Введение к работе
Свеїтой палати учителя биологии А.В.Артемьева посвящается Актуальность исследования.
Одной из фундаментальных проблем современной биологии остается выяснение мроды и функций сателлигиых ДІЖ. В последние годы микро- и минисателлитные ДНК !ляются объектами пристального изучения ввиду их роли в возникновении ряда :йромышечных и нейродегенеративных наследственных заболеваний человека, а также шлепсии, инсулин-зависимого диабета, некоторых форм рака и других патологий, >условленных нестабильностью вышеназванных последовательностей ДНК (Bennett et al., >95; Kiaris et al., 1995; Mitas, 1997; Reddy, Housman, 1997; Djian, 1998). Однако до сих пор і установлены точные молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе стабильности всех типов сателлигиых ДНК. Предполагают, что изменения ^кросателлитных последовательностей возникают преимущественно вследствие ошибок )и синтезе ДНК за счет ренликационного проскальзывания (Richards, Sutherland, 1994; mheim, Shibata, 1997; Ohshima, Wells, 1997), тогда как нестабильность минисателлитной НК является результатом генной конверсии и неравных обменов (Buard, Vergnaud,1994; ffreys et al., 1994; Haaf, Willard, 1997). Высказываются предположения о возможном щесівовании прямой или обратной корреляции между метилированием ДНК и стабильностью повторяющихся последовательностей. С одной стороны для некоторых івторов характерна повышенная вероятность образования вторичных структур ДНК и, едовательно, репликационного проскальзывания, если в них был метилирован цитозин acharias, 1993; Mitas et al., 1995), но с другой стороны описаны случаи, когда лидирование ДНК, наоборот, предотвращало рекомбинационные процессы между івторяющимися последовательностями (Hsieh, Lieber, 1992; Liang, Jasin, 1995; Yoderet al., 97). В свою очередь необычные структуры ДНК, формируемые in vivo во время процессов, язанных с репликацией, репарацией и рекомбинацией, способны повышать вероятность de \о метилирования (Smith et al., 1994; Chen et al., 1995; Smith, Crocitto, 1999). Кроме того, давно было описано аутосомно-рециссивное наследственное заболевание человека (1CF ндром), при котором, как предполагают, гипометилирование сателлитной ДНК едшествует хромосомной нестабильности (Ji et al., 1997; Qu et al., 1999; Xu et al., 1999).
В настоящее время остается в значительной степени не ясным период формирования менений высокоповторяющихся последовательностей в онтогенезе млекопитающих, ^сказываются предположения, что изменения в микро- и минисателлитных ДНК могут зникать либо во время гаметогенеза (Buard et al., 2000; Stead et al., 2000), либо на ранних ідиях эмбрионального развития (Kelly et al., 1989; Gibbs et al., 1993). Также не понятны
2 механизмы влияния нестабильности минисателлитных и более крупных сателлитных ДНК і возникновение патологий человека. Не известно, возникает ли заболевание в резулыа нарушений структуры гена, которые обусловлены изменением размера и/или нуклеотидне последовательности сателлитных ДНК, локализованными внутри или за пределами данної гена, либо влияние носит эпигенетический характер. Такая неясность обусловлена к; методическими трудностями исследования крупных повторяющихся последовательность ДНК, так и отсутствием животных, у которых встречались бы заболевания с симптомам эквивалентными вышеназванным наследственным болезням человека. По-видимому, ответ на указанные вопросы можно будет получить лишь при использовании модельнь: трансгенных животных и трансфектных эукариотических клеток, несущих в своем генои экзогенные сателлитные ДНК различного типа. До сих пор в литературе не описан успешных результатов по получению трансгенных животных, в которых б воспроизводилась межгенерационная нестабильность минисателлитной и, тем боле сателлитной ДНК. Возможно, это было обусловлено неудачным выбором авторами тиі минисателлита, а именно его состава и размера, либо тем, что они не проводили аналі потомства трансгенных животных на эмбриональных стадиях развития, когда могли бьп зарегистрированы изменения в нуклеотидной последовательности трансгена.
Цели и задачи исследования.
Цель данной работы состояла в изучении механизмов нестабильной минисателлитной ДНК у грансгенных мышей и в трансфектных клетках эмбрионально тератокарциномы мыши F9. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи
Получить трансгенных мышей и трансфектные клетки эмбриональной тератокарцином мыши F9, несущих в своем геноме 3,8 т.п.н. повторяющуюся единицу сателлитно ДНКІУ (Sat) крупного рогатого скота.
Провести компьютерный анализ нуклеотидной последовательности Sat-фрагмента ді; оценки возможного влияния горячих точек рекомбинации и вторичных структур ДНК і нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК.
Выяснить, существует ли взаимосвязь между нестабильностью чужеродно минисателлитной ДНК и ее метилированием.
Определить характер влияния нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК і жизнеспособность трансгенных мышей и трансфектных клеток F9.
Сравнить влияние вторичных структур ДНК, горячих точек рекомбинации метилирования ДНК на межгенерационную и соматическую нестабильность чужеродно минисателлитной ДНК у трансгенных мышей и трансфектных клеток эмбрионально тератокарциномы мыши F9.
з Научная новизна работы.
Впервые воспроизведена межі еперациокная нестабильное! ь жтоіснной инисателлитнои ДНК у траисгенных животных, которая имела выраженный енотипический эффект - пренатальную гибель трансгенных зародышей спустя как инимум одно поколение. Получена соматическая нестабильность чужеродной инисателлитнои ДНК в культуре эукариотических клеток. Показано, что межгенерационная соматическая нестабильность экзогенной минисателлитной ДНК обусловлена тутриаллелыюй межмолекулярной и/илн внутримолекулярной рекомбинацией, сследована взаимосвязь между паттерном метилирования экзогенной минисателлитной НК и межгенерационной и соматической нестабильностью. Практическая значимость работы.
Созданные экспериментальные модели могут быть использованы для изучения еханизмов изменчивости минисателлитной ДНК и ее влияния на возникновение зеледственных заболеваний человека, обусловленных межгенерационной нестабильностью іких последовательностей, а также для исследования механизмов регуляции активности :нов, дифференцировки клеток, процессов старения. Полученные трансгенные мыши и )ансфектные клетки эмбриональной тератокарциномы мыши F9 могут быть использованы тя тестирования ксенобиотиков различной природы.
Апробация работы. [атериалы диссертации были представлены на: Ш-й Всероссийской научно-технической жференции "Фундаментальные исследования в технических университетах", Санкг-етербург, Россия, 10-11 июня 1999г.; Ц-й Европейской цитогенетической конференции, єна, Австрия, 3-6 июля 1999 г.; ХШ-м Всероссийский симпозиум "Структура и функция іеточного ядра", Санкт-Петербург, Россия, 19-20 октября 1999 г.; 10-й Европейской >нференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин, Германия, 20-23 октября )99 г.; 2-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, зесия, 1 -5 февраля 2000 г.
Основные положения, выносимые на защиту: Трансгенные мыши и трансфектные клетки эмбриональной тератокарциномы F9 могут быть использованы в качестве модельных систем для изучения молекулярных основ нестабильности минисателлитной ДНК.
Внутриаллельная межмолекулярная и/или внутримолекулярная рекомбинация лежит в основе межгенерационной и соматической нестабильности экзогенной минисателлитной ДНК.
4 3. Межгенерационная нестабильность чужеродной минисателлитной ДНК приводит нарушению в эмбриональном развитии спустя как минимум одно поколение. Структура диссертации.
Диссертация изложена на 138 страницах и. состоит из глав: введение, обзо литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение выводы. Работа иллюстрирована 33 рисунками, 9 таблицами. Список литературы содержи 274 работы на русском и английском языках.
