, удерживаемой в состоянии транскрипционного покоя в процессе эмбриогенеза (способ инактивации Х-хромосомы).
Показано, что гетерохроматин островков относится к факультативному типу, поскольку его образование индуцируется в стареющих клетках. Известно, что в инициацию процесса клеточного старения вовлечены два сигнальных пути, один из которых (так называемый ретинобластомный, или pRB-нуть) вкшочает подавление экспрессии генов, необходимых для прохождения клеточного цикла, в частности, таких как циклин А. За исключением общих маркеров гетерохроматина, к которым относятся Ьуз9-метилированный гистон НЗ и белок НР1, молекулярные компоненты ОГ недостаточно охарактеризованы. Кроме того, на сегодняшний день мы не знаем совокупности факторов, способствующих формированию ОГ, и их роли в процессе старения.
Дрожжевые белки Ніг 1 р, НІг2р, ASF I р и их эволюционно консервативные ортологи способствуют сборке хроматина in vitro и были выделены из клеточных лизатов в виде комплекса, содержащего новосинтезироваипые гистоиы. В литературе описано участие этих белков в процессе формирования гетерохроматина, в том числе на тсломерных и цептромерных участках хромосом (Krawitz et al, 2002; Tagamiel al, 2004). Белки Hirlp, Hir2p и ASFlp взаимодействуют между собой, и это взаимодействие является основополагающим в процессе образования гетерохроматина теломер (Sharp et al, 2001). Известно также, что эти белки являются репрессорами генов гистонов, экспрессируемых во время S-фазы клеточного цикла (Nelson et al, 2002). В совокупности эти данные свидетельствуют об участии белков Hirlp, Hir2p и ASFlp в формировании структуры транскрипционно неактивного гетерохроматина через процессы сборки и/или компактизации, а также путем репрессии, ответственных за пролиферацию клетки.
В клетках человека к настоящему времени обнаружена единственная изоформа белка HTRA, который содержит последовательности, гомологичные дрожжевым белкам Hirlp и Hir2p, и два ортолога белка ASF1 - ASFla и ASFlb (Lorain et al, 1996; Sillje et al, 2001). Однако до сих пор остается открытым вопрос, взаимодействуют ли человеческие белки семейства ASF1 с HIRA? Цель исследования: Выяснить, взаимодейсівуют белки человека из семейства ASF1 с белком HIRA, по аналогии с процессами, выявленными у дрожжей, и в случае положительного ответа изучить структурные основы взаимодействия белков HIRA и ASFla и их участие в изменении состояния хроматина в процессе старения фибробластоа человека. Задачи исследования:
Установить, способны ли белки ASF1 и HIRA человека к взаимодействию in vtlro и in vivo.
В случае подтверждения этой гипотезы, проанализировать участки связывания белков HIRA и ASFla.
Выявить варианты распределения HIRA и ASFla в культивируемых фибробластах человека в зависимости от фазы клеточного цикла и возраста клеточной популяции.
Изучить влияние белков HIRA и ASFla и их взаимодействия на формирование ОГ - один из важнейших этапов старения.
