Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1 .Лектины растений 13
1.1.1.Общие сведения о лектинах 13
1.1.2.Физиологическая роль лектинов в растении 19
1.1.3.Гормональная регуляция содержания лектинов в растениях 31
1.2.Ответные реакции растений на биогенный стресс 35
1.2.2. Влияние микоплазменной инфекции на растения 38
1.2.3. Роль салициловой кислоты в реакциях патогенеза у растений 41
1.3.Физиологические механизмы низкотемпературной адаптации растений 46
1.3.1. Рецепция температурного сигнала 46
1.3.2. Стрессовый фитогормон АБК и его роль в адаптации растений к низкой положительной температуре 48
1.3.3. Кальциевая сигнальная система и ее роль в регуляции стабильности цитоскелета 50
1.4. Кортикальный цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка как единый структурный поверхностный аппарат клетки 57
2. Объекты и методы исследования 67
2.1 Объекты исследования 67
2.2 Схема опытов 68
2.3 Выделение лектинов 72
2.4.Определение активности лектинов 75
2.5.Определение митотического индекса 76
2.6.Приготовление реагента Ярива 77
2.7.0пределение морозоустойчивости растений 77
2.8.Электрофоретическое разделение белков 78
2.9.Регуляторы роста 78
2.10.Модификация компонентов цитоскелета в клетках растений 79
3. Результаты исследований и их обсуждение 82'
3.1. Активность лектинов при действии на растения низких температур .82
3.1.1. Сравнение лектиновой активности в проростках озимой пшеницы контрастных по холодоустойчивости сортов 82
3.1.2. Изменения активности лектшюву разных сортов озимой пшеницы в процессе низкотемпературной адаптации 87
3.1.3. Фракционный состав лектинов клеточной стенки 99
3.1.4.Изменение состава лектинов клеточной стенки в процессе низкотемпературного закаливания растений 103
3.2. Активность лектинов при действии на растения микоплазменной инфекции в условиях оптимальных температур и гипотермии 115
3.2.1 Влияние инфицирования микоплазмами на активность лектинов растений пшеницы, выращенных в оптимальных условиях 115
2.2.2. Изменения активности лектинов при инфицировании растений микоплазмами в условиях гипотермии 128
3.3. Роль гормонов и их структурных аналогов в регуляции активности лектинов 130
3.3. 1. Влияние АБК на активность лектинов озимой пшеницы и показатель морозоустойчивости LT50 130'
3.3.2. Действие картолина на активность лектинов 136
3.3.3.Влияние картолина и АБК на митотический индекс и относительную длительность .фаз митоза ...141
3.3.4. Влияние салициловой кислоты на активность лектинов и морозоустойчивость растений озимой пшеницы 147
3.3.5. Влияние салициловой-кислоты на активность лектинов в проростках озимой пшеницы при действии микоплазменной инфекции.. 151
3.4. Активность и состав лектинов клеточной стенки при действии ингибиторов кальциевой сигнальной системы 158
3.5. Цитоскелет-зависимые изменения активности лектинов 169
3.5.1. Влияние модификаторов микротрубочек на активность лектинов.. 169
3.5.2. Влияние АБК на оризалин-индуцированные изменения активности лектинов 180
3.5.3. Влияние картолина на активность лектинов обработанных оризалином растений 185
3.5.4. Влияние цитохалазина Б на активность лектинов 191
3.5.5. АБК-зависимые изменения активности лектинов у обработанных цитохалазином Б растений 200
3.5.6. Са2+-зависимые изменения активности лектинов при действии оризалина 207
3.6. Влияние оризалина на митотический индекс и относительную длительность фаз митоза 212
Заключение 225
Выводы 235
Список литературы 237
- Стрессовый фитогормон АБК и его роль в адаптации растений к низкой положительной температуре
- Кортикальный цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка как единый структурный поверхностный аппарат клетки
- Изменения активности лектшюву разных сортов озимой пшеницы в процессе низкотемпературной адаптации
- Активность и состав лектинов клеточной стенки при действии ингибиторов кальциевой сигнальной системы
Введение к работе
Изучение механизмов адаптации растений к изменяющимся условиям среды тесно связано с решением проблемы устойчивости и интродукции растений. Повышение устойчивости сельскохозяйственных культур к болезням и другим неблагоприятным факторам является одной из важнейших проблем растениеводства.
В период роста и развития растения испытывают комплексное воздействие нескольких стресс-факторов (абиогенных и биогенных), напряжение которых непрерывно меняется. В последнее время появляются данные, свидетельствующие об участии лектинов в ответных реакциях растений на неблагоприятные условия внешней среды, в' том числе на действие низких температур и инфицирование патогенами (Комарова и др., 2000; Хайруллин, 2001).
Лектииы относятся к самостоятельной группе белков (гликопротеинов), характерной особенностью которых является способность специфически и обратимо связывать углеводные лиганды. Они содержатся во всех живых организмах, поэтому изучение функций лектинов, большинство из которых остаются дискуссионными, имеет общебиологическое значение и привлекает пристальное внимание исследователей (Шакирова, Безрукова, 2007; Van Damme et al., 2004a, 6; Holf et al., 2009).
В настоящее время система углевод-белкового узнавания рассматривается как дополнительная к генетическому коду. В пептидах и олигонуклеотидах информация кодируется соответственно числом аминокислот или нуклеотидов и их последовательностью, тогда как в случае углеводных структур информация кодируется не только числом и последовательностью углеводных остатков, но также их аномерной конфигурацией и порядком связи друг с другом. Благодаря этому, углеводные цепи обладают уникальными возможностями в плане кодирования информации. Лектины имеют замечательную способность
выбирать из всего разнообразия углеводных структур только определенные и, таким образом, воспринимать информацию, зашифрованную в углеводных' структурах. Последующее связывание лектина с углеводным рецептором приводит к изменению сигналов в данной биологической системе (Belogortseva et al., 1999; Robinson et al., 2006; Garner, Baum, 2008).
В последнее время существование в клетках животных специфической' лектинзависимой системы регуляции клеточных функций не подвергается, сомнению. Предполагают существование подобной- системы* и в растениях (Holfetal.,2009).
В- литературе накоплено достаточно данных, свидетельствующих об изменении активности лектинов' под влиянием различных стрессорных факторов и возможнойфоли этих белков в формировании неспецифических защитных реакций растений. Имеются сведения о значительном повышении гемагглютинирующей активности лектинов і при поранении (Любимова, 1991), воздействии низких температур (Комарова и др., 1999), усилении синтеза и повышении уровня лектинов при инфицировании фитопатогенами* (Gibson et al., 1982; Шакирова и др., 1990; Шакирова, 1999), гипертермии (Spadoro-Tank, Etzler, 1988; Шакирова и др., 1995; Shakirova et al., 1996), засухе и осмотическом шоке (Cammu et al., 1989), засолении среды (Шакирова и др., 1993), а такжеиоб индукции экспрессии генов лектинов при дефиците влаги (Singh et al., 2000), раневом (Zhu-Salzman et ah, 1998)- и солевом (Zhang et al., 2000) стрессах. В то же время известно, что лектины являются многофункциональными белками, участвующими в различных ферментативных, рецепторных, транспортных и других процессах (Ferens-Sieczkovska et al.,' 1989; Gordon et al., 1998; Clark et al., 1999; Van Damme et al., 2004; Bezrukova et al., 2008).
Однако, несмотря на интенсивное изучение функций лектинов совершенно отсутствуют данные о механизмах регуляции их активности.
Во-первых, важную роль в этих процессах могут играть фитогормоны. При действии различных стресс-факторов биогенной и абиогенной природы
7 изменяется гормональный статус растений в сторону повышения содержания стрессовых фитогормонов, в частности, абсцизовой кислоты (АБК). Ей отводится ключевая роль в индукции синтеза более десяти стрессовых белков. Показано, что накопление АЗП (агглютинина зародыша пшеницы) — наиболее хорошо исследованного растворимого лектина пшеницы — также индуцируется этим фитогормоном (Cammue et al., 1989). Наряду с АБК регулятором содержания АЗП могут выступать и другие гормоны (Шакирова,2001).
Во-вторых, обладая высокой специфичностью к углеводным детерминантам сложных гликоконыогатов (Rudiger, 1997), лектины, по-видимому, могут принимать участие в осуществлении контактов между плазмалеммой pi клеточной стенкой. По современным представлениям, плазмалемма взаимодействует с элементами цитоскелета с помощью белков, ассоциированных с микротрубочками и микрофиламентами, образуя в клетке единую мембранно-цитоскелетную систему (Lloyd et al., 1996; Медведев, Маркова, 1998).
Благодаря способности быстро перестраиваться под влиянием внешних и внутренних факторов цитоскелет определяет пространственную организацию и координацию многих клеточных процессов (Клячко, 1998; Quader, 1998). Взаимодействия между цитоскелетом, плазмалеммой и белками клеточной стенки играют ключевую роль в восприятии и проведении внешнего сигнала в различные компартменты клетки путём создания динамической механической связи из компонентов цитоскелета (Nick, 1999; Туркина, Соколов, 2001; Хохлова, Макарова, 2006). Большое значение в трансдукции сигналов имеет связь микрофиламентов с компонентами фосфатидилинозитольного цикла (Tan, Boss, 1992). Можно предположить, что процессы динамической сборки и разборки мрікротрубочек принимают участие в регуляции активности лектинов.
В-третьих, как правило, первичным ответом клетки на действие различных биогенных и абиогенных стрессоров, является активация сигнальных систем. Особое значение в рецепции и проведении сигнала отводят арабиногалактановым белкам (АГБ) клеточной поверхности, которые могут быть как адгезивными, так и сигнальными молекулами. Предполагается, что АГБ либо с участием мембранных липидов (Sardar et al., 2006; Sardar et al., 2007), либо трансмембранных белков, таких, как киназы, ассоциированные с клеточной стенкой (WAKs), формины, целлюлозосинтаза, фосфолипаза Д, эндо-1,4-глюканаза (Sardar et al., 2006; Sardar et al., 2007), рецепторные киназы с лектиновым доменом, LecRK, (Gouget et al., 2006), каллозосинтаза, миозины (Baluska et al., 2003), передают сигнал от клеточной стенки к цитоскелету в цитоплазму.
Известно, что некоторые АГБ содержат карбоксилтерминальные гликозил фосфатидилшюзитольные «якори», при помощи которых они закрепляются на плазматической мембране (Yuol et al., 1998; Shi et al., 2003). Воздействие низких температур вызывает активацию фосфолипаз С и Д (Ruelland et al., 2002), которые отсекают фосфотидилинозитальный домен АГБ (Sherrier et al., 1999; Borner et al., 2002), высвобождая АГБ из плазматической мембраны в клеточную стенку и изменяя их функции и конформацию. В связи с этим логично предположить, что сигнальные системы, в частности, кальциевая, также могут принимать участие в регуляции активности лектинов.
Расшифровка молекулярных ответов растительных клеток на действие абиогенных и биогенных стрессоров и установление роли лектинов в этих процессах могли бы помочь познанию механизмов развития устойчивости растений.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось
выяснение механизмов регуляции активности лектинов при действии на растения пшеницы стрессорных факторов биотической и абиотической природы.
9 Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
изучить изменения активности и молекулярной гетерогенности лектинов в листьях и корнях проростков озимой пшеницы при действии на них низких положительных температур в процессе закаливания;
исследовать динамику активности лектинов в проростках пшеницы при микоплазменной инфекции, совместном действии на растения низких температур и инфекции, а также салициловой кислоты и инфекции;
изучить действие регуляторов роста на показатели активности лектинов, митотической активности клеток и морозоустойчивости растений у разных сортов озимой пшеницы.
выяснить эффект ингибиторов кальциевой сигнальной системы на активность и состав лектинов при гипотермии;
выявить роль структурных элементов цитоскелета (микротрубочек и микрофиламентов) в регуляции активности лектинов при действии на растения пшеницы абиотических факторов (температуры, регуляторов роста, ионов кальция);
определить связь между изменениями в структуре цитоскелета и митотической активностью меристематических клеток в корнях пшеницы.
Основные положения, выносимые на защиту.
Изменения активности лектинов проростков пшеницы при действии на них биотических и абиотических факторов среды имеют сходный характер, что свидетельствует о неспецифичности данной ответной реакции.
Уровень активности лектинов, связанных с клеточной стенкой, коррелирует со степенью морозоустойчивости сортов озимой пшеницы.
Быстрые изменения активности и состава лектинов клеточной стенки, обусловленные функционированием кальциевой сигнальной системы, являются начальным этапом формирования неспецифического защитного ответа растений.
10 Активность лектинов зависит от состояния цитоскелетных структур. Увеличение активности лектинов клеточной' стенки, опосредованное процессами динамической нестабильности микротрубочек и микрофиламентов, необходимо для формирования адаптационных процессов и повышения устойчивости растений.
Научная новизна работы. Впервые показано, что лектины клеточной стенки представлены несколькими полипетидами, различающимися* по молекулярной массе. При действии на растения низких температур происходят существенные изменения в составе лектинов клеточной стенки.
Впервые выявлен фазный характер изменений в активности лектинов в проростках озимой пшеницы при действии на них биотических и абиотических факторов внешней среды.
Впервые показано участие мембранных кальциевых каналов в регуляции активности и молекулярной гетерогенности лектинов клеточной стенки.
Впервые обнаружена сорто- и органоспецифичная зависимость между уровнем активности лектинов клетки и структурным состоянием цитоскелета.
Впервые продемонстрирована возможность регуляции активности лектинов клеточной стенки путем воздействия на растения фитогормонами и их структурными аналогами. Впервые показано, что салициловая кислота снимает изменения активности лектинов, индуцированные микоплазменной инфекцией.
На основании полученных результатов предложена схема участия Са2+-сигналыюй системы и цитоскелетных структур в регуляции активности лектинов при формировании адаптивных реакций растений.
Научно - практическая значимость работы. Выявленные субклеточные и молекулярные механизмы адаптации и устойчивости растений к абиотическим стрессовым факторам среды представляют
11 значительный интерес для создания и скрининга новых сортов и форм растений, более приспособленных к нестабильным условиям внешней среды. Установление коррелятивных зависимостей между активностью лектинов клеточной стенки и морозоустойчивостью растений озимой пшеницы позволяет использовать лектины в качестве высокочувствительных молекулярных биодиагносгикумов, характеризующих термоадаптивный потенциал и морозоустойчивость растений разных генотипов озимой пшеницы.
Помимо этого, полученные данные могут быть использованы в учебном процессе при чтении соответствующих разделов по физиологии* и биохимии растений.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы* доложены на международном симпозиуме «Cereal Adaptation to Low Temperature Stress in Controlled Environments» (Hungary, 1997), на Международном симпозиуме «Plant Cytoskeleton: Molecular Keys for Biotechnology" (Ялта, 1998), на II международной конференции «Progress in Plant Sciences: from Plant Breeding to Growth Regulation" (Hungary, 1998), на II* (X) съезде Русского ботанического общества «Проблемы.ботаники на рубеже XX-XXI веков» (Санкт-Петербург, 1998), на IV съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - наука Ш тысячелетия» (Москва, 1999), на пятой международной конференции «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1999), на Международной конференции «Актуальные вопросы экологической физиологии растений в 21 веке» (Сыктывкар, 2001), на международном симпозиуме «Plant under Environmental Stress» (Москва, 2001), на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на Международном симпозиуме «Plant Cytoskeleton: Functional Diversity and Biotechnological Implications» (Киев, 2002), на V съезде общества физиологов растений (Пенза, 2003), на Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003), на Всероссийской конференции «Актуальные вопросы ботаники и физиологии растений» (Саранск, 2004), на
12 -Всероссийской конференции «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), на 1 международнойнаучно-практической конференции «Постгеномнаяэрав биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004), на Международной, научной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия (Вологда, 2005), на втором международном симпозиуме «Signalling Systems of Plant Cells: Role in Adaptation and Immunity» (Казань, 2006), на VI съезде общества физиологов растений (Сыктывкар, 2007), на II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), на- Международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной, организации растений» (Екатеринбург, 2008).
Публикации. По материалам диссертации'опубликовано 57 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментального материала и его обсуждения, заключения, выводов и библиографии, включающей 305 наименований, из них 145 — на русском языке. Работа изложена на 287 страницах машинописного текста, содержит 60 рисунков и 11 таблиц.
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.
Благодарность. Выражаю благодарность д.б.н., проф. Хохловой Л.П. за помощь в выполнении данной работы.
Стрессовый фитогормон АБК и его роль в адаптации растений к низкой положительной температуре
При действии стрессоров изменяется гормональный статус растений, заключающийся в уменьшении содержания фитогормонов стимулирующего типа и индуцированном образовании и повышении содержания стрессовых гормонов, происходящем вследствие активации или индукции синтеза ферментов, катализирующих их образование. В период низкотемпертаурного закаливания значительно возрастает содержание абсцизовой кислоты (АБК) (Таланова, 2009; Li et al., 1997, 2003). Обработка АБК как проростков (Таланова, 2009; Veisz et al., 1996; Li et al., 1997, 2003), так и культуры клеток (Сопина и др., 1994; Chandler, Robertson, 1994) при оптимальных температурах вызывала эффект холодового закаливания, что повышало их устойчивость к низким температурам, индуцируя экспрессию холод-индуцируемых генов и синтез белка de novo (Li et al., 1997; Seki et al., 2002).
Доказательством участия АБК в механизме развития морозоустойчивости явились опыты с ингибитором синтеза АБК — флуоридоном, который снимал повышение холодоустойчивости при акклимации кукурузы, а добавление АБК восстанавливало этот процесс (Anderson et al., 1994).
Эксперименты с АБК-нечувствительными (abi) и АБК-дефектными {aba) мутантами показали, что обработка экзогенной АБК а&а-мутантов восстанавливает их способность к холодовой адаптации (Llorente et al., 2000).
Известно, что и гипотермия, и обработка АБК в условиях оптимальных температур вызывают индукцию мРНК и синтез новых белков (Koike et al., 1997). В настоящее время обнаружен ряд холод-индуцируемых генов; экспрессия которых вызывается и АБК. В промоторах этих генов имеются участки, которые являются ответственными, за АБК-индуцированный ответ (ABREs) и которые активируются при связывании с ними специфических белков AREBs miH ABFs (Choi et al., 2000; Uno et al., 2000).- Несмотря на то, что гены, кодирующие ABFs, экспрессируются под влиянием АБК и различных стрессоров: низких и высоких температур, засоления и засухи (Ghoi et al., 2000), предполагается; что эти1 белки участвуют в передаче сигнала- сходным образом через связывание с ABREs и активацию; АБК-индуцированного ответа. Многие холод- и засухоиндуцированные гены содержат в. своем промоторе как DRE/CRT, так и ABRE участки, которые могут функционировать независимо. Однако анализ этих участковч при-экспрессии гена RD294 показал; что они функционирют совместно, регулируя экспрессию генов в ответ на засуху (Narusaka et1 al., 2003). Кроме того, в str6 мутанте, дефицитном по генам холодоустойчивости, наблюдалась и меньшая? экспрессия. АБК-индуцированных генов. Таким-образом; накоплено достаточно- много, доказательств участия АБК в экспрессии холод-индуцируемых генов (Knight et al., 2004).
Наряду с этим в работах других авторов\(Четверикова, 1999) показано значительное увеличение морозостойкости закаленных растений после действия АБК. Обработка незакаленных растений АБК увеличивала морозостойкость, но в меньшей мере, чем закалка. Установлено, что АБК не влияет на экспрессию некоторых активируемых низкой температурой генов (Dallaire et al., 1994; Thomashow, 1999), и, ген, регулирующий индуцированное стрессом накопление АБК, не зависит, в свою очередь, от генов; контролирующих морозоустойчивость (Nordin et al., 1993). Последнее, по-видимому, свидетельствует о наличии АБК- зависимых и АБК-независимых путей индукции-- морозоустойчивого состояния (Shinozaki, Yamaguchi-Shinozaki, 2000).
Представлены доказательства участия процессов фосфорилирования-дефосфорилирования в осуществлении эффектов АБК. Показано, что фосфорилирование-дефосфорилирование белков, по остаткам тирозина имеет , существенное значение- в индукции rab — гена;, экспрессия- которого осуществляется абсцизовой кислотой (Heimovaara-Dijkstra et al., 1996). Изучение механизмов влияния АБК на функционирование сигнальных системv показало, что АБК активирует липоксигеназную, кальциевую, МАР-киназную; супероксидсинтазную, фосфатидокислотную сигнальные системы (Тарчевский, 2001).
Повышение уровня-, АБК относят к числу общих неспецифических ответов растений на стрессовые воздействия различной природы. В инфицированных патогенами растениях АБК индуцирует системную-устойчивость, вызывая экспрессию генов- белков - ферментов, катализирующих образование защитных веществ. - антибиотиков (фитоалексинов), а также соединений, укрепляющих клеточные стенки растений, нейтрализующих токсины патогена и-т.д. (Тарчевский, 2002). Механизмы действия АБК и функции многочисленных, белков, синтез которых регулируется этим, гормоном, по; прежнему находится в центре внимания исследователей.
Ионы Са являются одним из наиболее.важных элементов.в системе внутриклеточной сигнализации у растений (Тарчевский, 2002). Как вторичный посредник кальций необходим на всех этапах онтогенеза растительного организма. Он участвует в-регуляции- таких процессов, как рост и дифференцировка, фотоморфогенез и. эмбриогенез, реакция само(не)совместимости в системе пыльца-рыльце, рецепция симбиотических сигналов; реакция сверхчувствительности, индуцированная патогенами w элиситорами, гравитропизм и фототропизм, сборка и разборка элементов цитоскелета, рецепция красного и синего света, циклоз и движения клеток устьиц (Медведев, 2005; Malho et al., 2006);
Кальций участвует в адаптации к различным стрессовым воздействиям. Такие сигналы, как холодовой и тепловой шок, засоление и засуха, аноксияи элиситоры, осмотический шок и механическое- раздражение, а также инфицирование патогенами вызывают кратковременное повышение уровня ионизированного кальция, в цитоплазме (Lecourieux et al., 2006; Hong-Bo et al., 2008a, 6; Song et al., 2008; Luan, 2009). Кальций является основным элементом в трансдукции гормональных сигналов: гибберелловой кислоты, АБК, ИУК и цитокининов (Suhita et all, 2003).
Кальциевая «вспышка» носит преходящий характер. Ее восходящая? ветвь вызвана открыванием кальциевых каналов, расположенных в плазмалемме, вакуолярном тонопласте и мембранах эндоплазматическош сети. При открывании кальциевых каналов ионы кальция устремляются в цитозоль, w их концентрация повышается в 10-20 раз. Эта кальциевая-«вспышка» используется- клеткой в качестве сигнального интермедиата (White, Broadly, 2003; Tang et al., 2007);
Кортикальный цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка как единый структурный поверхностный аппарат клетки
Сложный поверхностный аппарат растительной клетки представляет собой структурно и функционально сопряженную систему, ответственную за восприятие и трансдукцию сигналов внешней среды, в том числе и таких экстремальных факторов, как действие высоких и низких температур, водного и солевого стрессов. Это позволяет видеть в клеточной периферии сложный узел физиологического аппарата-клетки, способный обеспечивать ее полифункциональность и адекватность ответных реакций.
Цитоскелет, плазмалемма и клеточная стенка образуют единый структурно-функциональный комплекс; все компоненты которого тесно взаимосвязаны между собой. Boi многих растительных клетках, найдены белки, способные «сшивать» элементы цитоскелета не только между собой, но также и с мембранными структурами (Медведев, Маркова, 1998). В литературе обсуждается вопрос о существовании трансмембранных белков, связывающих элементы, цитоскелета с клеточной стенкой (Baluska et al., 2003; Sardaret al., 2006; Sardar et al., 2007).
Взаимодействия между компонентами цитоскелета, плазмалеммой и, белками клеточной стенки играют ключевую роль в восприятии и проведении, внешнего сигнала в различные компартменты клетки путем создания динамической механической связи из компонентов цитоскелета. Эта связь необходима и для формирования ответной реакции на внешний сигнал (Туркина, Соколов, 2001).
Известно, что в. растущих клетках параллельно кортикальным микротрубочкам с экстраплазматической стороны плазмалеммы откладываются микрофибриллы целлюлозы. При этом расстояние между микротрубочками приблизительно равно расстоянию между откладываемыми микрофибриллами (Аве et al., 1994). При переходе к образованию вторичных утолщений клеточной оболочки в виде колец или спиралей микротрубочки собираются в группы-ленты, намечающие места будущих утолщений, и над этими лентами с противоположной стороны» плазмалеммы начинают откладываться целлюлозные микрофибриллы, ориентирующиеся так же, как и микротрубочки (Васильев, 1996): Параллельное расположение- внутренних микрофибрилл целлюлозы и микротрубочек послужило основанием для предположения, что последние каким-то образом контролируют ориентацию- первых при их отложении. В пользу этого предположенияг свидетельствуют экспериментальные данные, показывающие, что во многих случаях обработка клеток ингибиторами микротрубочек вызывала нарушение ориентации целлюлозных микрофибрилл (Васильев; 1984; Lloyd, 1987).
Согласно наиболее распространенной точке зрения (Robinson, Quader, 1982; Васильев, 1984) синтез целлюлозы и кристаллизация ее в микрофибриллы осуществляется на наружной, поверхности плазмалеммы погруженными в мембрану мультиферментными комплексами. Существует предположение (Robinson, Quader, 1982), что»микротрубочки связываются с целлюлозосинтезирующими комплексами и осуществляют их перемещение по плазмалемме путем активного движения самих микротрубочек. Согласно другой точке- зрения; направленное движение целлюлозоспнтезирущих комплексов создается увеличением текучести липидов в узкой полоске плазмалеммы, расположенной над каждой,микротрубочкой (Васильев, 1996). Также в литературе имеются сообщения о том, что положение актиновых филаментов совпадает с ориентацией целлюлозных микрофибрилл клеточной стенки. При переходе клетки к отложению вторичной оболочки в виде вторичных утолщений кортикальные микрофиламенты смещаются к местам этих утолщений вместе с микротрубочками (Kobayachi et al., 1987; Kobayachi et al., 1988). Предполагается, что кортикальные микротрубочки, микрофиламенты и плазмалемма образуют единый структурно-функциональный комплекс, в котором коаксиальные: актиновыс филаменты1 контролируют ориентацию
тубулиновых структур илш стабилизируют их (КоЬауасЫ: et аГ., 1987;.Kobayachiret аК, 1988; Dingetak, 1991).
G другой стороны, клеточная? стенка; играет важную- роль в стабилизации,тубулинового цитоскелета: так, удаление клеточноюстенки при; выделении? протопластов, приводило: к значительными перестройкам кортикальных микротрубочекі (Jung; et. аГ., 1993). Возможно", существуют трансмембранные белки, которые соединяют микротрубочки с. целлюлозными» микрофибриллами».. Различные: механические стрессы, могут. влиять, на; стабильность-тубулиновых структур-через, такие; трансмембранные: белки. (Williamson, 1991); что позволило:- бььмикротрубочкам; воспринимать изменения:; клеточного; ростам через; изменения в і напряжении; клеточной/ стенюг и- перестраиватьсясв; соответствии? с: ними; Подтверждением;: того, что : клеточная? стенка стабилизирует тубулиновыефиламенты; являются; данные полученные- Akachi; с; сотрг ( 1990.): . Эти; исследователи, установили;, что: экстенсии; увеличивал устойчивость микротрубочек; к: холоду.: Возможное-объяснение;.этого заключаетсяе В том; микротрубочки; присоединяются; к: трансмембранным белкам; связанным с экстенсином.
Арабйногалактановые; белки ; относящиеся; к 3-лектинам; как и» выше; упомянутый; экстенсии; могут осуществлять! взаимодействие: компонентов клеточного матрикса с плазматической; мембраной: Кроме; того , образуя? макромолекулярные.мостикИ Между плазмалеммой и:клеточной?стенкой, они; могут детектировать радиальные напряжения, возникающие при: изменении; осмотического давления; Подобные стрессы и; сдавливания .могут играть роль, в определении; плоскости деления; клеток и хода органогенеза; ВІ. тканях растений (Румянцева; 2005).
Изменения активности лектшюву разных сортов озимой пшеницы в процессе низкотемпературной адаптации
Действие на растения озимой пшеницы температуры 2С в течение 7 суток привело к эффекту закаливания (табл. 1, 2). LT5o у всех исследуемых сортов понижалась в процессе адаптации растений к низкой температуре, и устойчивость проростков к морозу после 7-суточного закаливания была выше, чем после 3-суточного. Более высокой отзывчивостью на закаливание характеризовались листья Мироновской 808 по сравнению с другими сортами, так как снижение LT5o у листьев Мироновской 808 происходило соответственно на 2,8С и 3,3С, в то время как у Безостой 1 - на 1,3С и 2,1С, а у Альбидум 114 - на 1,8С и 2,8С. Большую морозостойкость в процессе закаливания приобретали не только листья, но и корни. Однако в корнях картина была несколько иной. Через 3 и 7 суток действия низких температур морозоустойчивость повысилась на- 0,7С и 1,7С у Безостой 1, 058С и 2,1С у Мироновской 808, 1С и 2,4С у Альбидум 114. Морозоустойчивость в процессе закаливания в корнях в большей степени увеличивалась у более морозоустойчивых сортов. Имея в виду, что LT5o корней был выше, чем листьев (табл. 1, 2), корни можно оценивать как более чувствительные по отношению к гипотермии органы по сравнению с листьями.
Способность растений переносить действие низких температур обусловлена генотипическими различиями. Принято считать, что растворимые белки, к числу которых относятся и лектины, в силу присущих им физико-химических свойств выполняют важную роль в процессах термоадаптации растений С одной стороны, они защищают другие конститутивные белки клетки, а с другой - внутриклеточные мембраны (Трунова, 2007). Показано, что1 лектины принимают участие в реакциях устойчивости растений к неблагоприятным факторам (Комарова и др., 2000; Шакирова,2001).
Входя в качестве структурных компонентов в состав мембран и клеточной стенки и участвуя в различных процессах, в основе которых лежат белок - углеводные взаимодействия, в том числе и взаимодействия плазмалеммы и клеточной стенки, лектины могут играть важную роль в формировании устойчивости растений к действию закаливающих температур.
На рис. 1 представлена активность лектинов разных сортов озимой пшеницы, отличающихся по степени морозостойкости (Тимофеева и др., 1999). Из рисунка видно, что как в листьях, так и в корнях самая высокая активность растворимых лектинов наблюдалась у сорта Безостая 1 (наименее морозоустойчивый), а наименьшая - у сорта Альбидум 114 (наиболее морозоустойчивый). У пшеницы сорта Мироновская 808, проявляющей среднюю, по сравнению с этими двумя сортами, морозоустойчивость, активность растворимых лектинов имела также среднее значение. Таким образом, мы наблюдали обратную зависимость между проявляемой различными сортами пшеницы морозоустойчивостью и активностью лектинов растворимой фракции.
Как известно, лектины - это» группа белков, объединяемая общими методами обнаружения, выделениям сходными биологическими свойствами. По данным литературы отличительной особенностью лектинов» пшеницы от другихфастительных лектинов является то; что-и!в семенах, и в проростках, и во взрослых растениях, а- также в разных органах пшеницы содержится одинаковый по своим свойствам и иммунохимически идентичный- лектин (Cammue et al., 1988), названный-агглютинином зародыша-пшеницы (АЗП). Сравнительное изучение лектинов-других злаков (ячменя, ржи, риса и др.) показало их высокую степень родства по иммунологическим, биохимическим свойствам и сахароспецифичности АЗИ; что позволило объединить, их в, группу "злаковых лектинов" (Chrispeels, Raikhel, 1991): Таким образом, тестируя активность растворимых лектинов у разных сортов-пшеницы, мы определяем активность одногои того же белка.
Проведенные эксперименты показали, что лектиновая активность в растениях пшеницы проявлялась-не только во-фракции цитоплазматических белков, но и во фракции клеточной стенки (рис. 1), что подтверждает данные литературы о присутствии лектина в составе клеточной стенки- пшеницы (Комарова, 1998; Ковалева и др., 1999; Комарова и др., 1999). Имеются прочносвязанные с клеточными стенками лектины, или 0— лектины, которые хотя и. обладают доменами углеводной специфичности, но очень слабо агглютинируют эритроциты (Королев, 1984; Любимова, Салькова; 1988; Любимова, 1991). К таким лектинам, в частности, относится клеточно-стеночный лектин картофеля экстенсии, взаимодействие которого с углеводными компонентами фитопатогенов индуцирует в растении-хозяине цепь защитных реакций в ответ на микробную инфекцию (Королев, 1984;Showalter, 1993; Brownleader et al., 2000). Другим примером могут быть рецепторные протеинкиназы клеточной стенки с лектиновым доменом, LecRK, которые, как полагают, могут воспринимать и передавать внешний сигнал в клетку, вызывая ответную реакцию (Holf;et al., 2009).
Как видно из рисунка, активность во фракции лектинов клеточных стенок распределилась по сортам следующим образом: лектины клеточных стенок наименее морозоустойчивого сорта Безостая 1 проявляли наименьшую активность по сравнению с другими сортами, а наиболее морозоустойчивого Альбидум 114 — наибольшую, активность лектинов клеточных стенок.пшеницы сорта Мироновская 808 имела средние значения.
У всех исследуемых сортов активность лектинов как растворимых, так и связанных с клеточной стенкой, в корнях была выше, чем в листьях. Эти результаты хорошо согласуются с данными литературы. Так, в работе Райхель (Raikhel et al., 1984) было показано, что больше всего лектинов содержится в семенах, а затем по степени убывания - в семядолях, корнях, стеблях, листьях.
Присутствие лектинов в разных органах растений (листьях, корнях), в составе плазмалеммы, в составе мембран митохондрий (Выскребенцева, Борисова, 1996; Борисова, Выскребенцева, 1997) и хлоропластов (Фалькович, 1995), в цитозоле, в клеточной стенке, а кроме того, высокая консервативность генов "злаковых лектинов" в ходе эволюции свидетельствуют о важной роли этих белков в процессах жизнедеятельности. Несмотря на то, что в исследованиях механизма приобретения морозоустойчивости озимых злаков белкам уделялось немало внимания, лектины при этом остаются почти не изученными.
Активность и состав лектинов клеточной стенки при действии ингибиторов кальциевой сигнальной системы
Существует предположение о том, что лектин пшеницы играет роль сигнальной молекулы (Антонюк, Игнатов, 2001; Коць, Сытников, 2007). На примере взаимодействия растений пшеницы и симбионтной им.ризобактерии - азоспириллы было показано, что АЗП в низких концентрациях (10"8 — 10"9 М) способен как усиливать уже протекающие в бактериальной клетке процессы биосинтеза, так и индуцировать новые биосинтетические программы (Антонюк, Игнатов, 2001). Добавление АЗП к культуре А brasilense приводило к усилению синтеза фермента — нитрогеназы, что позитивно подействовало на способность бактерии экспортировать продукт азотофиксации за пределы бактериальной клетки, а также увеличивало продукцию ИУК. Последняя, в- свою- очередь, может активировать в растениях пшеницы синтез АЗП, опосредованный АБК (Шакирова и др., 2000).
Предложена модель, согласно- которой адгезия микоплазм на мембранных элементах клеток поражаемых хозяев осуществляется благодаря двустороннему процессу белок-углеводного узнавания: лектины, находящиеся в мембране клеток хозяина, взаимодействуют с поверхностными углеводными полимерами микоплазм (Skripal et al., 1994). Одновременно молекулы мембраносвязанных лектинов. микоплазм узнают соответствующие углеводные рецепторы на мембранах клеток хозяина и взаимодействуют с ними. Было показано, что в процессах адгезии клеток ахолеплазмы (Acholeplasma laidlawii 118) на мембранных элементах клеток флоэмы растений пшеницы со стороны растения принимает участие лектин АЗП, который, взаимодействуя с мембраной микоплазмы, прочно закрепляет клетки микроорганизма на мембране клетки- растения (Skripal et- al;,. 1994); Таким; образом, структурные компоненты, адгезии (лектины и углеводные остаткина1 мембранах) как. со стороны микоплазм, такій со стороны растения, определяют специализацию патогена к соответствующим хозяевам и их: способность поражать.соответствующиеорганы и ткани;
Как известно; при инфицировании патогенами? в клетках: растений! активируются системы защиты, приводящие к экспрессишгенов:(Тарчевский; 2001, 2002); Нрш этомг происходит замедление: синтеза? одних белков» и усиление образования других,.. что проявляется в: изменении, электрофоретического спектра?синтезируемых:белков; Имеющиеся данные о влиянии микоплазменной инфекции на: растения? гороха позволяют считать, что! микоплазмьь включают классический; сигнальный, путь подавления патогенов (Чернов;., ш др. 1996; Максютова; 1998;. Мухаметчина,,. 2000);. -В? связшсэтим, мышоставилишередсобойзадачу выяснить, каю инфицирование растениш озимой; пшеницы мшоїтазмамтАсИоІерІаята- laidlawii 118 влияет на- полипептидный состав-: кислоторастворимых белков; однимі из которых является АЗИі
Ві природных условиях заражение микоплазмамш происходит, как правило;, с помощью? насекомых переносчиков? — цикадок (Билащ 1988); Цикадка; питаясь, пластическими: веществами- клеток, флоэмы, тонким: стилетом: вводит мйкоплазму вместе: со слюной внутрь живых: клеток растения-хозяина. Мьь заражали растения микоплазмами мето доме субэпидермальнош инъекции, используя; шприц фирмы "Hamilton 1; Этот способ инфицирования напоминает впрыскивание: микоплазм через жало насекомых иг представляется: наиболее близким, к природному. Візтом случае. суспензия; содержащая клетки микоплазм,. проникает под давлением в растения;без грубого повреждения тканей. Зона инфицирования при этом не: ограничивается местом проникновения иглы, а охватывает значительную часть близлежащих тканей: (Чернов, 1998). Однако инъекция шприцем всеже является механическим стрессором, кроме того, компоненты: культуральной среды могли повлиять на реакцию клеток растения, поэтому в опытах с микоплазмами брали дополнительный контроль — растения, которым была сделана инъекция культуральной средой того же объема в нижний участок стебля с помощью шприца. Инъекция культуральной средой (без микоплазм) не оказала существенного влияния на активность лектинов (рис. 18). Идентичность электрофореграмм (рис. 19) контрольного образца и образца растений, которым была сделана инъекция культуральной средой, свидетельствует об отсутствии значительного влияния самой культуральной среды на белковый метаболизм растения.
Электрофоретическое разделение белков на ПААГ (рис. 19) позволило обнаружить в инфицированных микоплазмами растениях пшеницы увеличение содержания полипептидов 76 кДа, 48 кДа, 25 кДа, 18 кДа, появление полипептидов 22 кДа, 20 кДа и исчезновение полипептида 14 кДа. Исходя из данных литературы полипептид 18 кДа является лектином АЗП. Таким образом, инфицирование растений пшеницы микоплазмами приводило к изменению спектра синтезируемых белков — набора полипептидов и их соотношения.
Для понимания механизмов индуцирования микоплазмами синтеза белков представляют интерес данные работы И.А. Тарчевского с соавторами (1996). Было показано, что инокуляция растений гороха микоплазмой Acholeplasma laidlawii 118 приводит к появлению ряда новых белков, синтез одного из которых (38 кДа) также индуцируется жасмонатом, салицилатом и сукцинатом (Тарчевский и др., 1996; Тарчевский и др., 1999). Имея в виду, что салицилат является участником НАДФН-оксидазной, а жасмонат -липоксигеназной сигнальных систем клеток растений, можно сделать предположение о «включении» микоплазмами при инфицировании растений, по крайней мере, двух вышеупомянутых сигнальных систем.
Известно, что микоплазмы вызывают у растений пшеницы одно из самых вредоносных заболеваний - бледно-зеленую карликовость (Билай, 1988). Это заболевание характеризуется бледно-зеленой окраской листьев.
