Введение к работе
Актуальность проблемы. Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) является одним из главных иммуноцитохимических маркеров астроцитов - важнейшего представителя макроглии в центральной нервной системе млекопитающих. В качестве маркера астроцитов он широко применяется в диагностических целях и в экспериментальных работах при исследовании функций нервной системы в норме и при патологии [Калиниченко С.Г. и др., 2004; Zhu, Dahlstrom, 2007; Paulus, 2009]. Постоянно возрастающее число работ, посвященных астроцитам, связано с многообразием функций, которые, как установлено за последние два десятилетия, выполняют в центральной нервной системе эти клетки.
Одной из ключевых и наиболее исследуемых функций астроцитов является их участие в организации и регуляции проницаемости барьерной системы мозга (гематоэнцефалического и ликвороэнцефалического барьеров) [Abbott, 2002; Engelhardt, Sorokin, 2009; Li et al., 2010]. Известно, что именно накопление GFAP связано с обеспечением астроцитами барьерных функций [Pekny, 2001; Ribotta et al, 2004]. Среди анатомических зон локализации барьеров головного мозга наружная поверхность занимает особое место. Во всех областях большого мозга она образована I слоем коры, который формируется раньше других кортикальных слоев [Федосихина Л.А., 1984; Хожай Л.И., Отеллин В.А., 1999; Bystron et al, 2008] и играет ключевую роль в становлении характерной цитоархитектоники всего неокортекса [Marin-Padilla, 1992]. Кроме того, этот слой служит коллектором афферентных волокон кортикального и экстракортикального происхождения [Marin-Padilla, 1990; Отеллин В.А., Коржевский Д.Э., 2002]. Важнейшим элементом первого слоя коры, обеспечивающим поддержание целостности ликвороэнцефалического барьера (ЛЭБ), является поверхностная глиальная пограничная мембрана (ПГПМ), организация которой у различных животных и человека в разных областях неокортекса остается не до конца выясненной.
Немаловажной проблемой, которая имеет отношение к оценке морфологических изменений астроцитов при реакции на повреждающие воздействия, является проблема правильной классификации их особых форм, обнаруживаемых в головном мозге различных животных и человека [Colombo, Reisin, 2004; Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П., 2004; Oberheim et
al., 2006]. Эти клетки не всегда могут быть однозначно определены как протоплазматические или фиброзные (волокнистые), выделяемые современной гистологической номенклатурой [Банин В.В., Быков В.Л., 2009]. Без четкой классификации форм астроцитов, наблюдаемых в норме, и отсутствии знаний о том, в какой мере они сопоставимы у животных и человека, существенно снижается диагностическая ценность показателей, связанных с учетом морфологии астроцитов в клинико-патологических и экспериментальных исследованиях.
До недавнего времени предполагалось, что морфологические характеристики астроцитов у человека и лабораторных животных не имеют существенных различий. Однако отдельные исследования [Colombo et al., 2000; Oberheim et al., 2009] свидетельствуют о наличии видовых особенностей структурной организации астроцитов коры у грызунов и приматов. Кроме того, остаются неизученными и региональные особенности астроцитов. Принимая во внимание противоречивые данные о строении астроцитов неокортекса млекопитающих, представляется актуальным проведение сравнительного исследования структурной и цитохимической организации астроцитов человека и крыс, наиболее часто используемых в экспериментальных исследованиях, связанных с моделированием заболеваний и повреждений головного мозга, характерных для человека.
Цель и задачи исследования
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение структурной и цитохимической организации GFAP-иммунопозитивных астроцитов коры головного мозга крысы и человека.
В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
Разработать унифицированный протокол выявления астроцитов, позволяющий получать сопоставимые результаты при постановке реакции на срезах головного мозга крысы и человека, а также проводить трехмерную реконструкцию.
Исследовать распределение и структурную организацию GFAP-иммунопозитивных астроцитов в коре головного мозга крысы.
Исследовать распределение и структурную организацию GFAP-иммунопозитивных астроцитов в коре головного мозга человека.
4. Провести сравнительный анализ особенностей структурной и
цитохимической организации астроцитов коры головного мозга у крысы и у
человека.
5. Изучить изменения структурной организации астроцитов неокортекса
при механической травме головного мозга у человека.
Научная новизна. Впервые проведено систематическое
иммуноцитохимическое исследование астроцитов, содержащих GFAP, у крысы и человека. Показано, что не все клетки с морфологическими и цитохимическими признаками астроцитов содержат GFAP в концентрациях, обеспечивающих его иммуноцитохимическое определение. В работе выделены и охарактеризованы неизвестные ранее формы GFAP-иммунопозитивных астроцитов коры головного мозга крысы и человека, установлены сходство и различия в их структурной и цитохимической организации. Установлена возрастная зависимость накопления GFAP в астроцитах средних слоев неокортекса человека. Благодаря применению конфокальной лазерной микроскопии и возможности создания трехмерных реконструкций, установлен факт локализации амилоидных телец внутри отростков астроцитов. Показано, что у человека в условиях повреждения головного мозга наблюдается активация астроцитов, содержащих GFAP, как в области барьеров мозга, так и локально, в поврежденных участках неокортекса. Детально описаны преобразования астроцитов при механической травме головного мозга человека.
Теоретическое и практическое значение исследования. Настоящая работа
относится к числу фундаментальных исследований в области гистологии и
нейроморфологии. Полученные данные о сходстве и различиях структурной
организации гемато- и ликвороэнцефалического барьеров коры большого мозга
человека и крысы позволят оценить адекватность экспериментального
моделирования патологических состояний, связанных с повреждением
барьерной системы головного мозга. Данные о возрастных изменениях
астроцитов коры головного мозга человека могут быть использованы при
создании новых экспериментальных моделей хронических
нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, результаты исследования могут служить основой для разработки новых подходов, применяемых в судебно-медицинской диагностике повреждений головного мозга. Разработанный в
рамках настоящего исследования протокол выявления GFAP-иммунопозитивных астроцитов рекомендован для использования в диагностических целях (методическое пособие: «Особенности судебно-гистологического исследования головного мозга при смерти от тупой травмы головы», СПбМАПО, 2011). Основные положения, выносимые на защиту
У крысы GFAP определяется в астроцитах различных слоев коры, наиболее интенсивная реакция на этот белок промежуточных филаментов проявляется в астроцитах поверхностной части I слоя и субкортикального белого вещества. Для неокортекса крысы характерны следующие морфологические типы астроцитов: уплощенные астроциты, расположенные на поверхности коры, формирующие поверхностную глиальную пограничную мембрану, вариантом которых являются полигональные астроциты поверхностной части первого слоя базальной области коры; типичные звездчатые астроциты; веретеновидные астроциты субкортикального белого вещества.
У человека GFAP определяется в астроцитах различных слоев коры, наиболее интенсивная реакция на этот белок промежуточных филаментов проявляется в астроцитах I и VI слоев и субкортикального белого вещества. Для неокортекса человека характерны следующие морфологические типы астроцитов: два морфологических типа астроцитов I слоя (астроциты, формирующие своими отростками ПГПМ и трансламинарные астроциты), типичные протоплазматические астроциты, инвертированные трансламинарные астроциты VI слоя с длинными неветвящимися отростками, типичные фиброзные астроциты субкортикального белого вещества. С возрастом у человека наблюдается повышение иммунореактивности астроцитов III-V слоев коры.
Во всех исследованных областях неокортекса у крысы ПГПМ сформирована телами астроцитов, лежащих в один или несколько слоев, в части которых в области основания мозга имеется ассоциация GFAP с виментином. У человека ПГПМ образована сплетением тонких отростков астроцитов, тела которых лежат в глубоких отделах I слоя.
Структурная организация астроцитов при травме головного мозга существенно изменяется, в составе белков промежуточных филаментов
астроцитов появляется нестин. Количество GFAP-иммунореактивных астроцитов увеличивается, изменяется их распределение в слоях коры, наблюдается скопление измененных астроцитов на границе повреждения и отграничение ими травматического очага.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (14 мая 2009г., Санкт-Петербург), III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2009» (2-4 декабря 2009 г., Санкт-Петербург), VI Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (5-15 июня 2010г., Судак, Украина), Петербургском научном обществе судебных медиков (636-е пленарное заседание, 20 октября 2010г., Санкт-Петербург), VIII Всероссийской конференции по патологии клетки (11-12 ноября 2010 г., Москва). Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК и 5 работ в сборниках трудов научно-практических конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 стр. машинописного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 5 таблицами.
