Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Овзор литературы
1.1. Дезоксирибонуклспновыс кислоты, связанные с поверхностью клеток 18
1.1.1. Общие свойства ДНК с клеточной поверхности 9
1.1.2. Взаимодействие ДНК с потенциальными мишенями на поверхности клеток
1.2. Синтетические молекулы ДНК, формирующие комплексы с клеточными белками 32
1.2.1. "ДНК-ловушки" - регуляторы экспрессии генов 18
1.2.2. ДНК-аптамеры, ингибирующие функции белков 21
1.2.3. ДНК-аптамеры к поверхностным маркерам эукариотических клеток 26
1.2.4. Особенности последовательностей ДНК, эффективно связывающихся с эпитопами клеточной поверхности и проникающих в клетки
1.3. Эидотслиальныс клетки — удобная модель для исследования
внеклеточных ДНК, связанных с поверхностью клеток
1.3.1. Общее строение эндотелиоцитов 33
1.3.2. Функции, рецепторы и секреторные белки эндотелиальных клеток 34 Заключение 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 38
2.1. Материалы
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Методы
2.3.1. Клегки и условия их культивирования
2.3.2. Электрофорез Д11К и ОДІ I
2.3.3. Выделение ДНК и ОДЫ из геля при помощи электроэлюции
2.3.4. Получение трипсинового элюата с поверхности клеток .
2.3.5. Активация сефарозы CL-4B бромцианом .
2.3.6. Выделения ДНК из нуклеопротеиновых комплексов трипсинового элюата клеток 42
2.3.7. Получение и выделение [32Р] - меченых ОДН и фрагментов ДНК 43 44
2.3.8. Получение двуцепочечных адаптеров
2.3.9. Лигирование фланкирующих ОДН к 5 - и 3- концам модельного ОДН
2.3.10. Лигирование фланкирующих ОДН к 3 - и 5 - концам [32Р] - меченых
оцДНК
2.3.11. ПЦР-амплнфикация продуктов лигпропания и выделение ПЦР продуктов из реакционной смеси 45
2.3.12. Наработка клеток E.coli штамм JM 109 для трансформации
2.3.13. Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
2.3.14. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.3.15. Подготовка плазмиды pBlueScript II KS и ПЦР-нродуктов для лигирования по липким концам 47
2.3.16. Цитирование ПЦР-продуктов в плазмиду pBlueScript II KS но липким концам 47
2.3.17. Получение супернатантов для определения распределения [32Р] меченых олигонуклеотидов в клетках 48
2.3.18. Выделение ДИК и определение концентрации при помощи флуоресцентного метода 49
2.3.19. Выделение РНК из мембранпо-цитозольной фракции эукариотических клеток на стекловолокннстых сорбентах 49
2.3.20. Экспрессия тканеспецифических генов и культуре эукариотических клеток 50
2.3.21. Подготовка слайдов для флуоресцентной микроскопии
2.3.22. Подготовка слайдов для хромосомного анализа эндотелиальиых клеток 52
2.3.23. Подготовка образцов для исследования накопления олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцеином, в клетках при помощи проточной цитометрии 52
ГЛАВА 3. Результаты экспериментов и их обсуждение 54
3.1. Введение 54
3.2. Культивирование и характернзации эндотелиальиых клеток человека
3.3. Исследование ннзкомолекулярных ДИК, связанных с поверхностью эндотелноцитов 59
3.4. Разработка методологии выделения коротких ДНК, "прочно" связанных е поверхностью клеток 60
3.5. Разработка протокола лигирования фланкирующих ОДН к оцДНК в условиях низких концентраций оцДНК-мшнсней 64
3.6. Выделение, амплификация, клонирование и секвенпровапне коротких ДНК с клеточной поверхности эндотелноцитов 74
3.7. Исследование связывания коротких олигонуклеотидов с эндотелиальнымп клетками 81
3.8. Компьютерный анализ геномной ДНК человека и выявление участков ДНК, содержащих кластеры отсеквеннрованных ДНК мотивов 4
3.9. Взаимодействие с эндотелиоцитамн олигонуклеотидов, содержащих отсеквеннрованнме ДНК мотивы 95
3.9.1. Исследование взаимодействия [32Р]-меченых олигонуклеотидов с эндотелиальнымп клетками
3.9.2. Исследование взаимодействия олигоиуклсотидов с клетками методами флуоресцентной микроскопии и прогонной цнтоф. иоорометрии 102
Заключение 112
Выводы из список сокращений 114
Список литературы
- Синтетические молекулы ДНК, формирующие комплексы с клеточными белками
- Выделение ДНК и ОДЫ из геля при помощи электроэлюции
- Цитирование ПЦР-продуктов в плазмиду pBlueScript II KS но липким концам
- Выделение, амплификация, клонирование и секвенпровапне коротких ДНК с клеточной поверхности эндотелноцитов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что на поверхности клеток различного происхождения постоянно присутствуют эндогенные внеклеточные нуклеиновые кислоты (внНК) [Rykova Е. et al, 2012]. Показано, что часть внНК может быть элюирована с клеточной поверхности в результате обработки клеток реагентами, связывающими двухвалентные ионы металлов, а оставшаяся часть внНК, более "прочно" связанных с клеточной поверхностью, может быть элюирована в составе нуклеопротеиновых (НП) комплексов после обработки клеток трипсином [Morozkin Е. et at., 2004].
В современной научной литературе информация о составе последовательностей ДНК, элюируемых с поверхности клеток (скпДНК), очень ограничена. Показано, что при развитии опухолевого процесса на поверхности клеток крови появляется небольшое количество ДНК из опухолевых клеток [Fleischhacker М. et al, 2007], а ДНК, "прочно" связанные с поверхностью первичных и трансформированных клеток, обогащены фрагментами ДНК прицентромерного района хромосомы 9 [Морозкин Е. и др., 2010]. При этом биологические причины/последствия такого связывания, равно как и биологические функции скпДНК в целом практически не известны. Данные о биологически активных ДНК (антисмысловые олигонуклеотиды (ОДН), экспрессирующие антигены ДНК-конструкции, CpG-богатые ДНК) [Goodchild J., 2011], позволяют предположить, что взаимодействие внНК с белками клеточной поверхности может влиять на клеточные процессы, такие как матричный биосинтез, опосредованный РНКазой Н гидролиз РНК, синтез иммуномедиаторов и молекул адгезии. Кроме того, ДНК и скпДНК могут конкурировать с другими биополимерами (например, сульфатированными полисахаридами) за связывание с их рецепторами или влиять на транспорт других молекул внутрь клеток. Поскольку эффективность связывания нуклеиновых кислот с поверхностью клеток определяет эффективность их транспорта в клеточные компартменты, и, таким образом, их взаимодействие с внутриклеточными мишенями, скпДНК могут транспортироваться в клетку (в частности, в результате сопереноса связанных с мембраной молекул), взаимодействовать с внутриклеточными ДНК-связывающими белками (DAI, H1N-200) и индуцировать каскады клеточных реакций.
Следует отметить, что "прочное" связывание ДНК с клеточной поверхностью может быть обеспечено разными способами: 1) сиквенс-специфичным взаимодействием поверхностных связывающих сайтов с соответствующей ДНК; 2) многоточечным связыванием длинных молекул ДНК с клеточной поверхностью; 3) связыванием молекул посредников с ДНК и плазматической мембраной; 4) суперпозицией этих взаимодействий. Известно, что с поверхностью эукариотических клеток связаны молекулы НК разного размера. Если в случае длинных молекул их "прочное" связывание может быть обеспечено многоточечным взаимодействием с поверхностью клеток, то короткие нуклеиновые кислоты могут быть связаны "прочно"
только благодаря специфическому взаимодействию с поверхностными структурами клеток.
Известно, что связывание ДНК и ОДН с клетками и набор белков, связывающих ДНК, зависит от типа клеток. При этом разные типы трансформированных или иммортализованных клеток сильно отличаются по связыванию ДНК, и ДНК-связывающим белкам, а данные полученные на этих клетках трудно адаптировать для анализа процессов реально протекающих в организме. В представленной работе для исследования скпДНК были выбраны первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Благодаря своему физиологическому расположению между кровотоком и тканью клетки эндотелия сосудов выполняют ряд важных функций: барьерную, гемостатическую, вазомоторную, сосудообразующую, транспортную, рецепторную и секреторную [Rajendran P. et ai, 2013]. Для этих клеток исследована динамика изменения концентрации внДНК и скпДНК [Морозкин Е. и др., 2009]. Кроме того, эти клетки непосредственно контактируют с кровью и могут влиять на циркуляцию диагностически значимых ДНК-мишеней. Такой набор свойств делает эндотелиальные клетки удобной моделью для исследования молекул ДНК, "прочно" связанных с их поверхностью. Данные о последовательностях ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эндотелиоцитов, позволят найти мишени для ДНК, связанных с поверхностью клеток, выявить процессы, в регуляцию которых могут быть вовлечены скпДНК, а так же механизмы влияния скпДНК на эти процессы.
Цель работы. Целью представленной работы являлось выделение и идентификация последовательностей ДНК, "прочно" связанных с поверхностью первичных эндотелиальных клеток человека. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) определить размер фрагментов ДНК, "прочно" связанных с поверхностью эндотелиальных клеток человека; 2) разработать метод выделения фрагментов ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эндотелиальных клеток; 3) идентифицировать последовательности, участвующие в "прочном" связывании ДНК с поверхностью эндотелиоцитов; 4) исследовать связывание с клетками и транспорт в клетки олигонуклеотидов, содержащих выявленные последовательности ДНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. В представленной работе разработан метод выделения коротких фрагментов ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эукариотических клеток, из нуклеопротеиновых комплексов, элюируемых с поверхности клеток в результате обработки трипсином. Для определения последовательности коротких одноцепочечных ДНК (оцДНК) из НП комплексов разработан протокол лигирования фланкирующих олигонуклеотидов к оцДНК в низкой концентрации (>10 пМ).
Используя разработанную методологию, идентифицированы фрагменты скпДНК длиной 6-14 нуклеотидов, связанные с поверхностью клеток HUVEC.
Впервые обнаружены мотивы ATGCAT, CTACGT, GATCCA, встречающиеся в составе скпДНК с частотой 24.1%, 21.7% и 10.8%, соответственно. Исследовано связывание и проникновение ОДН, содержащих идентифицированные мотивы ДНК, а так же их транспорт внутрь эндотелиальных клеток. Обнаружено, что процесс связывания ОДН с клеточной мембраной зависит от комбинации идентифицированных мотивов ДНК в их последовательности и вторичной структуры ОДН. Продемонстрировано, что ОДН транспортируются путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, причем выявленные мотивы ДНК определяют их внутриклеточную локализацию. Таким образом, последовательность скпДНК является одним из основных факторов, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью эндотелиальных клеток и внутриклеточный транспорт НК.
Учитывая тот факт, что связывание ДНК с клеточной поверхностью является определяющим фактором их транспорта к клеточным мишеням, идентификация последовательностей ДНК, обеспечивающих "прочное" связывание с поверхностью клеток, может быть использована для эффективной и направленной доставки НК в клеточные компартией. Полученные в работе данные о нуклеотидном составе коротких фрагментов ДНК, отвечающих за "прочное" связывание с поверхностью HUVEC, могут быть использованы для поиска белков-мишеней, экспонированных на поверхности клеток и связывающих НК, а так же для исследования биологических функций скпДНК.
Апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 2 печатные работы и 2 патента РФ. Результаты работы были представлены на международных конференциях: "International Conference on Chemical Biology" (Новосибирск, 2005); "Физико-химическая биология" (Новосибирск, 2006); 32nd FEBS Congress "Molecular Machines" (Вена, 2007); "Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum -V" (Москва, 2007); "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, 2007); "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов" (Новосибирск, 2008).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов, Списка сокращений и Списка цитированной литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 22 рисунка и 15 таблиц. Библиография включает 217 литературных источников.
Синтетические молекулы ДНК, формирующие комплексы с клеточными белками
Короткие синтетические ДНК, содержащие в своем составе последовательности консенсусных цис-элементов транскрипционных факторов, так называемые " ДНК-ловушки", могут быть эффективными регуляторами экспрессии генов [75]. Такие двуцепочечные олигонуклеотиды способны взаимодействовать с определенным транскрипционным фактором, тем самым, конкурентно ингибируя экспрессию регулируемых этим фактором генов. Использование таких синтетических олигонуклеотидов позволяет заранее выбрать мишень для конкурентного ингибирования. поскольку ДНК-мотивы (консенсусные последовательности) опознаваемые транскрипционными факторами известны. До открытия микроРНК "ДНК-ловушки" не только использовали в исследовательских целях - для ингибирования экспрессии генов в эукариотических клетках, но и предлагали применять ДНК-ловушки в качестве потенциальных лекарственных препаратов [76]. На протяжении двадцати лет наиболее популярной мишенью для "ДНК-ловушек" был транскрипционный фактор NF-kB. Этот транскрипционный фактор регулирует активность множества генов, в том числе гены интерлейкинов и молекул адгезии, отвечающих за иммунные и воспалительные процессы [77]. Было показано, что транскрипционный фактор NF-kB вовлечен в патогенез ряда заболеваний, таких как артрит, псориаз, астма, сердечно-сосудистые и онкологические заболевания [75-77]. Возможность использования "ДНК-ловушек" к транскрипционному фактору NF-kB в качестве противоракового препарата была исследована в условиях in vitro и in vivo [78]. В работе было показано, что обработка клеток "ДНК-ловушкой" для фактора NF-kB приводит к снижению уровня пролиферации злокачественных опухолевых клеток на 50 - 80% в зависимости от типа рака, а так же к 4-х кратному увеличению числа апоптотических клеток по сравнению с контролем. В экспериментах на мышах с опухолью яичников (SKOV-3) через 15 дней после приема "ДНК-ловушки" наблюдалось уменьшение объема опухоли на 66%, а через 20 дней - на 80% по сравнению с мышами контрольных групп. Таким образом, авторы предлагают использовать "ДНК-ловушки" к фактору NF-kB для лечения опухолевых заболеваний.
Антпметастатический эффект "ДНК-ловушки" для NF-kB был продемонстрирован в работе Kawamura с соавторами [79], в которой внутривенно вводили мышам с саркомой М5076 двуцепочечный олигонуклеотид для NF-kB. Выло показано, что введение "ДНК-ловушки" приводит к 80% снижению количества колоний М5076 в печени у мышей по сравнению с контрольной группой. Эти данные свидетельствуют о возможности использования "ДНК-ловушек" к фактору NF-kB для терапии метастаз при раковых заболеваниях.
Известно, что хроническое воспаление часто характеризуется формированием гранулем (узелков), возникающих в результате пролиферации и трансформации клеток, способных к фагоцитозу [80-81]. Для исследования противовоспалительного эффекта "ДНК-ловушки" к фактору NF-kB крысам был введен подкожной имплантат в виде губки, пропитанной каррагинаном - полисахаридом, вызывающим воспалительную реакцию. Авторы работы обнаружили, что введение "ДНК-ловушки" к фактору NF-kB в область имплантата приводит к снижению клеточной миграции и индуцирует апоптоз лейкоцитов, сопровождающийся увеличением фагоцитарной активности макрофагов, в области воспаления [82]. Позднее De Slelano с соавторами обнаружили, что использование "ДНК-ловушки" для NF-kB в крысиной модели хронического воспаления приводит к снижению образования гранулем и блокирует транскрипционную активность фактора NF-kB до 15 дней [83]. Атопический дерматит является хроническим воспалительным заболеванием [84]. Существенный аффект при использовании ОДН-дуплекса - " ловушки" для NF-kB наблюдали на мышиной модели (линия NC/Nga) авторы работы, посвященной исследованию диффузного дерматита [85]. В результате обработки ушей, головы и шеи мышей мазью, содержащей ДНК-ловушку" для NF-kB. спустя 13-20 педель уменьшается область поражения кожи по сравнению с контрольной группой. Более того, уже через 3 дня после обработки наблюдалась индукция апоптоза в клетках внутри поврежденной кожи с параллельным снижением количества пронизывающих мастоцитов (mast cells) [85]. Таким образом, авторы продемонстрировали, что местная аппликация "ДНК-ловушки" для NF-kB может быть использована для терапии диффузных дерматитов. Следует отмстить, что в 2008 году была завершена II стадия клинических испытаний препарата, содержащего "ДНК-ловушку" для транскрипционного фактора NF-kB, в которой участвовало 75 пациентов с легкой и средней степенями атонического дерматита. Была продемонстрирована эффективность и перспективность мази, содержащей "ДНК-ловушки" для его лечения (см. www.clinicaltrials.Eov).
Другой исследуемой мишенью для "ДНК-ловушек" являются транскрипционные факторы семейства E2F, регулирующие экспрессию генов, связанных с программированием клеточного цикла, ростом и выживаемостью клеток [76]. Известно, что фактор E2F-1 является важным регулятором перехода из G1 в S фазу клеточного цикла [86], поэтому некоторые исследователи изучали его в качестве мишени для "ДНК-ловушек" в регулировании пролиферации клеток. Неоиптимальпая гиперплазия, характеризующаяся стенозом и сопутствующим тромбозом, является важной причиной для последующего отказа имплантированных протезов сосудов. Для решения этой проблемы было предложено использовать " ДНК-ловушки" для транскрипционного фактора E2F. В исследованиях па моделях трансплантатов животных (крысы, кролики и приматы) было показано, что использование "ДНК-ловушки" для фактора E2F приводит к ингибированию генов c-myc, CDC- 2 и PCNA [87-88], снижению уровня пролиферации гладко мышечных клеток и образованию неоинтимы в течение 6 месяцев после операции [89]. Препарат edifoligide представляет собой фосфоротиатный ОДН-дуплекс, в котором комплементарны 10 из 14 оснований, эффективно связывающийся с фактором E2F [87]. Исследователи надеялись использовать edifoligide для увеличения срока службы венозных шунтов. Однако в клинических испытаниях PREVENT III/IV оказалось, что edifoligide не обладает достаточной эффективностью в ингибировании формирования неоинтимы и проходимости протезов сосудов у пациентов после реваскуляризацпн нижних конечностей [90] и перенесших коронарное шунтирование [91].
Выделение ДНК и ОДЫ из геля при помощи электроэлюции
Реакционная смесь содержала 50 нг ПЦР-продуктов и 10-250 нг вектора pBlueScript II KS. полученных в результате гидролиза рестриктазами ВатШ и EcoRl, в буфере 40 мМ Трис-HCl, рН7.8, lOMMMgCb, 10 мМ дитиотреитол, 0.5 мМ АТФ, 5% ПЭГ 4000 и 10 ед.акт. Т4 ДНК-лигазы. Реакцию лигнрования проводили в объеме 25 мкл в течение 12-16 ч при 4С. Перед электропорацией клеток Е. coli к лигазным смесям добавляли 1/10 объема 3 VI раствора CHjCOONa, рН 5.0 и осаждали продукты лигнрования добавлением четырех объемов 96% С2Н5ОН в течение 12 ч при -2()С. После центрифугирования растворяли осадок ДНК в 20 мкл деиопизовапной IЬО. 2.3.17. Получение супериатаптов для определения распределения [32Р] - меченых олигонуклеотидов в клетках
Для исследования распределения олигонуклеотидов в клетках HUVEC, клетки за 16-20 ч рассеивали в 12-луночныс планшеты в плотности 60-70% от клеточного монослоя. Перед экспериментом клетки дважды отмывали средой ДМЕМ и инкубировали с 0.026-1 мкМ раствором олигонуклеотида (удельная радиоактивность ОДН составляла 5-Ю Ки/мМ) в среде ДМЕМ в течение различных промежутков времени (от 30 мин до 4 ч) при 37С, 5% С02. После инкубации из лунок удаляли культуральную среду и клетки дважды промывали средой ДМЕМ. Клетки отмывали буфером PBS-ЭДТА в течение 3 мни при комнатной температуре и собирали супернатант, оставшиеся клетки обрабатывали 0.125% раствором трипсина в течение 2 мин с последующей инактивацией фермента добавлением 1/10 объема эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 3000 об/мин, супернатант (трипсиновый элюат) переносили в отдельные пробирки, осадок клеток ресуспепдировали в 20 мкл лизирующего буфера, содержащего 0.6% NP-40, 50 мМ Трис-HCI, рН7.5. 0.15 М NaCI, 5 мМ NaF, I мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА. Клетки инкубировали 5 мин на льду и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин для разделения мембранно-цитозолыюй (МЦ) и ядерной (Я) фракций. Супернатант, содержащий мембранио-цитозольную фракцию, переносили в другие пробирки, осадок ядер ресуспепдировали в 20 мкл лизирующего буфера. Полученные фракции прогревали 10 мин при 100С и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Из приготовленных фракции (PBS-ЭДТА элюат, трипсиновый элюат, мембранно-цитозолыюй и ядерной фракций) отбирали аликвоты одинаковые по объему и измеряли радиактивность каждой аликвоты по Черепкову в течение 1 мин с последующим пересчетом на количество олигонуклеотида в зависимости от объема полученных фракций (трипсиновый элюат. мембранпо-цигозолыюй и ядерной фракций). Другой способ получения данных: из супериатаптов и клеточных фракций аликвоты одинаковые по объему (70 мкл) наносили на кружки ватмана ЗММ диаметром 1 см. высушивали и экспонировали в кассете для фосфоимеджера. Количество ОДН во фракциях определяли как интенсивность сигнала в пятне, используя в качестве калибровки раститровку [ Р]-меченого олигонуклеотида от 10"14до I О"12 моль.
Эксперименты проводили в трех независимых повторах. 2.3.18. Выделение ДНК и определение концентрации при помощи флуоресцентного метода
ДНК выделяли при помощи коммерческих китов "BioSilica" по методике, рекомендованной фирмой-производителем. Для определения концентрации ДНК аликвоту образца смешивали с равным объемом раствора, содержащим 20 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 2 мМ ЭДТА, 0.4 М NaCI, 0.2 мкг/мл красителя Hoechst 33258. Раствор ДНК инкубировали с флуоресцентным красителем в течение 15 мин при компатноіі температуре в полистирольных кювегах (LKB). Флуоресценцию измеряли при комнатной температуре на флуориметре VersaFluor (Bio-Rad) на длинах воли возбуждения 360 им. испускания 460 им для флуоресцентного красителя Hoechst 33258. Концентрации нуклеиновых кислот определяли по калибровочным кривым. Для построения калибровочной кривой использовали растворы с концентрацией ДНК 0. 10, 20. 50. 100. 200 нг/мл.
Для выделения РНК использовали мембранно-цитозольїіую фракцию клеток, полученную по методике, описанной в пункте 2.3.17. раздела "Материалы и Методы". РНК выделяли сорбцией на сгекловолокнистых сорбентах, для этого к одному объему образца добавляли 1.5 объема буфера для сорбции, содержащего 1.25 М гуанидина тиоцианага, 31% этилового спирта, 12.5 мМ Трис-ацетат, рН 6.5, и интенсивно перешивали. На предварительно отмытые буфером-1 (1 М гуанидина тиоцианата, 25% этилового спирта, 10 мМ Трис-ацетат, рН 6.5) микроколонки (Биосилика, Россия) наносили образец и центрифугировали в центрифуге Eppendorf 5415С при 1 000 об/мин в течение 1 мин. После этого колонки дважды промывали 300 мкл буфера-1 центрифугированием в центрифуге Eppendorf 5415С, затем дважды промывали 300 мкл буфера-2 (70 % этиловый спирт, содержащий 100 мМ NaCI, 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5). РНК со стекловолокнистого сорбента микроколонок элюировали с помощью 200 мкл раствора элюции (Биосилика, Россия) в течение 5 мин. После инкубации мнкроколонки центрифугировали сначала при 1 000 об/мин в течение 1 мин. а затем при 12 000 об/мин в течение I мин и собирали супернатант. содержащий РНК. 2.3.20. Экспрессия тканеспецифических генов в культуре эукариотических клеток
Для определения экспрессии тканеспецифических генов-маркеров в культуре клеток использовали метод ОТ-ПЦР.
Для синтеза кДПК определенного гена в качестве матрицы использовали суммарную РНК, выделенную по методике, описанной в пункте 2.3.19. раздела "Материалы и Методы". В пробирке смешивали 10-100 нг суммарной РНК с 15 пикомолями обратного праймера (Rc\,Dfi-akt, RevvWF, Rev E-sel) к мРНК гена, при необходимости доводили объем смеси до 13 мкл денонизованной ІЬО, смесь инкубировали 5 мин при 70С, затем охлаждали на льду в течение 10 мин. После охлаждения к смеси добавляли 2 мкл 10 мМ смеси (INTO и 4 мкл буфера, содержащего 250 мМ Трис-HCl, рН 8.3, 250 мМ КС1. 20 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотреитол, полученную смесь прогревали 5 мин при 37С, затем в пробирку вносили 10 ед.акт. M-MuLV обратной транскриптазы и инкубировали реакционную смесь в течение 1 ч при 42С.
Для амплификации кДНК гена реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 1/3 часть реакционной смеси, полученной в результате синтеза кДНК, 125 мкМ каждого сШТФ, 0.6 мкМ прямого праймера (Forw -akt, Forw vrFF, Forw ii-лг /) и 0.6 мкМ обратного праймера (Revlfi-akt, Rev vfFF, RevlE-se!), буфер 75 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 2.5 мМ (NH4)2S04, 3.5 мМ MgCb, 0.01% Tween 20. 2 мг/мл BSA и 1 ед.акт. Taq ДНК-полимеразы.
Амплификацию р-актина проводили в следующем режиме: 25 циклов, денатурация -20 сек при 95С. отжиг праймеров - 30 сек при 60С, элонгация - 25 сек при 72С, последний цикл: денатурация - 20 сек при 95С, отжиг праймеров - 30 сек при 60С, элонгация - 5 мин при 72С. Амплификацию Е-еелектина и фактора фон Виллсораида проводили в следующем режиме: 35 циклов, денатурация - 20 сек при 95С, отжиг праймеров - 30 сек при 65С, элонгация - 30 сек при 72С, последний цикл: денатурация -20 сек при 95С. отжиг праймеров - 30 сек при 65С, элонгация - 5 мин при 72С. Продукты амплификации анализировали электрофорезом в нативном 6% ПААГ в буфере ТБЕ с последующей визуализацией ДНК бромистым этидием.
Цитирование ПЦР-продуктов в плазмиду pBlueScript II KS но липким концам
Оптимизация условий выделения спкДНК из состава нуклеопротеиновых комплексов с поверхности клеток. Трипсиновый элюат инкубировали с BrCN-сефарозой, полученный сорбент отмывали для элюции низко- и высокоаффинпых ДНК, выделяли нуклеиновые кислоты из предварительно прогретых элюатов или прогретых сорбентов, затем фосфорилировали ДНК при помощи Т4-полинуклеотидкиназы в присутствии [у- ,2Р]-АТФ. Радиоавтограф денатурирующего 16% ПААГ. Дорожка 1 - ДНК, связанные с сорбентом, после отмывки сорбента PBS, дорожка 2 - ДНК, связанные с сорбентом после отмывки раствором PBS-ЭДТА, дорожка 3 - ДНК, связанные с сорбентом после его отмывки последовательно раствором PBS-ЭДТА и раствором PBS с 0.5М NaCl, дорожка 4 - ДНК. элюированные с сорбента 50 мМ раствором NHVHCOOH (рН 2.5). Из рисунка 8 видно, что обработка сорбента раствором P13S с хелатирующим агентом ЭДТА (дорожка 2) и последовательные отмывки сорбента растворами PBS с ЭДТА и PBS с 0.5М NaCl (дорожка 3) приводят к ступенчатому удалению основной части ДНК, связанных с сорбентом, по сравнению с исходным образцом ДНК, связанных с сорбентом (дорожка 1). Тот факт, что обработка сорбента раствором PBS с 0.5М NaCl не приводит к элюции ДНК, свидетельствует о том, что такие ДНК достаточно "прочно" связаны с сорбентом. Было показано, что фрагменты спкДНК, "прочно связанные с сорбентом, могут быть элюированы при помощи обработки сорбента 50 мМ раствором NH;,/HCOOH (рН 2.5), за счет изменения заряда белков, связывающих нуклеиновые кислоты (рисунок 8, дорожка 4). Таким образом, были подобраны условия выделения скпДІ IK из иуклеопротеиновых комплексов с поверхности клеток HUVEC.
Следует отметить, чю после электрофоре гического разделения фракции выделенных скпДНК с сорбента, из геля могут быть выделены [32Р]-меченые одпоцепочечные ДНК при помощи электроэлюции с дальнейшей идентификацией последовательностей ДНК фрагментов. Таким образом, было показано, что предложенный подход может быть использован для выделения коротких фрагментов ДНК, "прочно" связанных с НК-связынающими белками трннсинового элюата, и оптимизированы условия их выделения.
Данная часть работы выполнена совместно с Лактионовым П.П., Пышным Д.В. и Власовым В.В.
Для определения последовательностей коротких фрагментов ДНК, полученных из состава нуклеопротеиновых комплексов с поверхности HUVEC, необходимо иметь достаточное количество исходного материала для последующих манипуляций, таких как клонирование и секвенирование. Следует отметить, что в результате использования предложенного метода выделения были получены одпоцепочечные ДНК; поскольку выделить фрагменты двуцепочечных ДНК из полученных препаратов нам не удалось (данные, полученные при помощи электрофореза в недснатурирующих условиях при 4С, было трудно интерпретировать). Количество фрагментов оцДНК, полученное нами в результате выделения, не позволяло напрямую лигировать их в одпоцепочечные вектора для последующего клонирования. Таким образом, необходимо было амплифицировать полученные фрагменты оцДНК для того, чтобы получить такое количество фрагментов дцДНК, которого было бы достаточно для клонирования.
Для введения радиоактивной метки короткие фрагменты спкДНК денатурировали и выделяли из денатурирующего нолиакриламидного геля при помощи электроэлюции, получая в результате радиоактивно меченые оцДНК (раздел "Материалы и методы" пункты 2.3.3. и 2.3.7.). Для амплификации таких оцДНК необходимо было к 5 - и З -концам этих молекул лигировать фланкирующие олигонуклеотиды (F-ОДН). В результате такого лигирования продукт, состоящий из неизвестной последовательности оцДНК. фланкированной олигонуклеотидами известных последовательностей, мог бы быть амплифицирован при помощи ПЦР с праймерами, которые комплементарны фланкирующим олигонуклеотидам. Таким образом, в результате выше описанных процедур можно получить достаточное количество ДНК материала для клонирования.
Нами были предприняты попытки лигировать к З -концам фрагментов оцДНК (Т-ОДН) фланкирующие олигонуклеотиды З -Р-ОДН в условиях известных протоколов [180-181, 186-187], основанных на использовании Т4 Р11К-лигазы (рисунок 9). " - продукт р-ции
Рисунок 9. Влияние концентрации одноцепочечной мишени (Т-ОДН) на эффективность лигирования радиоактивно-меченого З -Р-ОДН Т4 РНК-лигазой. Т-ОДН в различных концентрациях (0.1, I и 10 мкМ) лигировали с 10 мкМ фланкирующим З -Р-ОДН в присутствии 20 сд.акт. Т4 РПК-лигазы в течение 5 часов при комнатной температуре. Радиоавтограф денатурирующего 20% ПААГ. Дорожка 1 — лигазная смесь 3 -F-OflH с 0.1 мкМ Т-ОДН, дорожка 2 - лигазная смесь 3 -F-OflH с 1 мкМ Т-ОДН, дорожка 3 - лигазная смесь З -Р-ОДН с 10 мкМ Т-ОДН.
Образование продукта лигирования Т-ОДН с фланкирующим ОДІ І не более 8% наблюдали при 10 мкМ концентрации неизвестной оцДНК (рисунок 9, дорожка 3). При концентрации неизвестной последовательности оцДНК менее 10"9 М данные условия лигирования не позволяли получить продукт лигирования (рисунок 9, дорожки 1 II 2). Поскольку полученное нами количество фрагментов оцДНК по оценочным данным не превышало Ю 11 моль, то необходимо было разработать новый более эффективный метод лигирования фланкирующих олигонуклеотидов.
В качестве прототипа метода лигирования была выбрана схема, описанная Клепетом с соавторами [189], и используемая для лигирования фланкирующего олигонуклеотида из состава адаптера к 5 -концам молекул мРНК с помощью Т4 ДІ 1К-лигазы. Предложенный метод основан на использование адаптора, состоящего из двух олигонуклеотидов, один из которых представляет собой гибридный олигопуклеотид 5 -(ДНК)п:(РНК)б-3 (фланкирующий ОДЫ), а другой олигопуклеотид частично комплементарен З -концу гибридному F-ОДН и имеет выступающий рандомизованный 5 -конец.
На основе данного подхода мы предложили следующую схему лигирования фланкирующих олигонуклеотидов из адаптеров к концам оцДНК (рисунок 10). В случае ферментативного присоединения фланкирующего ОДН к З -концу [32Р]-меченых оцДНК адаптер состоит из двух ОДН: З -Р-ОДН, несущего 5 -фосфатную группу и З -блокатор (deg), и другой ОДН, называемый сближающим (С-ОДН), частично комплементарен фланкирующему 3 -F-OflH. пмеющиіі на З -конце выступающую раидомизованную последовательность из 5/6 нуклеотидов и блокатор (deg). Продукт лигирования З -Р-ОДН к З -концу [32Р]-меченых оцДНК ([32Р]-оцДНК-(Р-ОДН)) выделяли после электрофоретпческого анализа при помощи электроэлюцни, как описано в пункте 2.3.3. раздела "Материалы и методы". Затем к 5 -концу [32Р]-оцДНК-(Р-ОД11) лигировали фланкирующий ОДН из адаптора. который состоит из 5 -F-ОДН с гидроксильпыми группами на 3 - и 5 -концах, а также С-ОДН, несущего З -блокатор (deg) и на 5 -конце выступающую раидомизованную последовательность из 5/6 нуклеотидов. В результате ферментативной реакции получали продукты [ Р]-меченые оцДНК фланкированные по 3 - и 5 -концам ОДН известной последовательное, которые могли в дальнейшем наработать в нужном количестве при помощи ПЦР.
Выделение, амплификация, клонирование и секвенпровапне коротких ДНК с клеточной поверхности эндотелноцитов
Из полученных данных видно (таблица 12), что ОДЫЗ (содержащий в своей последовательности К5-ОДН) и ОДН4 (содержащий К1-ОДН) эффективнее связываются с клеточной мембраной клеток HUVEC при концентрации 26нМ, чем контрольный ОДНІ и ОДН2 (содержащий КЗ-ОДН). Следует отметить, что количество ОДН. связанного с поверхностью эндотелиальных клеток, для протяженных ОДН как минимум в 1.3 раза выше по сравнению с короткими ОДН при 0.25 мкМ и 1 мкМ концентрациях ОДН в инкубационной среде.
Кажущиеся константы ассоциации для связывания ОДН с первичными эндотелиоцитами определяли в линейном диапазоне координат Скзтчарда. Поскольку при ІмкМ концентрации ОДН наблюдается не сиквенс-специфическое связывания ОДН с клетками, то эту точку не учитывали в оценки константы ассоциации. Кажущиеся константы ассоциации с клеточной поверхностью эндртелиоцитов для ОДІ 13 и ОДН4 больше по сравнению с ОДН2 и контрольным ОДНІ и составляют 1.7 105 М"1. Полученные значения кажущихся констант ассоциации связывания ОДН с эндотелиоцитами сопоставимы с литературными данными для взаимодействия ОДН с белками клеток [13, 196]. Увеличение константы связывания ОДН4 с клетками по сравнению с константами для ОДНІ и ОДН2 может быть следствием того, что ОДН4 способен образовывать не только шпилечные структуры, эффективно взаимодействующие с клеточной мембраной, по димеры с Тт = 38С (рисунке 21). В случае образования димеров последовательность К1-ОДН локализована на выступающих. не комплементарных концах такого дуплекса. Логично предположить, что такая локализация последовательности К1 -ОДН может приводить к одновременному связыванию такого дуплекса ОДН4 с двумя рецепторами, что, возможно, и обеспечивает увеличение прочности связывания с клеточной поверхностью. Олигонуклеотид ОДНЗ аналогичным образом способен образовывать димеры, как и олигонуклеотид ОДН4. только в его случае на выступающих концах дуплекса локализованы последовательности К5-ОДН, который эффективно связывается с клеточной поверхностью, как было показано в пункте 3.7. раздел "Результаты экспериментов и их обсуждение".
Па основании полученных данных, можно сделать вывод: ОДГІЗ и ОДІІ4 связываются с поверхностью эндотелиальных клеток наиболее " прочно" по сравнению с контрольным ОДНІ, что доказывает сиквенс-специфнческое взаимодействие этих О Дії с мембраной клеток. Об этом, свидетельствуют и значения их кажущихся констант связывания, поскольку сиквеис-иезависимое связывание олигонуклеотидов с белками клеточной поверхности характеризуется константами диссоциации нуклеопротеиновых комплексов порядка 10"3 М [13]. В силу того, что транспорт олигонуклеотидов в клетки является рецептор-опосредованным [45, 146], был исследован транспорт и внутриклеточная локализация флуоресцентно-меченых производных этих олигонуклеотидов.
Радиоизотопный анализ позволяет получать адекватные количественные данные о связывании олигонуклеотидов с клетками, однако не представляет информации об их внутриклеточной локализации. Наиболее распространенным методом исследования внутриклеточной локализации олигонуклеотидов в настоящее время является флуоресцентная микроскопия. Известно, что модификация ОДН флуоресцирующими группами может влиять на свойства олигонуклеотидов. Так, например, модификация 5 -концевого фосфата олигонуклеотида приводит к изменению набора белков клеточной поверхности, связывающих этот олнгонуклеотид [52J. Для исследования транспорта олигонуклеотидов в клетки были синтезированы олигонуклеотиды ОДНІ, ОДНЗ и ОД114, модифицированные флуоресцеином по 5-му положению пиримидннового кольца тимидина и содержащие на З -копце инвертированный " дезокситимидин (,,„Т). Флуоресцентно-меченый тимидин вводили в середину последовательности ОДН и в положения, не входящие в состав выявленных ДНК-мотивов (18, 17 и 15 нуклеотид с 5-конца последовательностей ОДНІ. ОДНЗ и ОДН4, соответственно). Для оценки влияния модификации на транспорт олигонуклеотидов в клетки была использована проточная цнтофліоорометрия (данные проточной цитофлюорометрии представлены на рисунке 22).
Было показано, что эффективность проникновения ОДН, модифицированного флуоресцеином (Flu), в клетки зависит от времени инкубации олигонуклеотида с клетками и от нуклеотидной последовательности ОДН. Из рисунка 22 следует, что наиболее эффективно в клетки проникают контрольный ОДНІ-Flu и ОДНЗ-Flu, что совпадает с данными, полученными при помощи радиоизотопного метода (рисунок 20). Полученные данные для олигонуклеотида ОДНІ-Flu совпадают с данными описанными в работе [150]. в которой было показано, что для этого олигонуклеотида характерно эффективное проникновение в В-клетки. Таким образом, транспорт олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцеином, в клетки не отличается от транспорта немодифицированных олигонуклеотидов, и они могут быть использованы для исследования внутриклеточной локализации методом флуоресцентной микроскопии.
Эффективность проникновения флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов в эндотелиоциты в зависимости от времени инкубации клеток с ОДН. Клетки инкубировали в присутствие 0.5 мкМ флуоресцентно-меченым ОДН 30 мин или 120 мин при 37С, 5% СОг. Затем клетки отмывали, снимали с поверхности планшета и фиксировали 2% формальдегидом. Флуоресценцию образцов измеряли при помощи проточного цитометра Cytomics FC-500. Количественные данные нормированы на 50000 клеток и представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.
