Введение к работе
з
В потоке научной литературы, посвященной активированному кислороду, существует множество работ,выполненных на объектах животного происхождения, а растительным организмам и клеткам уделяется сравнительно мало внимания. Между тем, именно эти организмы способны к активному выделению кислорода, наиболее богаты пигментами-сенсибилизаторами, отличаются высокой реакционной способностью молекулярных компонентов и обладают развитой защитной системой.
В течение своей жизни растения постоянно подвергаются различным стрессовым воздействиям. Одна из самых ранних стрессовых реакций - это образование ряда активных форм кислорода (супероксидный анион-радикал, пероксид водорода, гвдроксильный радикал и т.д.), которые могут выполнять роль вторичных посредников, а также другие функции в ходе развития адаптации клеток после воздействия.
Постановка проблемы, ее актуальность. Чрезвычайно широкий спектр биохимических эффектов активных метаболитов кислорода, в частности супероксидного аниона, объединяет все возрастающий интерес к влиянию их на функциональную активность клеток. Супероксид является собственным метаболитом клетки и образуется в результате одноэлектронного восстановления кислорода, катализируемого оксидазами. Особый интерес представляет НАД(Ф)Н оксидаза, локализованная в плазматической мембране. Было показано, что при фагоцитозе чужеродных веществ резко увеличивается поглощение кислорода. Это явление получило название "дыхательного взрыва". Позднее оказалось, что образование супероксида (и других активных форм кислорода) присуще не только фагоцитирующим клеткам, но происходит и в других типах клеток. Особое внимание в настоящее время уделяется быстрой продукции активных форм кислорода (АФК) с последующим каскадом ответов растительных клеток при воздействии биотических и абиотических стрессоров. Считается, что продукция супероксидного аниона и пе-роксида водорода является одним из ранних событий, происходящих при патогенной атаке растительных клеток (Bolwell et. al., 1995; Murphy and Ouh, 1996; Alvarez et. al., 1998). Получены данные об индукции окислительного стресса при действии
низкой температуры в развивающихся проростках кукурузы (Prasad, 1996), засухи - в растениях гороха (Могап et. al,, 1994), раневого повреждения листьев картофеля (Мерзляк и др., 1991), при гипоосмотическом и механическом стрессах (Cazale et al., 1998).
Выявление возможных источников продукции АФК является важным подходом к регуляции их уровня в клетках при стрессовых воздействиях. Изучение особенностей генерации супероксидного анион-радикала (супероксида) может внести существенный вклад в расшифровку механизмов адаптивных реакций растительных клеток.
Пель и задачи исследования. Основной целью исследований было выявление образования супероксидного анион-радикала и источников его генерации на клеточной поверхности в ответ на стрессовое воздействие.
Были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать образование супероксида в ходе формирования адаптации отсеченных корней и чувствительность этого процесса к ингибитору суперок-сиддисмутазы дютилдитиокарбамату натрия (ДДК) на разных фазах адаптации.
-
Выявить роль редокс-системы плазмалеммы в генерации супероксида на клеточной поверхности с использованием непроникающих в клетки доноров
. электронов (НАДФ-Н, НАД-Н, ферроцианид) и ингибиторов ферментов, участвующих в этом процессе.
-
Показать участие супероксида в детоксикации ксенобиотика амидопирина.
-
Показать участие пероксядазы клеточной поверхности в генерации супероксида.
,5. Изучить влияние на образование суиероксида ряда органических кислот. 6. Выявить взаимосвязь между генерацией супероксида и тепловыделением корневых клеток. Научная новизна работы.
Впервые выявлена динамика генерации супероксида в ходе развития адаптивного старения корневых клеток и показана положительная корреляция его образования с изменениями проницаемости плазмалеммы для ионов калия и изменением мембранного потенциала.
Впервые предположено существование на поверхности клетки флавина, который генерирует супероксвд и может принимать участие в реакциях детоксика-ции, в частности детоксикации ксенобиотика амидопирина.
Показано, что пероксидаза клеточной поверхности участвует в генерации супероксида. Данный процесс может активироваться рядом органических кислот. Стимулирующее действие органических кислот на образование супероксида может быть связано с ингибированием каталазы, а также с изменением поверхностного заряда плазмалеммы, или путем проявления кислотами детергентных свойств. Индуцируемое органическими кислотами вымывание растворимой фракции перокси-дазы во внеклеточный раствор приводит к активации данного фермента.
Впервые выявлена сопряженность генерации супероксида и общего тепловыделения корневых клеток. Вклад в тепловыделение вносит рекомбинация кислородных радикалов и окислительные процессы с участием супероксида. Практическая ценность работы. Полученные результаты могут служить теоретической и методической основой для исследований проблемы функциональной значимости активных форм кислорода в формировании адаптации и ее срыва при неблагоприятных воздействиях. В работе намечены дальнейшие пути решения задач по выявлению механизмов регуляции систем, генерирующих активные формы кислорода.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на итоговых конференциях и семинарах КИББ КНЦ РАН (1997, 1999, 2000 гг.), на Втором съезде биохимического общества Российской Академии Наук (Москва, 1997), на VI молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (1997), на международной конференции "Plasma membrane redox systems and their role in biological stress and disease" (Антверпен, Бельгия, 1998), на европейской конференции "Oxygen, free radicals and oxidative stress in plants" (Гранада, Испания, 1998), на международной конференции "Biothermodynamics: molecular, organismal, and Ecological" (Юта, США, 1999), на Всероссийской молодежной научной конференции "Растение и почва" (Санкт-Петербург, 1999), на 5 международной конференции "Plasma Membrane Redox and its Role in Biological Stress and Disease" (Гамбург, Германия, 2000), на Всероссийской конференции молодых ученых "Молодые ученые — агропромышленному комплексу" 28-29 марта (Казань, 2000), на школе-конференции "Горизонты физико-
химической биологии" 28 мая - 2 июня (Пущино, 2000), на Международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" 6-9 июня (Пущино, 2000)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ в отечественных и зарубежных журналах и материалах конференций.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на Юз страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения и выводов. В работе представлено 26 рисунков. Список литературы включает 177 источников, в том числе 57 -отечественных.
