Введение к работе
Актуальность проблемы. Белки, сгаггезированные на рибосомах1 гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭР), проходят длинный путь,1 прежде чем достигнут плазматической мембраны или других органелл. Эта система различных внутриклеточных компартментов, ориентирующая' транспорт белков в антероградном направлении, определяется как секреторный" или экзоцитозный путь (Миронов А.А. и др. 1998; Банин В.В. 1999). Если ЭР исполняет роль места синтеза белков и липидов, то комплекс (или аппарат) Гольджи (КГ) является местом их посттрансляционной модификации, сортировки и последующей рассылки по различным направлениям. Регуляция и механизмы транспорта на этом участке чрезвычайно сложны и являются предметом активного изучения и горячих научных споров среди ученых ведущих лабораторий, работающих в области клеточной и молекулярной биологии
В течение многих лет дискутировались, в основном, две гипотезы или модели транспорта внутри комплекса Гольджи (Mironov A et al. 2005):' везикулярная гипотеза, предполагающая, что секретируемые и мембранные белки транспортируется между стабильно существующими цистернами в везикулах, и модель прогрессии и созревания самих цистерн в сочетании с ретроградным транспортом ферментов комплекса Гольджи зикулами В" последние годы серьезно обсуждаются еще две гипотезы—модель, основанная на непрерывности соединений между цистернами КГ, и модель созревания и прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемый белок.
Везикулярная модель, предложенная Дж. Паладе (Farquhar MG. and Palade G.E., 1981) почти 30 лет назад, предполагает концентрацию' транспортируемых белков (карго) в покрытых, окаймленных почках (бадах),' формирующихся на проксимальном (вышележащем) компартменте. Шейка бада схпопывется, и сформированная таким образом везикула, отщепляется,
теряет свое белковое покрытие и переносит транспортируемые белки в следующую цистерну, сливаясь с ней. Везикулярная модель долгое время представлялась простой, красивой и подтвержденной фактическими данными. Она излагается во многих учебниках и руководствах на правах уже не гипотезы, а доказанной теории. Тем не менее, с точки зрения везикулярной модели сложно объяснить отсутствие в везикулах многих известных транспортируемых молекул (альбумина, проинсулина, вирусных белков), а также понять, как осуществляется транспорт таких больших, молекулярных комплексов, как, например, проколлаген, размеры которого в 5 раз превышают средний размер везикулы. Основные исследования, послужившие доказательством везикулярной теории, были выполнены в условиях in vitro и методами биохимии. Однако разработанные в последнее время методические морфо-функциональные подходы выявили многие факты, которые позволяют усомниться в доказанности везикулярной теории транспорта
Классический вариант модели созревания и прогрессии цистерн предполагает, что транспортируемый белок, оставаясь в составе цистерны, постепенно направленно продвигается по стаку («стопке») КГ от цис-полюса к транс-полюсу. Такая прогрессия белка сопровождается возвратом (рециклингом) ферментов, который осуществляется везикулами, имеющими СОР 1-покрытие (Glick B.S. at al. 1997; Glide B.S. and Malhotra V. 1998). Данная модель тоже не может быть принята безоговорочно, т.к. исследования, выполненные в последние годы, не выявили в везикулах повышенного содержания ферментов гликозилирования, которые распределяются в соответствующих цистернах комплекса Гольджи и должны возвращаться в «свои» цистерны (Orci Let al. 2000; Kweon H.S. et al 2004) Между тем, согласно данной модели, эти ферменты в процессе транспорта должны рециклировать именно в составе везикул КГ.
Недавно, в том числе и с нашим участием, был опубликован ряд работ, выполненных с использованием такого высокоразрешающего метода, как
электронная томография, и доказывающих факт образования непрерывных тубулярных соединений между цистернами комплекса Гольджи в клетках, осуществляющих активный транспорт (Ladinsky M.S. et al., 1999; 2002; Trucco A. et al. 2004), и отсутствия вышеописанных соединений в условиях блокирования транспорта (Trucco A et al. 2004) На этом основании была предложена еще одна модель — перемещение транспортируемого белка (карго) по межцнстернальным соединениям. Однако, если для карго, имеющего небольшие размеры и обладающего способностью к диффузии (например, альбумина), эти представления еще могут быть близкими к действительности, то для больших, не способных к диффузии белков, таких как агрегаты проколлагена I, размеры которых составляют 300 нм, гипотеза сталкивается с непреодолимыми трудностями — диаметр тубулярных соединений не превышает 50-60 нм. Несмотря на убедительные доказательства существования соединений между различными цистернами КГ, остается открытым вопрос всегда ли данные соединения присутствуют на всех уровнях стопки цистерн КГ? Возможно, они существуют, в основном, между цистернами, к которым в этот момент присоединен мембранный переносчик транспортируемого белка.
Согласно модели созревания и прогрессии переносчика транспортируемых белков и липидов, обоснованию которой, собственно, и посвящена данная работа, предполагается, что образовавшийся на выходе из ЭР мембранный переносчик сливается с промежуточным компартментом и цис-цистерной КГ, формируя смешанный компартмент, так называемый «карго-домен» Он представляет собой динамичную мембранную структуру достаточно большого размера, в просвете и мембранах которой содержатся транспортируемые белки Затем происходит сегрегация переносчика и его слияние с медиальным (срединным) компартментом комплекса Гольджи, что является сигналом для физического отделения данного мембранного переносчиха от промежуточного компартмента и цис-цистерны. Такая же последовательность событий (слияние, смешивание, повторяющаяся
сегрегация) происходит на других этапах транспорта через комплекс Гольджи Один из возможных механизмов сегрегации белков при последовательном формировании и перемещении переносчиков базируется на известной разнице в толщине мембран на протяжении стака КГ.
Из этой модели можно вывести ряд следствий, которые поддаются экспериментальной проверке. Например, можно предположить, что во время прохождения мембранного домена, содержащего карго, по стаку, поочередно, на уровне его локализации, длина соответствующих цистерн должна увеличиваться (поскольку к ним добавляются мембраны), в то время как другие цистерны должны оставаться той же длины, что и до прихода карго. По результатам наблюдений за проходом карго по изолированным мини-стакам, образованным под воздействием нокодазола, разница в длине между разноуровневыми цистернами в стопке КГ выявлена не была, однако мы смогли подтвердить увеличение длины цистерн при проходе карго (Trucco A et al, 2004). Учитывая вышеописанные данные, оригинальная версия модели созревания и прогрессии мембранного переносчика белков может быть принята за основу, однако она требует существенного дополнения и переосмысления.
Таким образом, несмотря на множество работ, посвященных моделям транспорта белков и липидов через КГ, до сих пор так и не сложилось единого мнения о механизме перемещения транспортируемых веществ (карго) через эту органеллу. Устранение существующих противоречий путем анализа структурной организации КГ в различных функциональных режимах и с применением комплекса современных методов исследования (лазерной конфокальной микроскопии, электронно-микроскопической техники с использованием иммунопатологических методов и ЭМ-томографии, коррелятивной микроскопии) необходимо для построения непротиворечивой модели, описывающей структуру и модус функционирования этой сложной "к органеллы.
Целью настоящего исследования являлся анализ механизмов транспорта белков через комплекс Гольджи и разработка на его основе содержательной модели, позволяющей согласовать результаты современных исследований, посвященных изучению переноса через комплекс Гольджи.
Зедачп исследования включали:
Изучение путей, скорости и механизмов перемещения мембранных и растворимых белков различной молекулярной массы и размера через комплекс Гольджи
Разработку методологического подхода, позволяющего совместить изучение ультраструктуры и трехмерной организации мембранных переносчиков белков в комплексе Гольджи с исследованием кинетики их транспорта в живой клетке.
3 Ультраструктурный анализ трехмерной организации путей переноса протеинов через комплекс Гольджи.
Выявление зависимости структуры комплекса Гольджи и распределения его ферментов от интенсивности транспорта белка.
Создание на основе полученных экспериментальных данных и современных молехулярно-биологических представлений эффективной модели транспорта белков через комплекс Гольджи.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Существующие в настоящее время модели транспорта белков через комплекс Гольджи пересмотрены с учетом результатов исследований, основанных на новых, разработанных нами, методологических подходах.
2 Комплекс Гольджи следует рассматривать как весьма динамичную мембранную органеллу, структура которой, в значительной мере определяется интенсивностью синтеза и транспорта белков.
Скорость и механизмы перемещения мембранных и растворимых белков через комплекс Гольджи (от момента входа до момента выхода из данной органеллы) не зависят от молекулярной массы и размера транспортируемых белков.
Ферменты, характерные для каждого компартмента комплекса Гольджи, отсутствуют или содержатся в низких концентрациях в СОР I - везикулах и локализуются, преимущественно, в перфорированных зонах на краях цистерн комплекса Гольджи
Межцистернальные тубулярные сообщения открывают возможность рециркуляции ферментов комплекса Гольджи и их возврата в проксимальный компартмент посредством латеральной диффузии в мембранах.
Созревание и прогрессия мембранного переносчика транспортируемого белка являются основными механизмами транспорта через комплекс Гольджи. Модель прогрессии мембранного домена, содержащего транспортируемые белки, наиболее полно отражает процесс транспорта на данном участке секреторного пути.
Научная новизна.
Предлагаемая работа представляет собой специальное комплексное исследование с применением частично модифицированных и вновь разработанных нами современных технологий клеточной биологии, основанных на синхронизации транспорта белков через пластинчатый комплекс, световой и электронной микроскопии в сочетании с электронной томографией и трехмерной реконструкцией ультраструктур В работе впервые продемонстрировано, что:
1) Везикулярная модель транспорта белков через пластинчатый комплекс не
верна, т.к. отсутствует концентрация транспортируемых молекул белка в
СОРІ-везикулах;
Скорости транспорта для образующего крупные молекулярные агрегаты белка проколлагена и для легко диффундирующего мембранного G-протеина вируса везикулярного стоматита (VSVG) одинаковы;
Путем выполнения трехмерной реконструкции комплекса Гольджи на оснозе электронно-микроскопической томографии образцов, фиксированных с помощью сверхбыстрого замораживания, была поставлена под сомнение теория, основанная на мегавезикулах, тк в результате проведенных исследований не было выявлено мегавезикул, а точнее мембранных расширений, содержащих проколлагеновые макромолехулярные агрегаты, которые были бы совершенно изолированы от других мембранных структур;
В работе опровергнута классическая модель созревания и прогрессии цистерн, предполагающая рециклинг ферментов гликозилирования, локализующихся в аппарате Гольджи. Основанием послужили данные о крайне низкой концентрации ферментов гликозилирования в COPI-везикулах,
5) Проведен комплексный экспериментальный анализ и дано обоснование
модели прогрессии через комплекс Гольджи мембранного переносчика,
содержащего транспортируемые белки В результате было показано, что
данная модель наиболее полно соответствует имеющимся
экспериментальным наблюдениям.
Научно-практическое значение работы. —
Экспериментальные данные, полученные при проверке существующих моделей транспорта через комплекс Гольджи, представляют собой не только теоретическую базу для понимания истинных механизмов транспорта на этом участке секреторного пути Они позволяют начать целенаправленный поиск новых лекарственных средств для лечения заболеваний, механизмы которых связаны с нарушениями транспорта через пластинчатый комплекс Создание
модели транспорта белков через комплекс Гольджи дает возможность проверки уже существующих специфических лекарств, способных оказывать строго направленное воздействие ка транспорт определенного белка и существенно снизить затраты на проведение исследований по созданию экспериментальных систем для тестирования лекарственных средств. Таким образом, эта модель может стать полезным инструментом не только в клеточной и молекулярной биологии, но и в фармакологии Содержащиеся в рабоге фактический материал, выводы и положения могут быть широко использованы в. преподавании соответствующих разделов клеточной биологии и цитологии.
Они используются в учебном процессе на кафедрах гистологии и эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ, на кафедре химии, биологии и экологии Шуйского государственного педагогического университета. Разработанные нами новые методы ультраструктурного исследования применяются в Институте эволюционной физиологии и биохимии им И ^.Сеченова РАН и в Институте цитологии РАН.
Личный вклад автора.
Автору принадлежит основная роль в определении направления исследований, в разработке новых методических и экспериментальных подходов, получении и анализе результатов данной научной работы. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в активном участии на всех этапах исследования, начиная с обсуждения проекта до литературного изложения полученных результатов
Апробация диссертации.
Основные положения диссертации и результаты исследования были представлены в 38-ми докладах на конференциях и конгрессах на Научной конференции, посвященной 100-летию со дня открытия аппарата Гольджи (гПавия, Италия, 19-23 сентября 1998 г.); на 39-ом Ежегодном конгрессе
Американской ассоциации клеточных биологов (^Вашингтон, США, 11-15 декабря 1999 г.), на Конгрессе Европейской ассоциации ученых-биологов (г Женева, Швейцария, 2-6 сентября 2000 г. и г.Ницца, Франция, 4-8 сентября 2004 г); на 4-ой Международной конференции Европейского общества световой микроскопии (г. Ґетеборг, Швеция, 26-28 мая 2004 г.), на 13-ом Европейском конгрессе по микроскопии (г.Антверпен, Бельгия, 22-27 августа 2004 г.); на 5-ой и 7-ой Анабергских конференциях, посвященных мембранному транспорту и секреторному пути (г Гольдегг, Австрия, 9-14 января 2001г. и 9-14 анваря 2007 г.). Автор выступал как приглашенный докладчик на 2-ой Международной конференции Европейского общества световой микроскопии (г. Париж, Франция, 29-31 июня 2002 г.) и на Международном конгрессе по световой и электронной микроскопии (г. Давос, Швейцария, 28 августа - 2 сентября 2005 г.). Результаты исследований были доложены также на V Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (г. Казань, 17-18 сентября 2004 г.) и на VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (г Орел, 15-16 сентября 2006 г.).
Публикации.
По результатам выполненных исследований опубликовано 55 печатных работ, из них 17 статей в рецензируемых научных журналах.
Структура н объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав собственных результатов с иллюстрациями, заключения и списка литературы. Работа изложена на 296 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 28 комбинированных рисунков. Список литературы включает 321 источников.
