Введение к работе
4//5 Ьр
Актуальность проблемы Стре.митетьныи прогресс в расшифровке іенома человека
идентификации его генов, кнечаї.іяюіцие успехи биотехнологии летают все более актуальной разрабоїку научных основ генной терапии наследственных заболеваний
Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) - является наиболее частым настедственным нервно-мышечным заболеванием человека Частота встречаемости МДД состав іяет 1 на 5000 новорожденных мальчиков (Emery. 1991). Ієн МДД локализован на Х-хрочосоме в локусе Хр21 1 и имеет размер бо теє 2 4 млн п о явтяясь самым большим и і иівєсгньіх іенов человека (Koemg et al, 1987. Hoffman et al . 1987) Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок дистрофии, выполняющий функцию связующею «єна между внутренним цитоскелетом чиофибриллы и внеклеточным матриксом (Koemg et al .1988) Отсутствие дистрофина при МДД приводит к повышенной проницаемости сарколеммы и обраюванию в ней физических разрывов, что велет к некроіу мышц (Brown et al. 1997) Эффективная медикаментозная терапия МДД ю настоящего времени отсутствует, поэтому так акіуальна раїрабоїка іеноіерапевшческих подходов к течению этого забо іевания
Генная терапия заключаеіся во введении в клетку нуклеиновых кислот с целью исправтения тенных іефекюв или придания клеткам новых функций (Mountain. 2000) Восстановление нормального состояния мышечных волокон при МДД является одной из основных задач генной терапии данного заболевания Считается, чго достижение терапевтического эффекта возможно при воссіановлении синтеза дистрофина не менее, чем в 20% мышечных волокон (Браун. 2003) Необходимый уровень трансфекции в экспериментах на мышах mdx - биологических моделях МДД - был досгиінуї ю іько с помощью вирусных векторов (Clemens et al 1996. W ang et al 2000) Однако испотьзование вирусов наталкивается на существенные мсто іические трудности а также выраженный иммунный ответ организма на вирусные аніиіеньї Невирусные носители лишены этих недостатков, однако, іффективность трансфекции при их испо тьзовании. как правит невысока Основными функциями носителя являются компактизация ДНК. тканеснецифичный транспорт и эффективное проникновение в h летки, а также защита іенеіической конструкции or тизосомальчои легра іании (Pouton et a! . 2001) Кроме того, носитель должен быгь нетоксичным и биодетрадируемым.
Одним ит направ іений в области разработки синтетических среде і в юсіавки ДНК является соиание носителей па 6aje синтетичских пепти тов (Wyman et al. 1997. bommaya et al. 2000, Rittner ei al . 2002) К их преичуществам относятся биолетрадируемость. легкость чо шфикации структуры и ачинокис гопюго состава Однако, несмотря на масштабные исс тедования петитных средств поставки тенных конструкции в шяние ратчичных модификаций на их трансфекционную активность ипчено негосіаючно
Іаким образом, поиск и изучение новых пешишых носителей для тоставки ДНК в к тетки млекопитающих является актуальной проблемой генной терапии, в том чис те іенной терапии МДД
Цель работы заключается в поиске пептидных носиіе іей перспективных для доставки тенных конструкций в клетки млекопитающих и разработке новых подходов к генотерапии мышечной дистрофии Дюшенна
Достижение этой цели преду сматривало решение следующих задач: Изучить особенности трансфекции мышечных волокон мышей mdx тенеіическими конструкциями с кДНК гена дистрофина с помощью аналогов вирусных олигопептидов и катионных іииосом Оценить эффективность супрессии нонсенс-мутации в гене дистрофина у мышей mdx конструкциями с геном супрессорной тРНК
Изучить условия образования и особенности структуры комплексов ДНК с пепгилными носителями Проанализировать в шяние состава и структуры исстетуемых носителей на трансфекционную активность in vitro
Научная новизна и теоретическая значимость, впервые изучены особенное і и трансфекции
мышечных волокон мышеи mdx генетическими конструкциями с кДНК гена дистрофина.
поставляемых с помощью аналогов вирусных о шгопепгидов и катионных шпосом Впервые изучена
вотможносіь коррекции нонсенс мутации в гене тистрофина у мышей mdx с помощью супрессорных
іРПК Разработан оптиматьный алгоритм тестирования синтетических о шгопептидов в качестве
потенциальных векторов доставки экспрессирующихея генных конструкций в кіеіки
ччекопитаюших Впервые изучены особенности тр шр^щі||дц||0||длдавд|рідфшсм пниновыч
О. Щ$ш№\
іендричеров и альфа-спиральных липопепіи юв Проанализировано влияние состава и ырукгуры исследованных синтетических пептидных носителей на их грансфекционную активность in vitro
Положения, выносимые па шшиту: Использование нуктеопептидных коми іексов pHSADy/K8-J7S-1 существенно повышает эффективность трансфекции мышечных волокон in \ivo Наличие экспрессии гена дистрофина в скелетных мышцах, отдаленных от места введения, подтверждает іипоіеіу "дистантной трансфекции» Введение супрессорныч гРНК мышам mdx приводит к частичном) восстановлению синтеза дистрофина
Пептиды D1 и D2. Ы'1 и гР4 способны компактизовать ДНК, досіавдяїь ее в клетки млекопитающих in vitro и обеспечивать экспрессию маркерных генов, значительно превышающую таковую при введении чистой п шзчиды Модификация тиэиновых денлричеров остатками пальмитиновой кистоты изменяет с і рук туру комплексов ДНК-пептид и способствует их проникновению в клетку Присоединение к линейным альфа-спиральным пеги идам остатков каприновой кислоты увеличивает их мембраноактивные свойства и повьппаеі эффективность трансфекции
Практическая тачимость работы. Полученные резу іьіагьі могут найти применение на доклинической фазе испытаний новых і енотерапевтических подходов в течении миодистрофии Дюшенна, а также других наследственных заболеваний
Апробация работы. Представленные в диссертации резульлаты бы їй до южены на ( и V Ежегодной конференции Американского Общества Гечной Терапии (1998. 2002) на 9 10 11 и 12 Конгрессах Г вропеискою Общества Генной Терапии (2001. 2002. 2003 2004). на 10 и 14 Ьвропсйской Конференции по Генетике Человека (2001. 2004). на 27 їївропейском Симпоіиуме по Пептидам (2002); на 10 конференции "Синієі. исс тс тование свойств модификация и переработка высокомолекулярных соединении" (Казань 2001), на Ш съезде ВОГ ИС (Москва. 2004)
Публикации По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 7 сіаіей
Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исс телования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, состоящего из {Q ( источников Работа изложена на (
