Введение к работе
Актуальность работы. Одной из задач современной генотерапии является избирательная доставка в клетки чужеродного генетического материала. Это связано в первую очередь со спецификой его применения в качестве терапевтического агента. Уникальные адресующие свойства показаны для белковых переносчиков ДНК (Rusconi S., 2000; Uherek С, 2000), интерес к которым особенно возрос в связи с открытием новых перспективных свойств олигонуклеотидов (антисмысловые олигомеры, аптамеры, ДНК/РНК гибриды, siRNA и др.). Представленная работа развивает подход к конструированию самоорганизующихся белково-нуклеиновых молекулярных ансамблей, способных избирательно интернализо-ваться клетками-мишенями и обеспечивать взаимодействие нуклеиновой компоненты с внутриклеточными целями. Избирательность таких комплексов в отношении целевых клеток обеспечивается взаимодействием рецепторсвязывающего домена белковой компоненты с тканеспецифичными поверхностными рецепторами или рецепторами клеток-мишеней, а интернализация - рецептор-опосредованным эндоцитозом.
Дополнительные домены
Рис. I. Схема конструирования белок-нуклеиновых комплексов: А - мультидоменный рекомбинантный белок в комплексе с ДНК; Б - комплекс, состоящий из металлической наночастицы и адсорбированных на ее поверхности функциональных доменов белков и ДНК.
На сегодняшний день существуют различные подходы к формированию
многофункциональных
биополимерных струк
тур. На рис. 1 А показана
схема мультидоменного
функционального ком
плекса, состоящего из
лиганда, отвечающего за
узнавание поверхности и
обеспечивающего транс
порт посредством рецеп
тор-опосредованного эн-
доцитоза, ДНК-
нуклеиновой компонентой или непосредственно ДНК (ковалентные ДНК-белковые конъюгаты) и возможных дополнительных доменов - эндосомолитиче-
связывающего домена с
ских единиц токсинов, сигнальных последовательностей и т.д. Другим подходом может служить конструирование функциональных комплексов на основе твердых платформ, например металлических наночастиц (рис. 1 Б). В этом случае все домены непосредственно сорбируются на поверхности за счет различных взаимодействий. Однако необходимо доказать, что при сорбции молекул их свойства сохранились, так, ДНК должна сохранять возможность к гибридизации, белки - сохранять структуру и т.д.
С точки зрения практической медицины особый интерес представляют активно пролиферирующие клетки - эмбриональные, стволовые и опухолевые, для которых характерна суперэкспрессия рецепторов факторов роста и альфа-фетопротеина (АФП) (Abelev G.I., 1971; Mizejewski G.J., 1985). АФП и его фрагменты успешно использовались ранее для создания средств направленной доставки антибиотиков в опухолевые клетки (Гороховец Н.В., 2006). Обнадеживающие результаты были получены и при in vitro испытаниях конъюгатов нативного АФП с тиофосфорильными антисмысловыми олигонуклеотидами, а также для комплексов полилизинового производного АФП, выделенного из ретроплацентарной сыворотки рожениц, с ДНК (Посыпанова, ГА., 2005).
Конструирование и исследование функциональных белок-нуклеиновых комплексов на поверхности металлических частиц является одним из направлений в поиске новых материалов, обладающих заданными функциональными свойствами, что является одной из актуальных задач нанотехнологии. В сравнении с ранее описанными платформами, наночастицы никеля обладают рядом привлекательных свойств, обусловленных их электропроводными и магнитными характеристиками, а также уникальной способностью удерживать гистидинилиро-ванные белки (Becerril, Н., 2006, Лазарев, В.Н., 2007), поэтому их использование в биосенсорах и диагностических системах представляет значительный интерес. Особенно важно в этой связи изучить условия образования комплексов и подтвердить целостность и функциональность молекул в их составе.
Цель работы состоит в конструировании, получении и исследовании свойств функциональных нуклеопротеиновых комплексов, а также их ассоциатов с наноразмерными частицами никеля.
Для выполнения работы были поставлены следующие задачи.
1. Конструирование на основе альфа-фетопротеина новых белков-векторов,
способных ассоциироваться с олигонуклеотидами, их аналогами, а также с плаз-
мидной ДНК для избирательной доставки генетического материала в целевые
клетки.
2. Получение экспрессирующих конструкций, штаммов-продуцентов ре
комбинантных белков, наработка целевых полипептидов, подтверждение их пер
вичной структуры, исследование комплексообразования с ДНК и транспортных
свойств полученных нуклеопротеиновых ассоциатов.
Исследование способности наноразмерных частиц никеля ассоциироваться с молекулами олигонуклеотидов и гистидинилированных белков, подтверждение целостности и функциональности биополимеров в составе комплексов с никелем.
Оптимизация методов ВЭЖХ-очистки олигонуклеотидов фосфодиэфир-ной, тиофосфорильной природы и несущих метки, а также антисмысловых олигонуклеотидов, таких как ТМО (telomere-mimic oligonucleotide, фрагмент теломер-ной ДНК, подавляющий экспрессию гена теломеразы), AS 1 (подавляющий экспрессию проонкогена С-тус) и др., структура которых затрудняет очистку по стандартным протоколам.
Научная новизна и практическая значимость. На сегодняшний день не существует универсальных избирательных систем доставки ДНК в целевые клетки. Высокий уровень интернализации чужеродного генетического материала достигается при использовании различных подходов, например липофекцией, но в данном случае речь не идет об избирательном транспорте. В то же время нет данных о том, какого количества трансформированных клеток необходимо добиться для достижения терапевтического эффекта, однако ряд экспериментов свидетельствует о том, что эффективной оказывалась трансформация лишь 5-10% пораженных клеток (Kay М.А., 2000). Использование механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза позволяет решить ряд проблем, связанных как с избирательностью доставки, так и с безопасностью его применения в целом. В представленной работе впервые получены 3 рекомбинантных белковых вектора на основе фрагмента альфа-фетопротеина. Экспонирование рецепторов АФП на поверхности клеток служит одним из надежных маркеров ряда опухолей (Abelev
G.I., 1971). Новые белковые векторы имеют 2-х доменную структуру: 1) рецепто-роспецифичный домен (фрагмент альфа-фетопротеина), отвечающий за узнавание комплекса определенной поверхности и обеспечивающий транспорт комплекса посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, 2) ДНК-связывающий домен, представленный различными олигокатионными последовательностями.
Показано, что полученные рекомбинантные белки самопроизвольно ассоциируются с олигонуклеотидами, олигонуклеотидными дуплексами и плазмидной ДНК с образованием стабильных комплексов, способных избирательно интерна-лизоваться клетками, несущими рецепторы АФП. Избирательность полученных нуклеопротеиновых комплексов подтверждена in vitro экспериментами с целевыми и рецептордефицитными (контрольными) клеточными культурами. Универсальность белковых векторов в отношении переносимого генетического материала подтверждена как исследованием взаимодействий белков с олигомерами, дуплексами и плазмидной ДНК, так и экспериментами по доставке с их помощью известных антисмысловых к таким ключевым генам канцерогенеза, как ген теломе-разы и С-тус, олигонуклеотидов тиофосфорильной природы. Полученные результаты важны для понимания механизмов образования и изучения взаимодействий молекулярных ДНК-белковых ансамблей. Новые белки могут стать универсальной основой для разработки эффективных высокоизбирательных ген-направленных противоопухолевых лекарств.
В настоящей работе на примере полученных новых рекомбинантных белков на основе АФП исследовано образование протеин-никелевых ассоциатов. В работе продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования наночастиц никеля для формирования многофункциональных биополимерных структур, а также их преимущества в сравнении с другими наноразмер-ными основами. Показана способность агрегатов наночастиц никеля ассоциироваться с фрагментами однонитевых ДНК с образованием стабильных комплексов. Впервые показано, что в составе комплексов молекулы биополимеров не дегради-рованы и могут частично или полностью сохранять функциональные свойства, это создает основу для их использования, например, в системах селекции аффинных к белкам аптамеров. Полученные результаты вносят вклад в создание новых
биополимер-никелевых наноструктур - исследовательских и диагностических инструментов в области молекулярной наноэлектроники, биологии и медицины.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на расширенном межлабораторном заседании Отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России (Москва, 12 ноября 2009 года), а так же в ходе следующих конференций: III Международная конференция "Фундаментальные науки - медицине" (Новосибирск, 2007), IV Съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008), 1-й Международной научной школе Нано-2009 (Москва, 2009), Конференция молодых ученых НИИ ФХМ (Москва, 2009).
Публикации по теме диссертационной работы. По теме диссертации автором опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК, результаты работы представлены на 5 конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на ДО страницах печатного текста, содержит .14 рисунков. Список литературы" включает 190 источников.
Материалы и методы.
Клеточные линии, бактериальные гитаммы и плазмидные векторы.
В работе были использованы клетки линии DU 145 (human prostate carcinoma), SCOV3 (ovarian carcinoma), наличие в которых рецепторов AFP подтверждали по взаимодействию с флуоресцентным AFP, и лимфоциты, а также бактериальные штаммы Е. coli DH5ct (F- (p801acZAM15 A(lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 X- thi-1 gyrA96 relAI) (Life Technologies, Великобритания), B834 (DE3)(F- ompThsdSB(rB- mB-) gal dcm met (DE3)) (Novagen, США), BL21 (DE3)pLysS (F- ompT hsdSBfrB- mB-) gal dcm X(DE3), pLysS, Cmr (Promega), плазмидные векторы pGEM-T/easy (Promega, США), pET-15b, pET-28b (Novagen, США), pRC-CMV (Invitrogen, США).
Наиочастицы никеля.
Наночастицы никеля (20 нм) получены в Институте энергетических проблем химической физики РАН, Россия.
Методы.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили на хроматографах Waters, Agilent Chemstation 1100 Series в градиенте ацетонитрила в 0,1 М ацетате аммония или 0,1 М триэтиламмоний ацетата на С16, С18 и С4 об-ращеннофазовых колонках. Хроматографию белков проводили с использованием FPLC систем Pharmacia (Швеция) или Agilent (США).
Электрофоретическое разделение олигонуклеотидов проводили стандартно в 20% полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, ампликонов и плазмид в агарозном геле 2% и 1% соответственно, белков в 12% ПААГ.
Масс-спектры регистрировались на MALDI TOF-спектрометрах UltraFlex и MicroFlex (Bruker, США) с использованием стандартной стальной мишени (MSP polished steel, Bruker, США). В качестве матрицы при анализе олигонуклеотидной составляющей применяли 0,25 М раствор 3-гидроксипиколиновой кислоты (Fluka, США). Для получения масс-спектров белков непосредственно с никелевых нано-комплексов последние дважды промывали 0,1 М раствором ацетата аммония в 1% ацетонитриле, водой и ресуспендировали в 0,022 М растворе матрицы (3,5-диметокси-4-оксикоричной кислоты, Aldrich, США), в 50%) водном ацетонитриле, содержащем 0,1% трифторуксусной кислоты. Полученную суспензию наносили на мишень и высушивали на воздухе.
Синтез олигонуклеотидов.
Олигодезоксирибонуклеотиды синтезировали твердофазным амидофосфит-ным методом на автоматическом синтезаторе ASM (Россия) с использованием стандартных коммерческих реагентов в условиях модифицированных нами программ реакционных циклов. Для реакционных циклов с введением 3'-тиофосфорильных звеньев вместо стандартного окислителя, содержащего йод и воду, применяли свежеприготовленный 0,05 М раствор ЗН-1,2-бензодитиол-3-он-1,1 -диоксида (Glen Research, США) в ацетонитриле. Деблокирование и расщепление связи олигомера с носителем осуществляли с использованием стандартных процедур. Полученные препараты олигомеров анализировали методами ВЭЖХ,
MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry), УФ-спектрофотометрией и электрофорезом в ПААГ.
Методы генетической инженерии.
Реакции кинирования, лигирования, рестрикции проводили с использованием коммерческих ферментов согласно протоколам производителей и другими стандартными методами.
Фрагменты ДНК из агарозного геля выделяли с использованием набора Wizard PCR Preps DNA Purification System (Promega, США) согласно инструкции.
Трансформацию, культивирование штаммов E.coli, получение компетентных клеток и др. проводили согласно инструкции производителя.
Получение, выделение и очистка целевых рекомбинантных белков.
При работе с клеточными линиями использовали стандартные протоколы производителей.
Выделение и очистку белков проводили с помощью металло-хелатной аффинной и ионообменной хроматографии. Предварительно отмытые тельца включения, содержащие целевые полипептиды, разрушали дезинтегратором в буфере, содержащем гуанидин хлорид. После фракционирования хроматографией, фракции обессоливали и рехроматографировали. Концентрацию белка определяли по методу ВСА (ВСА-набор, Sigma США). Очищенный белок характеризовали элек-трофоретическим анализом в ПААГ и масс-спектрометрически.
Культивирование клеток.
В экспериментах использовали опухолевые клети человека линии DU145 и контрольные клетки. Клетки культивировали в пластиковых культуральных флаконах (Costar, Великобритания) в среде RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина при 37С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02. Клеточные культуры рассевали 2 раза в неделю и высевали в 12-луночные планшеты на покровные стекла или непосредственно в лунки за сутки до эксперимента.
Проточная цитофлуориметрия.
Клетки DU145 и контрольные в логарифмической фазе роста отмывали дважды PBS (рН 7,4) и 2 часа инкубировали в среде DMEM (Sigma, США), не содержащей сыворотки. Далее клетки снимали с пластика и отмывали буфером
PBS. Комплексы белков PGA, PGA1 и PGAl-His с флуоресцентномеченными ТМО и TMS (соотношение белок:олигонуклеотид от 1:1 до 4:1) в концентрации 200 нМ по олигонуклеотидам и 200-800 нМ по белку добавляли к суспензии клеток на холоду и инкубировали при 37С в течение 1 часа. После окончания инкубации клетки снимали с пластика с помощью раствора 0,05% трипсина в растворе Версена (Sigma, США), промывали и ресуспендировали в PBS. Интенсивность флуоресценции измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-XL (Beckman-Coulter, США), флуоресценцию возбуждали аргоновым лазером (Coherent), ХътЪ 488 нм, Х^п. 520 нм.
Флуоресцентная микроскопия.
Клетки DU145 высевали на покровные стекла в 24-луночные планшеты за сутки до эксперимента. Комплексы белков с флуоресцентномеченными олиго-нуклеотидами (соотношение белок:олигонуклеотид от 1:1 до 5:1) добавляли к клеткам на 24 часа в концентрации 200 нМ по олигонуклеотидам. Клетки отмывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом. Ядра клеток окрашивали флуоресцентным красителем Hoechst 33342 (Sigma, США). Клетки заключали в мови-ол и анализировали флуоресценцию с помощью микроскопа Opton IM35 (Carl Zeis, Германия) при увеличении 400х с использованием фильтров: G450, FT510, LP515-565 - для FAM и G365, FT395, LP420 - для Hoechst. Визуализацию изображения осуществляли с помощью цифровой камеры DXM 1200 (Nikon, Япония).
Получение комплексов ДНК и белков с наночастицами никеля.
Суспензию 10-15 мг порошка наночастиц Ni в 1 мл 0,1 М серной кислоты встряхивали (1 ч, 20С), обрабатывали ультразвуком (22 кГц, 15 мин.), частицы отделяли центрифугированием или магнитной сепарацией. После удаления кислоты остаток промывали водой до нейтральной реакции. Подготовленные частицы никеля хранили в виде суспензии в 30% водном глицерине в среде гелия или аргона. Взвеси после встряхивания и ультразвуковой обработки были стабильны в течение 1-2 часов.
Для получения изотерм адсорбции олигонуклеотидов и белков из водных растворов наночастицами никеля в пробирки помещали аликвоты приготовленной взвеси, промывали PBS (рН 7,4) и добавляли равные объемы растворов оли-
гонуклеотидов или белков в 0,1 М PBS. Взвеси интенсивно встряхивали в течение оптимального времени, затем фиксировали изменение оптической плотности су-пернатанта (260 нм - для олигонуклеотидов, 280 - для белков 3D и PGA, 395 -для GFP). В случае FAM-содержащих олигомеров регистрировали изменение интенсивности флуоресценции (^озб=430 нм, ^,,=495 нм), для GFP - ^Возб=490 нм, ^-нсп=512 нм. Молярную концентрацию образовавшегося комплекса рассчитывали по разности исходной и остаточной оптических плотностей растворов. Молярную концентрацию связанного белка рассчитывали по изменению оптической плотности С учеТОМ Коэффициентов МОЛЯрНОЙ ЭКСТИНКЦИИ беЛКОВ, Є (ДЛЯ 3D И PGA - Б(280
„м)=67400, для GFP - 8(395 „м)=30000).
Получение комплексов ДНК-Ni и белок-Ni проводили аналогично.
Изучение взаимодействия Ni-GFP с ДНК-аптамерами Agfp 1 и Agfp2 проводили следующим образом: аликвоты взвеси ассоциатов Ni-GFP помещали в пробирки, промывали 0,1 М PBS (рН 7,4) и встряхивали с равными объемами растворов олигонуклеотидов dC30, Agfpl и Agfp2 (0,2-0,4 О.Е./мл). Оптическую плотность супернатантов измеряли через 2 часа при 260 нм.
Похожие диссертации на Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК
