Содержание к диссертации
Введение
ВВЕДЕНИЕ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И
1.1. ЦИТОКИНЫ СЕМЕЙСТВА LIF 11
1.2. ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (ЭСК) МЛЕКОПИТАЮЩИХ 15
1.3. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА lif. 24
1.4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА LIF 28
1.5. ЗНАЧЕНИЕ ИЗОФОРМЦИТОКИНА LIF 31
1.6. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ LIF НА ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ...33
1.7. ПУТИЕШ-СИГНАЛИЗАЦИИВЭСК... 38
1.8. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ invitro 43
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 52
2.1. ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ 52
2.2. КЛОНИРОВАНИЕ КДНК ГЕНА 52
2.3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ 55
2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА /// 56
2.5. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКОГО БЕЛКА LIF 56
2.6. БЕЛКОВЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ 58
2.7. ДИАЛИЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЖА LIF 59
2.8. WESTERN-БЛОТ АНАЛИЗ (ИММУНОБЛОТТИНГ) 59
2.9. ПОЛУЧЕНИЕ LIF В КЛЕТКАХ ЛИНИИ COS-1 60
2.10. ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА LIF 62
2.10.1. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА) 62
2.10.2. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ LIF 63
2.11. ТЕСТИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ LIF НА ЭСК МЫШИ 63
2.12. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕЭСК in vitro 64
2.12.1. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ ЭСК 64
2.12.2. ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ И ВРЕМЯ УДВОЕНИЯ 65
2.12.3. ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ ТЕСТ НА ВЫЯВЛЕНИЕ ЭЩФ 65
2.13. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭСК МЫШИ ЛИНИИ Rl in vitro 66
2.14. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 67
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 67
3.1. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА И/В РАЗНЫХ ТИПАХ КЛЕТОК 67
3.2. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ LIF .82
3.3. ИНДУКЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЭСК МЫШИ В УСЛОВИЯХ ПРОЛОНГИРОВАННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ С LIF-COS 90
4. ВЫВОДЫ 104
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
Введение к работе
Открытие эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981) и человека (Thomson et al., 1998) относится к выдающимся достижениям ХХ-го века. Использование этих клеточных культур в медико-биологических исследованиях расширяет наши представления о возможностях биологии развития, генетики, клеточной и молекулярной биологии. В настоящее время с помощью ЭСК решаются фундаментальные и прикладные проблемы дифференцировки и управления индивидуальным развитием (Boheler et al., 2002; Toyooka et al., 2003; Wobus, Boheler, 2005), исследуются молекулярные механизмы репрограммирования ядер соматических клеток в энуклеированных ооцитах (Wilmut et al., 1997; Hochedlinger et al., 2003). Есть серьезные основания для использования ЭСК в заместительной терапии с целью коррекции и лечения наследственных и дегенеративных заболеваний (Schuldiner et al., 2000; Boheler et al., 2002; Ventura et al., 2004; Wobus, Boheler, 2005).
Подавляющее большинство экспериментальных исследований выполнено на линиях ЭСК мыши. Эти работы стали возможны только благодаря применению цитокина LIF (Leukemia Inhibitory factor) - основного фактора поддержания ЭСК в недифференцированном состоянии in vitro (Gearing et al., 1987; Gough et al., 1988; Smith et al., 1988; Thomson et al., 1998; Auernhammer, Melmed, 2001). Цитокин LIF охарактеризован как гликопротеин с высокой аффинностью связывания с LIF-рецептором (LIF-R) и трансмембранным переносчиком - gpl30 (Gearing et al., 1991; Davis et al.,
1993). В настоящее время достаточно хорошо исследованы его молекулярная структура и механизмы действия на плюрипотентные клеточные линии. LIF-активация рецепторного комплекса (LIF-R-gpl30) запускает в ЭСК мыши JAK-STAT3 (Ernst et al., 1996; Niwa et al., 1998, Raz et al., 1999), МАРК (Auernhammer, Melmed, 2001; Izumi et al, 2006) и/или PI3K пути внутриклеточной сигнализации (Auernhammer, Melmed, 2001; Kristensen et al., 2005; Boiani, Scholer, 2005). В результате действия LIF в ЭСК реализуются программы как подавления (JAK-STAT3-nyrb), так и активации цитодифференцировки in vitro (МАРК и РІЗК-путь).
Широкий спектр действия LIF на ЭСК связан с тем, что этот регуляторный белок способен активировать разные каскады цитоплазматических реакций и, соответственно, разные гены-мишени, ответственные за плюрипотентность, пролиферативную активность и дифференцировку. Аналогичная картина выявляется при действии на ЭСК рекомбинантных цитокинов LIF, полученных на основе микроорганизмов или же клеток млекопитающих (Smith et al., 1988; Chang et al., 1997; Matsuda et al., 1999; Buehr et al., 2003; Horiuchi et al., 2004). Несмотря на огромный фактический материал, в вопросах LIF регуляции ЭСК млекопитающих остается много неизвестного. Этот цитокин необходим разным видам для поддержания in vitro генетически стабильных линий плюрипотентных клеток из ранних зародышей на стадии бластоциста (Nagy et al., 1990; Vogiagis, Salomonsen, 1999; Dimitriadis, 2005). ЭСК других видов, в частности человека, в культуре обнаруживают зависимость не от LIF, а от основного фактора роста фибробластов - bFGF и/или фидерных клеток (Reubinoff et al., 2000; Wobus, Boheler, 2005). Связано ли это с видовыми особенностями ЭСК или же с различиями в свойствах рекомбинантного LIF, остается не ясным. Для ответа на эти вопросы необходимы сравнительные исследования. Данные литературы, полученные на разных линиях ЭСК, в разных системах культивирования с коммерческими препаратами рекомбинантного LIF, полученными разными способами, сравнивать трудно. Они обнаруживают биохимическую и видовую гетерогенность (Hilton et al., 1988; Gascan et al., 1989; Thompson et al., 1998). Возможно, что на биологическую активность рекомбинантного LIF влияет не только первичная структура этого белка, но и его посттрансляционные модификации, что весьма вероятно при использовании разных систем экспрессии. Для получения ответов на эти вопросы необходимы сравнительные исследования функциональной активности продуктов экспрессии одного гена lif при действии на стабильную LIF-зависимую культуру клеток.
В связи с этим целью наших исследований было определение активности рекомбинантного белка LIF мыши, полученного в результате экспрессии одного гена lif в про- и эукариотических клетках-продуцентах, и исследование характера действия на плюрипотентность и дифференцировку LIF-зависимой линии ЭСК мыши для того, чтобы проверить, влияет ли система экспрессии на функциональные свойства рекомбинантного белка LIF.
Мы решали следующие задачи:
Конструирование экспрессионных векторных систем со встроенным геном ///"мыши для про- и эукариотических клеток-продуцентов, выделение и хроматографическая очистка рекомбинантных белков LIF.
Оптимизация условий для введения плазмидных конструкций и отбор клеток-продуцентов со стабильной экспрессией гена ///мыши.
Сравнение биологической активности рекомбинантного белка LIF про- и эукариотического происхождения при действии на плюрипотентные ЭСК мыши в культуре in vitro. - Оценка скорости и характера роста, а также способности рекомбинантного LIF поддерживать ЭСК мыши в плюрипотентном состоянии в зависимости от способов очистки, концентрации LIF в среде и длительности культивирования. - Анализ способности рекомбинантного белка LIF мыши влиять на процессы цитодифференцировки ЭСК в условиях пролонгированного культивирования.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ЦИТОКИНЫ СЕМЕЙСТВА LIF.
Цитокин LIF принадлежит к семейству интерлейкина-6 (IL-6), куда входят также IL-6, IL-11, кардиотропин-1 (СТ-1), онкостатин М (OSM), целюлярный нейрональный трофический фактор (CNTF) и недавно открытый кардиотропин - подобный цитокин/цитокин-подобный фактор - cardiotrophin- like cytokine/cytokine-like factor-1, CLC-CLF (Tomida, 2000; Robb et al., 2002; Dimitnadis et al., 2005). Некоторые из перечисленных цитокинов (LIF, OSM,
СТ-1 и CNTF) связываются с а-цепью LIF-рецептора. Связывание каждого цитокина с его рецептором приводит к димеризации с трансмембранным гликопротеином gpl30 и, в результате, образованию высокоаффинного рецептора с последующей активацией сигнального трансдуктора JAK (Janus kinase), пути передачи сигнала (JAK/STAT) и фактора транскрипции STAT (Hilton, 1992; Taga et al., 1997; Heinrich et al., 1998; Niwa, 2001).
Наравне с другими представителями этого семейства, LIF вовлечен в процессы нейрогенеза, гематопоэза и эмбриогенеза. В системе in vitro LIF секретируется в различных клетках и тканях, клеточных линиях, включая гепатоциты, адипоциты, остеобласты, мегакариоциты; нейрональные, мышечные клетки и ЭСК (Hilton, 1992; Aloisi et al., 1994, Auernhammer, Melmed, 2001). Однако основной уровень LIF-экспрессии в тканях взрослого организма обычно столь низок, что может быть обнаружен только при помощи Northern-blot анализа. Транскрипция гена ///и, как результат, синтез и секреция белка, повышаются в большинстве тканей в ответ на стимулирование бактериальными продуктами, например, липополисахаридами, IL-6, IL-1 и G-CSF (Brown et al., 1994) или ингибируется противовоспалительными агентами - глюкокортикоидами, IL-4,IL-13(Chabaudetal., 1998).
Показано, что продукция LIF взаимосвязана с процессами инфекции и воспаления (Wesselingh et al., 1994). При исследовании сывороток здоровых и больных пациентов была найдена корреляция между количеством циркулирующего в крови LIF и степенью воспаления. В сыворотке здоровых людей цитокин LIF в основном не диагностируется. Сыворотка пациентов с мягкой инфекцией или воспалением содержит низкий уровень LIF, в то время как пациенты с септическим шоком обнаруживают достаточно высокий уровень LIF в крови (Waring et al., 1992, Auernhammer, Melmed, 2001).
Физиологически наиболее важное и интересное место продукции LIF -это эндометрий (Stewart et al., 1992; Yang et al., 1995; 1996; Auernhammer, Melmed, 2001). Максимального значения концентрация LIF в эндометрии достигает в период имплантации бластоцисты в матку (Bhatt et al., 1991). Это показано не только на мышах, но и на других млекопитающих (Kojima et al, 1994; Dimitriadis et al, 2005). Цитокин LIF сильный иммунно-эндокринный модулятор, играющий ключевую роль в процессах подержания беременности у животных и человека (Smith et al., 1998; Vogiagis, Salamonsen 1999; Robb et al., 2002; Dimitriadis et al., 2005).
Первоначально LIF был охарактеризован по его способности индуцировать макрофагиальную дифференцировку и угнетать рост клеток лейкемии мыши линии Ml (Gearing et al., 1987; Gough et al., 1988). Через 4 дня после обработки цитокином клетки Ml дифференцировались в зрелые макрофаги, увеличивался синтез макрофагиальных маркеров, таких как Мас-1 (CD lib), FCyRII (CD32) и лизоцима(Krystosek, Sachs, 1976). Аналогичным действием на клетках Ml обладают цитокины OSM и IL-6 (Metcalf, 1988; 1991; 1992).
Цитокин LIF имеет множество альтернативных названий: D-фактор (Tomida et al., 1984), моноцит-стимулирующий фактор 2-ого типа - MGI-2 (Hilton et al., 1988), фактор, ингибирующий дифференцировку - DIA (Smith et al., 1988), человеческий интерлейкин, активирующий процессы дифференцировки клеток линии DA-la - HILDA (Godard et al., 1988) и др. Однако больше он известен под названием LIF.
Было показано, что LIF стимулирует выживание и пролиферацию некоторых гематопоэтических клеточных линий (Metcalf et al., 1988; Dick et al., 1991; Burstein et al., 1992). Он оказывает небольшое влияние на пролиферацию и дифференцировку первичных гемопоэтических предшественников из костного мозга, селезенки или фетальной печени (Metcalf et al., 1988). В комбинации с IL-3 усиливает образование колоний мегакариоцитов (Burstein et al, 1992). Стоит отметить, что LIF был впервые очищен на основе его способности стимулировать пролиферацию клеточных линий мыши (DA1) и TF-1 - человека (Gascan et al., 1989). Кроме того, LIF оказывает различные эффекты на эндокринные ткани: активирует гипоталамо-адренергичекий путь (НРА), повышает функциональную активность и гомеостаз липидов в адипоцитах, регулирует рост горомонально-чувствительных примордиальных и эндометриальных клеток (Auernhammer, Melmed, 2002).
Широкий спектр биологических функций LIF имеет потенциальное терапевтическое значение при использовании этого цитокина в качестве лечебного препарата (Keller et al., 1993). Способность LIF индуцировать рост и дифференцировку нейрональных клеток центральной и периферической нервной системы находит применение при лечении различных наследственных и приобретенных патологий моторной системы (Cheema et al., 1994, Nishimura et al., 2003). Наиболее перспективная возможность использования LIF в клинике - это повышение тромбоцитарного уровня (Metcalf 1991). Цитокин LIF способен укорачивать период тромбоцитопении с последующей тромбоцитарной деструкцией in vivo. Но использование LIF для лечения костей, нервов и мышц после их повреждений возможно только в случае оптимизации системы доставки и введения в организм (Dick et al., 1991; Hilton, Gough, 1998).
Цитокин LIF регулирует гормональную секрецию, метаболизм и гомеостаз в различных типах клеток-мишеней эмбрионального и соматического происхождения. Кроме того, он абсолютно необходим на этапе выделения ЭСК млекопитающих из ранних зародышей на стадии бластоцисты (Pease et al., 1990). Только благодаря LIF удалось впервые выделить генетически стабильные линии ЭСК мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981).
1.2. ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (ЭСК) МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
Первичной организацией жизни является оплодотворенная яйцеклетка, способная воспроизводить целый организм. Это свойство, названо тотипотентностью. Оно сохраняется до 8-ми - 16-ти клеточной стадии развития (рис. 1.). На более поздних стадиях происходит дифференцировка с образованием бластоцисты и клеток трофобласта, где выявляются тотипотентные клетки внутренней клеточной массы (ВКМ). Трофэктодерма дает начало экстраэмбриональной эктодерме, из которой формируются плодные оболочки (амнион, аллантоин, желточный мешок) и внезародышевая эндодерма (Gardner, Johnson 1975; Hilton, Gough, 1998).
Клетки ВКМ сохраняют способность развиваться во все клеточные типы, свойственные целому эмбриону. ВКМ может быть введена в культуру, но в отсутствии некоторых факторов, клетки быстро дифференцируются (рис. 1, Hogan, Tilly, 1978; Martin, 1981; Hilton, Gough, 1998, Cowan et al., 2004). В присутствии очищенного белка LIF или среды с цитокином клетки ВКМ способны бесконечно пролиферировать с сохранением недифференцированного фенотипа (Evans, Kaufman, 1981; Martin 1981; Smith 1988).
ТОТИПОТЕІІТІІЬІЕ ЗИГОТА ПЛЮРИПОТЕИТНЫЕ ^Р МОРУЛА \ БЛАСТОЦИСТА
I
ФАКТОРЫ РОСТА, цитокины
Эктодерма Мезодерма
Эндодерма In vivo РРІГ
МУЛЪТИПОТЕНТНЫЕ
ПРОГЕНИТОРНЫЕ дифференцированные клетки (кровь, мышцы, сердце, нервы)
Эктодерма | | Мезодерма і і Эндодерма / &УХ/ \
In vitro
Рис. 1. Происхождение эмбриональных стволовых клеток (по Wobus, 2005).
Клеточные линии, которые получаются в результате роста ВКМ в присутствии LIF, были названы эмбриональными клетками. Важным их свойством является способность при инъекции в бластоцель реципиента составлять единое целое с клетками зародыша. Если после этого химерную бластоцисту поместить в матку приемной матери, то произойдет нормальное развитие зародыша, а ЭСК примут участие в образовании всех тканей, включая зародышевые (Bradley et al., 1984; Smith et al., 1988; Nagy et al., 1990; Nichols et al., 1990; Thomson et al., 1995; Reubinoff, 2000; Cowan et al., 2004).
На эмбриональных клетках исследования начались в начале 1970-х годов. В основном использовали клетки эмбриональной карциномы (ЭК), линии эмбриональной опухоли - тератокарциномы (Stevens, 1967). Клетки ЭК сохраняют способность к дифференцировкам и могут образовывать производные всех трех зародышевых листков: экто-, мезо- и эндодермы (Mintz, 1975; Martin, Evans, 1975). При пересадке в зародыш они способны участвовать в эмбриональном развитии и давать химерных мышей (Mintz, 1975). Однако, в отличие от ЭСК, было показано, что тератокарциномные линии клеток имеют многочисленные хромосомальные нарушения, и их потенциал к дифференцировкам ограничен. Для тератомных линий клеток было показано, что эти клетки могут нормально развиваться в составе зародыша только в присутствии химических индукторов (McBurney et al., 1982, Koopman, Cotton, 1984).
Другим типом плюрипотентных эмбриональных клеток являются примордиальные эмбриональные клетки (ПЭК), которые формируются в развивающейся половой закладке - генитальной бороздке. Выделение и культивирование ПЭК мыши на различных фидерных слоях приводит к созданию эмбриональных гермиальных клеточных линий (Labosky et al., 1994). Во многих исследованиях показано, что ПЭК неотличимы по морфологии и свойствам от ЭСК, и они имеют высокую способность к пролиферации и дифференцировке in vitro (Rohwedel et al., 1996), а также общие клеточные и генетические маркеры типичные для других линий ЭСК.
Впоследствии, стволовые клетки могут претерпевать генетические манипуляции in vitro, или путем введения трансгенов, или мутациями специфических генов гомологичной рекомбинацией. Эффект таких генетических изменений может также быть изучен в рамках целого организма (Robertson, 1991). В культуре эмбриональных клеток приобретаются другие свойства - они могут длительное время существовать in vitro, выдерживают до 80 пассажей без изменения, т.е. становятся плюрипотентными клетками (Wobus, Boheler, 2005).
В 1981 году две группы ученых успешно ввели в культуру плюрипотентные клетки, выделенные из эмбрионов мыши на стадии бластоцист (Martin, 1981; Doetschman et al., 1985; Evans, Kaufman, 1981; Wobus et al., 1984). Для этого они использовали фидерный слой первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ). Эти клеточные линии, названные эмбриональными стволовыми клетками, происходили из ВКМ или эпибласта и могли длительное время находиться в культуре in vitro без снижения способности к дифференцировкам (рис. 1). Плюрипотентность этих клеток подтверждалась in vivo путем введения ЭСК в бластоцисту. Полученное химерное животное демонстрировало, что ЭСК способны давать начало всем клеточным линиям, включая эмбриональные (Bradley et al., 1984). Их способность дифференцироваться во все клеточные типы как in vitro (Hamazaki et al., 2001; Trounson, 2006), так и in vivo (Evans, Kaufman, 1981; Boheler, 2002) лежит в основе современных биотехнологических исследований по клонированию, изучению функций генов с использованием методов сайт-направленной модификации, а также получения нокаутированных химерных животных и дифференцированной ткани для клеточной терапии (Wobus, Boheler, 2005).
Недавно было показано, что ЭСК мыши в системе in vitro обнаруживают способность воспроизводить не только соматические типы клеток (Doetschman et al., 1985; Evans, Kaufman, 1981; Reubinoff et al., 2000; Boheler et al., 2002), но и эмбриональные линии клеток (Hiibner et al., 2003; Toyooka et al., 2003), гаметы. Это свидетельствует о тотипотентности некоторых линий ЭСК, их высоком потенциале и возможностях.
В настоящее время стабильные линии ЭСК получают из бластоцист разных линий мышей, но наибольшее распространение до сих пор имеют производные 129/Sv или потомки от скрещивания 129/Sv х 129/Sv-CP (Kawase et al., 1994; Gao et al., 2003; Schoonjans et al., 2003). Причины такой избирательности недостаточно ясны. Однако можно предположить, что определенную роль в поддержании стабильного фенотипа ЭСК в условиях in vitro играет относительно высокая (до 30%) предрасположенность самцов линии 129/Sv к формированию спонтанных тестикулярных тератокарцином (каталог линий мыши: http//www).
В самых первых работах для выделения ЭСК мыши требовались специальные условия и культивирование на фидерных слоях мышиных первичных эмбриональных культур фибробластов (ПЭФ). Очевидно, что клетки фидера выделяют какие-то факторы, необходимые для поддержания плюрипотентности ЭСК. Независимо друг от друга в разных лабораториях из кондиционированной на ПЭФ среде выделили трофический фактор, отвечающий за свойства ЭСК in vitro (Williams et al., 1988). Этот фактор был идентифицирован как цитокин LIF (Koopman, Cotton, 1984; Williams et al., 1988; Niwa, 2000; Murray et al., 2001).
Практически все стабильные культуры эмбриональных клеток обладают безграничными способностями in vitro давать начало всем клеточным линиям. Стоит также отметить, что даже при регулярном пассировании in vitro эти клетки поддерживают нормальный кариотип и высокую пролиферативную активность. У них небольшое время удвоения популяции (12-15 ч) с короткой G1 фазой клеточного цикла (Rohwedel et al., 1996). Эти клеточные культуры используются в основном как векторные системы для переноса чужеродных генов, получения трансгенных животных и изучения эмбриогенеза млекопитающих (Kurzrock et al., 1991).
Для всех линий ЭСК мыши характерными являются наличие молекулярных маркеров, которые определяют молекулярные основы «стволовости». Одним из ключевых свойств ЭСК является синтез теломеразы - рибонуклеопротеина, добавляющего концевые повторы к теломерам хромосом, тем самым, поддерживая их длину на постоянном уровне. С этим ферментом связана бессмертность ЭСК (Thomson et al., 1998; Odorico et al., 2001; Гривенников, Шкуматов, 2002). Большинство диплоидных соматических клеток не экспрессируют теломеразу и вступают в фазу "репликативного старения" после 50 - 80 удвоений популяции и, таким образом, имеют конечную протяженность пролиферативной жизни в клеточной культуре (Thomson et al, 1998; Гривенников, Шкуматов, 2002).
В настоящее время также установлено, что недифференцированные плюрипотентные клетки мыши экспрессируют специфические антигены клеточной поверхности (SSEA) и мембран-связанные рецепторы gpl30, щелочную фосфатазу (ЭЩФ) и теломеразы (табл.1, Thomson et al, 1998; Burdon et al, 1999; Reubinoff et al, 2000; Odorico et al, 2001). В ЭСК мыши обнаружены факторы транскрипции Oct-3/4 и STAT (Rathjen et al, 1990; Niwa et al, 1998, 2000; Matsuda et al, 1999), активность которых необходима для поддержания плюрипотентности.
Не так давно в этих клетках выявлен гомеодоменный белок Nanog -другой ключевой регулятор плюрипотентности (Chambers et al, 2003; Hamazaki et al, 2004). Эти транскрипционные факторы имеют первостепенное значение поддержания фенотипа ЭСК. Активация цитоплазматического фактора STAT3 имеет второстепенное значение и не так важна для поддержания линии ЭСК in vitro (Wobus, Boheler, 2005).
В ряде работ показано, что для ЭСК других видов животных и человека LIF не так необходим, как для ЭСК мыши (Niwa, 2000; Murray et al, 2001). Эмбриональные клетки имеют межвидовые отличия по антигенному составу, пролиферативной активности, способности формировать эмбриоидные тела (ЭТ) в культуре in vitro и тератомный рост после введения в организм (табл.
Таблица 1.
Сравнение плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мыши, приматов и человека.
Примечание: SSEA - Stage-specific embryonic antigen, ЭТ - эмбриоидные тела, TRA - Tumor rejection antigen-1, LIF - Leukemia inhibitory factor, bFGF -basic fibroblast growth factor (no Wobus, Boheler, 2005).
Подобно клеткам мыши, ЭСК человека поддерживают активную пролиферативную способность и нормальный кариотип в течение длительного культивирования (Amit et al., 2000). Например, стволовые клетки человека, в отличие от ЭСК мыши, обнаруживают высокую зависимость от фидера, имеют большее время удвоения (30-35 ч против 12-15 ч; Amit et al., 2000) и формируют по морфологии другие типы ЭТ. Обнаруживают специфические эмбриональные антигены (SSEA-3, SSEA-4) и протеогликаны TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM-2 (табл.1).
ЭСК мыши можно культивировать в присутствии рекомбинантного цитокина LIF и без фидерного слоя эмбриональных фибробластов (Williams et al., 1988; Hamazaki et al., 2004). Для поддержания плюрипотентности ЭСК человека недостаточно использования одного цитокина LIF (Reubinoff et al., 2000; Thomson et al., 1998). Эти клетки требуют постоянного культивирования на фидерном слое ПЭФ мыши или же фидерных клетках человека (Reubinoff et al., 2000; Daheron et al., 2004). LIF не способен поддерживать ЭСК человека в плюрипотентном состоянии (Daheron et al., 2004). Эти клетки культивируют на внеклеточном белковом матриксе - Матригеле (комплексная смесь белков, выделенных из опухоли Engelbreth-Holm-Swarm) или же ламинине с добавлением для усиления адгезии кондиционированной на клетках ПЭФ среды (Xu et al., 2001; Yao et al., 2006). При использовании таких условий культивирования к концу 2001 года с использованием фидерного слоя было выделено около 70 линий ЭСК человека, из которых к концу 2004 года только 22 стабильно поддерживаются in vitro (Wobus, Boheler, 2005). Несмотря на то, что некоторые линии ЭСК человека выдерживают до 80 пассажей без изменения своих свойств, до сих пор условия и среды для их культивирования не оптимизированы (Chiu, Rao 2003; Wobus, Boheler, 2005). Сложность проблемы состоит в том, что еще не подобраны соответствующие наборы молекулярных и клеточных маркеров, которые могли бы объективно характеризовать ЭСК человека (Wobus, Boheler, 2005). Стоит обратить внимание на то, что ЭСК из приматов (Thomson et al., 1995) имеют маркеры, аналогичные клеткам человека (табл. 1). Поэтому линии ЭСК приматов могут служить альтернативной моделью для исследования молекулярных и клеточных механизмов развития человека (Wobus, Boheler, 2005).
В настоящее время ЭСК и ЭСК-подобные клетки выделены из зародышей крупного рогатого скота (Prelle et al., 1999), курицы (Chang et al., 1997), хомяка (Doetschman et al., 1988), кролика (Schoonjans et al., 1996) и крысы (Buehr et al., 2003). Однако стоит отметить, что только клетки мыши и курицы способны после введения в зародыш дифференцироваться в линии половых клеток.
1.3. ОРГАНИЗАЦИЯ гена///:
В результате исследований структуры геномов млекопитающих было показано, что ///-гены человека и мыши имеют 78% (140 из 179 положений) идентичности в нуклеотидной и аминокислотной последовательности (Stahl et al., 1990; Willson et al., 1992). Оба гена обнаруживают высокую степень консервативности в кодирующих регионах (78-94%) и гораздо меньшую консервативность в нетранслируемых и фланкирующих сегментах (Stahl et al., 1990; Willson et al., 1992).
Молекула LIF кодируется единичной копией гена, расположенной на хромосоме 22ql2 человека (Sutherland et al., 1989; Giovannini et al., 1993) и ПАЇ мыши (Kola et al., 1990). При сравнении геномов человека и мыши установлено сходство генов lif и osm. Оба гена имеют схожую интрон/экзонную структуру и различаются между собой примерно на 10 п.н. (Giovannini et al., 1993).
В структуре генов lif мыши и человека выявлено 7 гомологичных сегментов, в число которых входят, в основном, кодирующие регионы (Stahl et al., 1990). Высокая стабильность кодирующих регионов играет ,, функциональную роль в регуляции lif-тена (Stahl et al., 1990). Оба гена имеют размеры 6.3 и 6.0 кб, соответственно (Gough et al., 1988; 1992; Stahl et al., 1990). Они состоят из 3-х экзонов, 2-х интронов и длинной З'-х нетранслируемой области (рис. 2), которая существенна для процессов регуляции транскрипции (Gough et al., 1992; Hilton, Gough, 1998). Однако, причины включения длинных некодирующих областей в состав гена ///*пока еще не ясны. Существуют и другие гены, которые также имеют длинные нетранслируемые участки, например, гены стероидных рецепторов и фактора роста фибробластов (Stahl et al., 1990; 1993). Хотя общее сходство 3'-нетранслируемых областей генов lif мыши и человека низкое, имеются отдельные участки явной гомологии, которые, как полагают, играют существенную роль в поддержании стабильности мРНК (Stahl et al., 1990; 1993).
Если учесть, что в кодирующих участках генов ///человека и мыши высокая степень гомологии, то в интронных областях она наблюдается лишь в первом интроне. Это может быть объяснено с эволюционным разнообразием интронных последовательностей, что также характерно и для ряда других генов, например, /7-глобина, IL-2, металлотионина I и II (Stahl et al., 1990). Установлено, что первый экзон гена /// кодирует 5'-нетранслируемый регион и 6-ть первых аминокислот гидрофобной последовательности, второй экзон - остальные 16-ть остатков гидрофобной последовательности и 53-и остатка зрелого белка LIF. Третий экзон -кодирует 137 аминокислот С-терминального конца зрелого белка и длинную нетранслируемую область, составляющую примерно 3.2 п.н. (Gough et al., 1992; Stahl etal., 1990; 1993).
Промотор гена ///"полностью консервативен у мыши, человека, птиц и свиней (Willson et al., 1992). Анализ нуклеотидной последовательности гена lif мыши обнаружил четыре консервативных ТАТА-подобных элемента внутри области 340 п.н. 5'- трансляционного стартового кодона первого экзона (Stahl et al., 1990). Главный сайт транскрипции у мышей и человека локализован в положении 60-64 п.н. инициаторного кодона рядом с проксимальным ТАТА-боксом (Stahl et al., 1990). Межвидовое сравнение нуклеотидной последовательности 5'- фланкирующей области гена lif выявило его высокую идентичность, вплоть до 270 п.н. В отличие от других видов, особенностью гена lif мыши является наличие негативного регуляторного элемента между -360 и -249 п.н. (Sasai et al., 1998) и GC-обогащенного гипометилированного участка между двумя первыми экзонами (Hsu, Heath, 1994; Stahl et al., 1993). Полагают, что присутствие негативного регуляторного элемента влияет на низкий уровень экспрессии LIF в большинстве тканей, который может быть увеличен за счет индукции некоторыми цитокинами и митогенами (Stahl, Gough, 1993; Hilton Gough, 1998). Негативное влияние этой области на функционирование промотора может быть аннулировано вирусным энхансером SV40 или энхансер-подобным элементом, расположенным в этой области между -660 до -860 и между -3.200 до -1.200 нуклеотидами (Stahl, Gough, 1993; Hsu, Heath, 1994).
ЭКЗОНЫ (и,,,,,,) (.) (3484 п.н.)
ИНТРОНЫ »- J J % (1731 п.н.) (693 п.н.)
Рис. 2. Структура гена ///млекопитающих. - кодирующие регионы, - некодирующие регионы (по Hilton, Gough,
1998).
К особенностям гена /// мыши относится наличие альтернативного первого экзона, кодирующего белок, в котором первые 4 остатка лидерной последовательности изменены. Изменения в этой области белка, приводят к тому, что зрелый белок LIF накапливается преимущественно в матрикс-связанной, а не в растворимой внеклеточной форме (Rathien et al., 1990).
Единичная копия гена lif способна давать 2 молекулы РНК, различающиеся по первым кодирующим экзонам. Им соответствуют m (matrix) - матрикс-связанная и d (difusable) - растворимая, формы LIF, которые представляют собой функционально активные сигнальные пептиды (Conquet et al., 1992; Gearing et al, 1991). Также в геноме мыши, человека и свиньи была обнаружена укороченная альтернативная t - форма (truncated) белка LIF (Haines et al., 1999).
1.4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА БЕЛКА LIF.
Цитокин LIF - это гликопротеин, представляющий собой одноцепочечный полипетид, состоящий из 159-180 аминокислотных остатков, представленных в основном гидрофобными и положительнозаряженными аминокислотами. Согласно данным кристаллографии (Robinson et al., 1994; 1995; Hinds et al., 1998), его молекулы, как и молекулы других цитокинов семейства IL-6, имеют трехмерную структуру из 4 длинных амфифильных а-спиралей (А, В, С, Д), скомпанованных в антипараллельной up-up, down-down ориентации с длинными петлями между А и В, С и Д спиралями (рис. 3).
Молекула LIF содержит 3 дисульфидные связи (Cysl2 - Cysl34, Cysl8 -Cysl31, Cys60 - Cysl63) и на ее поверхности расположено три рецептор-связывающих сайта, обеспечивающих взаимодействие с рецепторным комплексом LIF-рецептора (LIFR) и трансмембранным гликопротеином gp!30 (рис. 3).
УЧАСТКИ IVI1ІКОЗІL/IIІРОВЛНІІЯ сайт/
Рис. 3. Трехмерная структурная организация молекулы цитокина LIF (по Hilton, Gough, 1998).
Аналогичной структурой обладают CNTF и IL-6 (Lin et al., 1989; Bazan, 1991). Первый и третий сайты взаимодействуют с проксимальным мембранным цитокин-связывающим доменом LIF-R. Первый сайт, состоящий из C-D петли и прилегающих аминокислотных остатков является наиболее важным для связывания с рецептором. Сайт II, состоящий из аминокислотных остатков А и С спиралей, определяет взаимодействие LIF с проксимальным доменом gpl30. Третий сайт включает аминокислотные остатки С-конца D- спирали и А-В петли и оказывает влияние на связывание с рецептором. (Layton et al., 1994b; с; Hudson et al., 1996; Smith, Treutlein, 1998; Auernhammer, Melmed, 2000)
Строение LIF белка аналогично онкостатину M (Auernhammer, Melmed, 2000), CNTF (Lin et al, 1989) и кардиотропину (Pennica et al., 1995), более отдаленно G-CSF и IL-6 (Bazan, 1991). Стоит отметить, что между последовательностями белка LIF разных видов животных наблюдается высокая степень гомологии, более 80% (Gearing et al., 1987; Gough et al., 1988). Кроме того, в молекуле LIF присутствует 6 сайтов гликозилирования, которое осуществляется на посттрансляционном уровне по остаткам аспарагина, и фактически этот белок весьма гликозилирован.
Однако белок LIF, выделенный из различных источников, имеет молекулярную массу в пределах 32-67 Ша. Теоретические расчеты, сделанные по нуклеотидной последовательности кДНК LIF, показывают более низкое значение - 20кДа (Hilton et al., 1988b). Снижение молекулярной массы возможно путем дегликозилирования N-гликозидазой (Gascan et al., 1989; Hilton et al., 1988b). А ее увеличение за счет гликозилирования по остаткам серина и/или треонина (Gascan et al., 1989). Считается, что гликозилирование не влияет на биологическую активность белка (Gough et al., 1988; Hilton et al., 1988; 1992) и, вероятнее всего, служит для защиты от протеолитических ферментов (Heinrich et al., 1998). LIF - химически стабильные молекулы. Их обработка растворами при рН 2.0-11.0, 8М мочевиной, 6М гуанидин-гидрохлоридом, различными ионными, неионными и цвиттерионными детергентами не вызывают изменения активности белка (Godard et al., 1992; Hilton et al., 1988b). Активность LIF нейтрализуется обработкой протеазами, аминами, малеиновым ангидридом (Hilton, Gough, 1998). Молекула цитокина стабильна в течение длительного времени при -20С и становится не активной при 4С (Hilton, Gough, 1998). Для хранения LIF требуются специальные вещества, такие как 0.02% Твин-20 или БСА (Hilton et al., 1988b).
1.5. ЗНАЧЕНИЕ ИЗОФОРМ ЦИТОКИНА LIF.
В эмбриональных и соматических клетках млекопитающих цитокин LIF экспрессируется в трех изоформах: m-, d- и t-LIF (Haines et al., 1999). Изначально, мембрансвязанная-форма LIF (т-) была обнаружена только в последовательности гена /г/мыши, и не найдена в геноме человека (Hsu et al., 1994; Rathjen et al., 1990). Позднее m-LIF транскрипты были обнаружены в клетках человека и свиньи (Haines et al., 1999). Экспрессия форм t-LIF, d-LIF и m-LIF различна в клеточных системах (Haines et al, 1999). Укороченная t-форма LIF экспрессируется, в основном, внутриклеточно, и только небольшое ее количество секретируется вне клетки (Haines et al., 1999).
Для цитокина LIF характерным является альтернативный сплайсинг, и одна копия гена ///"может дать две молекулы РНК, соответствующие т- и d- LIF (Haines et al., 1999, Voyle et al., 1999). Эти белки отличаютеся всего лишь по первому кодирующему экзону, второй и третий экзон одинаковый во всех молекулах. Было показано, что первый экзон m-LIF мыши не содержит инициирующий кодон ATG, поэтому трансляция начинается с ATG, расположенного на втором экзоне (Hsu et al., 1994; Rathjen et al., 1990; Willson et al., 1992; Voyle et al., 1999). В результате этого образуется внутриклеточный белок с М=17 кДа, у которого отсутствует сигнальная последовательность для секреции и N-конец усечен на 22 амикислоты относительно зрелого d-LIF (Voyle et al., 1999; Haines et al., 1999).
Зрелые белки m-LIF и d-LIF имеют одинаковые полипептидные последовательности и различаются только по месту их локализации в клетке: d-LIF является секретируемой и растворимой, и в основном обнаруживается в компонентах секреторного аппарата клетки. В противоположность этому m-LIF остается связанным с внеклеточным матриксом и однородно распределенным в ядре и цитоплазме (Haines et al., 1999).
Выявляется тканеспецифичная экспрессия т- или d-форм LIF в зависимости от типа клеток-продуцентов (Rathjen et al., 1990а). Так, например, в мозге взрослых млекопитающих экспрессируется только т-формы LIF, в кишечнике новорожденных - только d-LIF (Robertson et al., 1993), в печени - t-LIF (Haines et al., 1999).
В мышиных эмбриональных клетках и тканях, содержащих клетки-предшественники, наблюдается на относительно высоком уровне экспрессия всех трех изоформ LIF (Smith et al., 1992; Robertson et al., 1993; Haines et al.,
1999). В линиях клеток эмбриональных карцином присутствует постоянный уровень экспрессии т- и t-транскриптов. Две изоформы т- и d-LIF показывают схожую биологическую активность при действии на рецепторный комплекс и не различаются между собой при тестировании с помощью антител против LIF (Conquet et al., 1992). Действие t-LIF проявляется в пределах ядра и цитоплазмы в регулировании процессов апоптоза без участия LIF-рецепторов (Haines et al., 1999,2000).
1.6. МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ LIF НА ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
Исследования с использованием меченого белка LIF выявили, что все LIF-чувствительные клетки экспрессируют высокоаффинный рецепторный комплекс для связывания с цитокином на поверхности клетки (Godard et al., 1992; Hilton, Nicola 1992). Число рецепторов на поверхности клеток-мишеней, как правило, мало (50-3000/кл) и константа их диссоциации составляет 20-100 пМ (Godard et al., 1992; Hilton, Nicola 1992).
Было показано, что а - цепь низкоаффинного LIF-R входит в состав гемопоэтиновых рецепторов I класса для гормонов роста, пролактина, эритропоэтина, интерлейкинов, OSM, CNTF (Gearing et al., 1991; 1992а). В сыворотке мышей на относительно высоком уровне была выделена растворимая форма LIF рецептора (LIF-R), которая образуется путем альтернативного сплайсинга мРНК (Gearing et al., 1991; Tomida et al., 1994), и количество которого возрастает на 20-30 день беременности (Yamamoto-Yamaguchi et al., 1993).
НИЗКОАФФИННЫЙ ВЫСОКОАФФИННЫЙ LIF-R LIF-R
789 м
597 a»
277 aa
ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ
СВЯЗЫВАЮЩИЙ
ДОМЕН
ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕН
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ДОМЕН а-ЦЕПЬ LIF-R а-ЦЕПЬ №"0 LIF-R гсмопоэтиновый домен иммуноглобулин-подобный домен фибронектиновый домен
II типа | иитоплазматический домен трансмембранный домен
Рис. 4. Схема строения рецепторного комплекса LIF. (по Hilton, Gough, 1998).
Общим свойством LIF-R является наличие во внеклеточной области двух гемопоэтиновых рецепторных доменов (рис. 4). Эти домены характеризуются наличием 4 консервативных участков цистеина и 5 аминокислотных мотивов WSXWS (Три-Сер-Х-Три-Сер, W - триптофан, S - серии, X - неконсервативные аминокислоты), что является важным для взаимодействия с лигандом (рис. 4, Hilton, Gough, 1998). а - цепь LIF-R содержит также иммуноглобулин - подобный домен и три домена фибронектинового II типа (рис. 4, Gearing et al., 1991). LIF-рецептор имеет короткий цитоплазматический участок, включающий 82 аминокислоты (Tomida, 2000). Эта наиболее консервативная часть рецептора содержит сайты связывания JAK-тирозинкиназ, фосфорилирующих активированный (димеризованный) рецептор. Если удалить цитоплазматическую часть LIF, то укороченная форма LIF-R может передавать сигнал. Это означает, что LIF-R не является единственным трансмембранным переносчиком и, следовательно, существуют молекулы, ассоциированные с этим рецептором и ответственные за передачу сигнала (Taga, Kishimoto, 1997). По данным литературы для функционирования высокоаффинного рецептора требуется сообщенная экспрессия а - цепи LIF-R и трансмембранного белка gpl30 (Gearing et al., 1992 a; b; Burdon et al., 1999). Таким образом, рецептор для LIF состоит из 2-х мембран-связанных субъединиц - низкоаффинного LIF-R (190 Ша белок у человека и 130 Ша у мышей) и gpl30 (ІЗОШа; Gearing et al.,1991; Gearing et al., 1992 a; b).
Сам gpl30 не способен связывать LIF, но для формирования высокоаффинного рецептора, допускающего сигнальную трансдукцию, gpl30 взаимодействует с низкоаффинным комплексом [LIF- а-цепь LIF-R] (Heymann et al., 1996; Taga, Kishimoto, 1997). В ЭСК мыши есть LIF-R и gpl30 (Owczarek et al., 1993Auernhamer, Melmed, 2002), обеспечивающие корректную сигнализацию. Аналогичные рецепторные комплексы обнаружены и в ЭСК человека (Auernhamer, Melmed, 2002).
Стоит отметить, что цитокин LIF мыши не связывается с a-LIF-R, а также очень слабо взаимодействует с рецепторным комплексом: а-цепью LIF-R и gpl30 человека (Layton et al., 1994, a; b). Напротив, цитокин LIF человека обнаруживает активность к разным видам клеток человека и мыши. Он с более высокой аффинностью взаимодействует и с растворимой, и со связанной а-цепью LIF-R мыши, чем с а-цепью LIF-R человека (Layton et al., 1994, a; b).
Таким образом, LIF-индуішрованная димеризация рецепторного комплекса является важным событием для активации внутриклеточных сигнальных процессов. В результате связывания с лигандом происходят конформационные изменения рецепторных субъединиц LIF-R и gpl30, с последующей активацией цитоплазматических киназ, фосфорилирования тирозиновых остатков рецептора и сигнальных факторов трансдукции (рис.5). LIF-рецепторный коплекс в ЭСК млекопитающих сопряжен, как минимум с двумя сигнальными ситемами (JAK-STAT3 и МАРК), активация которых может приводить к разным эффектам (активация пролиферации и поддержание плюрипотентного состояния, либо активация дифференцировки).
Транскрипция генов gpl30
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ПЛЮРИПОТЕНТНОСТЬ
/' ?;М#
Рис. 5. Внутриклеточная LIF-сигнализация в ЭСК млекопитающих (STAT3 и МАРК пути сигнальной трансдукции).
1.7. ПУТИЬШ-СИГНАЖЗАЦИИВЭСК. STAT-путь цитоплазматической сигнализации предполагает, что после связывания цитокина LIF с дистально-мембранным участком LIF-R и цитокин-связывающим сайтом трансмембранного белка gpl30 происходит фосфорилирование рецепторных тирозиновых остатков (Starr et al., 1997а; b; Niwa et al., 1998; Raz et al, 1999). В этом процессе участвуют JAK тирозинкиназы (Hsu et al., 1994; Ernst et al., 1996). В отсутствии лиганда JAK-киназы ассоциированы с цитоплазматическими доменами gpl30 и LIF-R, но вскоре после связывания с LIF происходит их аутофосфорилирование и активация JAK1, JAK2 и TYK2 (Stahl et al., 1994; Kunisada et al., 1996; Auernhamer, Melmed, 2002). В плюрипотентных линиях ЭСК мыши наравне с JAK-киназами фосфорилируется и активируется НСК-киназа (hemopoietic cell kinase), относящаяся к семейству SRC киназ (Ernst et al., 1994, Hilton, Gough, 1998).
Активированные JAK-киназы фосфорилируют множество тирозинов в цитоплазматической части рецепторов LIF-R и gpl30, что приводит к активации факторов транскрипции семейства STAT (Darnell et al., 1994; Ernst et al., 1996; Kunisada et al., 1996; Niwa et al, 1998; Tomida et al, 1999; Raz et al, 1999). Транскрипционные факторы STAT содержат ДНК-связывающий и SH2 домены. SH2 домены отвечают за взаимодействие STAT с тирозиновыми остатками (Darnell et al, 1994; Niwa et al, 1998). Мутагенезный анализ выявил последовательность YXXQ, расположенную на дистальных областях цитоплазматических доменов gpl30 и LIF-R, которая необходима для ассоциации транскрипционных факторов семейства STAT с рецептором и их последующего фосфорилирования (Tomida et aL, 1999).
В настоящее время установлено, что в процесс передачи LIF сигнала вовлечены три STAT-белка: STAT1, STAT3 и STAT5B (Kuropatwinski et al., 1997; Raz et al., 1999). Цитоплазматический фактор STAT фосфорилируется тирозиновыми остатками либо рецептора, либо ассоциированной с ним JAK-киназой. Фосфорилированные молекулы STAT диссоциируют от рецептора.
Фосфорилирование в STAT3 С-терминальных участков тирозина (Туг 705) и в STAT-1 (Туг 701) становится причиной того, что SH2 домены способны к гомо - или гетеродимеризации, в результате чего образуются разные комплексы: STAT3-STAT3, STAT1-STAT3 и/или STAT1-STAT1 (Darnell, 1997). Структурный анализ гомодимеров STAT3 и STAT1 показывал, что SH2 домен мономера связывается с С-терминальными фосфотирозинами другого мономера, вызывая их гомодимеризацию (Chen et al., 1998; Darnell, 1997).
Образующиеся гомо- или гетеродимеры STAT проникают в ядро и связываются со специфическими элементами SBE (ДНК-8ТАТ-связующие элементы), индуцируя транскрипцию соответствующих генов-мишеней (рис. 5, 6). Чаще всего STAT-димеры взаимодействуют с нанонуклеотидными последовательностями SBE-элементов с TTCCGGGAA (Hilton, Gough, 1998). Кроме того, цитокин LIF может дополнительно фосфорилировать цитоплазматические факторы STAT3 и STAT1 по остаткам серина (Wen et al., 1997). Считается, что это необходимо для полной активации STAT-чувствительных генов (Darnell, 1997; Wen et al., 1997).
В частности показано, что цитокин LIF в линиях ЭСК мыши и человека активирует цитоплазматический STAT3 (Darnell et al., 1994; Hilton, Gough, 1997; Niwa et al., 1998; Raz et al., 1999; Tomida et al., 1999), который, в свою очередь, может активировать экспрессию гена с-тус и поддерживать плюрипотентность клеток in vitro (Kristensen et al., 2005).
Другой путь (рис. 5), активируемый LIF-сигнальной трансдукцией в ЭСК млекопитающих связан с индукцией Ras-белков и МАРК-киназ (Ernst et al., 1996; Schiemann, Nathanson, 1998; Taga et al., 1997; Auernhammer, Melmed, 2001). Наравне с активацией JAK-STAT каскада, цитокин LIF, как представитель семейства IL-6, стимулирует Ras-MAPK сигнальную трансдукцию (Schiemann, Nathanson, 1998; Taga et al., 1997; Auernhammer, Melmed, 2001). В этом каскаде (She - Grb2 - SOS - Ras - Raf - Mek - Erk), ключевую роль играют серин/треониновые киназы Erkl/2 (рис. 5). Они сами могут активировать многочисленные ядерные транскрипционные факторы (Carter-Su, Smit, 1998; Vojtek, Der, 1998). Способность LIF индуцировать тирозиновое фосфорилирование по Ras - МАРК пути необходимо для реализации его плейротропных свойств и индукции дифференцировки в плюрипотентных клетках (Ernst et al., 1996; Fukada et al., 1996; Burdon et al., 1999). SHP-2 являются цитозольными белками, которые взаимодействуют с цитоплазматической рецепторной субъединицей gpl30 (Stofega et al., 1998; Auernhammer, Melmed, 2001). SHP-2 киназы важны для LIFR/gpl30- опосредованной активации МАРК (Ernst et al, 1996; Fukada et al., 1996; Burdon et al., 1999; Auernhammer, Melmed, 2001). Для LIF-индуцированной
8НР2-активации необходимы специфические цитоплазматические тирозиновые остатки на gpl30 (Y118) и LIFR (Y115), удаление которых блокирует последующую МАРК активацию (Schiemann et al., 1998; Ernst et al., 1996, Fukada et al., 1996). На основании этих данных можно сделать вывод о том, что LIFR/gpl30 стимулирует МАРК сигнульную трансдукцию в
ЭСК млекопитающих через активацию SHP-2 (рис. 5).
Недавние исследования показали, что медиатором LIF- индуцированного Ras-MAPK-пути может являється РІЗ фосфатидилинозитол-3-киназа (Oh et al., 1998; Boiani, Scholer, 2005). Таким образом, этот цитокин LIF способен активировать как JAK-STAT, так и Ras-
МАРК пути внутриклеточной сигнализации (рис. 6). Между этими путями возможно переключение с одного на другой. Молекулярные механизмы, по которым происходит переключение LIF-сигнала, не выявлены. В настоящее время для понимания процессов переключения LIF-сигнальной трансдукции проводятся исследования с применением блокаторов и активаторов соответствующих сигнальных путей (Schiemann et al., 1995; 1997; 1998; Sengupta et al, 1998; Fukada et al., 1996; Burdon et al., 1999; Auernhammer, Melmed, 2001). Эти работы находятся в самом начале исследований, но уже сейчас можно говорить о возможности негативной регуляции JAK-STAT белками SOCS - семейства супрессоров цитокиновой сигнализации и PIAS -
I РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА | ингибиторами STAT (Alexander, 2002). Белки SOCS, SSI (STAT-индуцированные STAT-ингибиторы) и JAK-связывающие белки ингибируют сигнальный каскад JAK-STAT, вызываемый цитокином LIF (Starr et al., 1997; Auernhammer, Melmed, 2001). В тоже время повышенная экспрессия SOCS ингибирует фосфорилирование gpl30, STAT и активность JAK, что приводит к индукции дифференцировки в плюрипотентных клетках (Auernhammer, Melmed, 2001).
Другой способ негативной LIF-регуляции осуществляется белками семейства P1AS, которые взаимодействуют непосредственно с активированными цитоплазматическими факторами STAT1 и STAT3 и делают их недоступными для связывания с ДНК (Auernhammer, Melmed, 2001).
В настоящее время выявлен еще один путь LIF-регуляции плюрипотентности ЭСК млекопитающих - Wnt, который осуществляется через специфический ингибитор BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime) фермента GSK-3 (гликоген-синтаз-киназа-3). Wnt-путь активирует экспрессию эмбриональных транскрипционных факторов Oct-3/4 и Nanog (Sato et al., 2004; Wobus, Boheler, 2005). Считается, что ингибитор BIO может быть перспективным фармакологическим препаратом для регулирования роста и дифференцировки ЭСК млекопитающих при их использовании в регенеративной и заместительной медицине (Wobus, Boheler, 2005; Ogawa et al.,2006).
Таким образом, сигнальная трансдукция через LIF рецептор - это весьма сложный комплекс реакций, приводящих к множественным биологическим эффектам, основанных, прежде всего, на перекресте путей внутриклеточной LIF-сигнализации (Hilton, Gough, 1998).
1.8. ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭСК МЛЕКОПИТАЮЩИХ in vitro.
Решение вопросов дифференцировки ЭСК млекопитающих in vitro и получения в большом количестве клеток определенного фенотипа касаются, прежде всего, прикладных аспектов использования этих клеток в медицине. Сейчас эта проблема широко обсуждается в литературе. ЭСК млекопитающих рассматриваются в качестве потенциальных источников дифференцированной ткани для заместительной терапии при лечении наследственных и дегенеративных патологий, а также для исследования новых лекарственных препаратов (Odorico et al., 2001; Не et al., 2003; Stojkovic et al., 2004; Keller G. 2005; Wobus, Boheler, 2005).
Существенным ограничением для более широкого применения ЭСК млекопитающих в практической медицине являются сложность получения клеток определенного фенотипа и недостаточность фундаментальных знаний по вопросам управления процессами дифференцировки in vitro и in vivo. Несмотря на то, что в этом направлении исследования проводятся с большой интенсивностью, проблема управляемой дифференцировки ЭСК млекопитающих в гомогенную клеточную популяцию с единообразным нормированным фенотипом и функцией остается пока не решенной. До сих пор не обнаружено специфических соединений, воздействующих на ЭСК и заставляющих все клетки популяции дифференцироваться в один тип клеток и ткани. Такие ростовые факторы, как трансформирующий ростовой фактор (TGFbl) и активин-А, вызывают преимущественную дифференцировку ЭСК в производные мезодермы. Ретиноевая кислота, эпидермальный фактор роста (EGF), ВМР-4, фактор роста фибробластов (bFGF) и CNTF - в производные мезодермы и эктодермы. Нейрональный фактор роста (NGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) - в производные всех трех зародышевых листков (Shuldiner et al., 2000; Boheler et al., 2002; Wobus, Boheler, 2005). Поэтому главной целью современных исследований в области изучения направленной дифференцировки ЭСК является получение in vitro популяции, обогащенной определенными типами функционально активных клеток. Другое направление, представляющее интерес для практической медицины - это разработка эффективных методов идентификации дифференцированных ЭСК и их последующей сортировке от клеток другого типа и недифференцированных предшественников, которые могут быть потенциально опасносными при введении в организм реципиента.
Как правило, для запуска процессов дифференцировки ЭСК in vitro используют различные приемы культивирования, например, рост ЭСК в суспензии в виде ЭТ, сокультивирование с соматическими клетками взрослого организма без использования специальных индукторов дифференцировки. Однако более эффективным способом индукции ЭСК является использование различных химических соединений и факторов роста (Kelly, Rezzino, 2000; Reubinoff 2000; Boheler et al., 2002, Wobus, Boheler, 2005; Keller, 2006). В частности, на ЭСК мыши показано, что при переводе этих клеток с фидерных условий культивирования на ПЭФ мыши в суспензионные и при отсутствии в ростовой среде цитокина LIF, развитие идет в направлении дифференцировки и образования ЭТ (Wobus et al., 1997; 2002; Boheler et al., 2002).
Уже в самых первых работах (Deutschman, 1984) было показано, что в ЭТ обладают способностью воспроизводить in vitro эмбриогенез. В этих сложных структруных образованиях есть и плюрипотентные клетки, которые могут быть источниками линий ЭСК, и разные типы первично дифференцированных эмбриональных клеток экто-, мезо- и эндодермы. Наличие плюрипотентных клеток в составе ЭТ, а также возможность этих многоклеточных структур воспроизводить эмбриогенез in vivo и давать множественные типы эмбриональных дифференцировок подтверждается при пересадке плюрипотентных клеток, выделенных из ЭТ, в бластоцисты реципиента (Rohwedel et al., 1999; Wobus, Boheler, 2005).
При отсутствии цитокина LIF в среде культивирования изначально в ЭТ формируется наружный слой эндодермально-подобных клеток с дальнейшим их развитием в эмбриональную эктодерму и мезодерму. Если перенести такие ЭТ в культуру in vitro, процесс дифференцировки спонтанно продолжится в направлении различных специализированных типов клеток, включая сердечные, скелетные и гладкомышечные, гематопоэтические, панкреатические, нерональные, глиальные и жировые клетки. Таким образом, дифференцированная популяция ЭТ всегда будет гетерогенной популяцией, представленной разными типами клеток (рис. 6).
эск
ЭМБРИОИДНЫЕ ТЕЛЬЦА і \ 'ш':
ПАНКРЕАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ
НЕЙРОНЫ
КАРДИОМИОЦИТЫ V. и скклктнык мышцы
ГЛАДКИЕ МЫШЦЫ ЭПИТЕЛИЙ ГЕПАТОЦИТЫ
МЕЗОДЕРМА ЭКТОДЕРМА ЭНДОДЕРМА
Рис. 6. Примеры различных типов дифференцировок ЭТ мыши в условиях развития in vitro, (по Wobus, Boheler, 2005).
Тип индуцируемой дифференцировки ЭТ мыши и эффективность ее достижения в условиях культуры зависят от плотности ЭСК и ЭТ, состава среды культивирования (в частности, высокая концентрация глюкозы и аминокислот могут быть индукторами дифференцировку ЭТ), присутствия различных ростовых факторов и фетальной сыворотки в среде, а также рН и осмолярности (Bader et al., 2000; Itskovitz-Eldor et al., 2000; Odorico et al., 2002; Boheler et al., 2002; He et al., 2003, Armstrong et al., 2006).
Было показано, что разные линии ЭСК человека и мыши обнаруживают разный потенциал к эмбриональным дифференцировкам in vitro (Kawase et al., 1994; Gao et al., 2003; Schoonjans et al., 2003; Wobus, Boheler, 1997; 2005). Характерной особенностью ЭСК человека является то, что индукция их дифференцировки в культуре может проходить спонтанно после удаления клеток фидерного слоя или же при переводе в суспензионные условия культивирования. ЭТ человека, как и ЭТ мыши, гетерогенны по клеточному составу и экспрессии маркерных генов, ответственных за дифференцировку нейрональных, кардиальных и панкреатических типов клеток (Bader et al., 2000; Reubinoff et al, 2000; Itskovitz-Eldor et al., 2000). В опытах Schuldiner et al. (2000) на линиях ЭСК человека с большой убедительностью показано, что ни один из восьми используемых в качестве индукторов дифференцировки ростовых факторов, не вызывает монодифференцировку. В настоящее время можно говорить только о преимущественном сдвиге направления развития ЭСК и ЭТ в сторону экто-, мезо- и эндодермы. По данным литературы эффективность индуцируемой дифференцировки при использовании ЭТ мыши и человека небольшая и дает низкий выход специализированных клеток и невысокую воспроизводимость результатов (Bader et al., 2000; Boheler et al., 2002; He et al., 2003; Keller, 2006). Безусловно, причиной низкой эффективности развития ЭТ в заданном направлении является исходная морфологическая и функциональная гетерогенность смешанной популяции ЭСК (Boheler et al., 2002; Не et al., 2003).
Однако использование ЭСК млекопитающих и их производных, по всей видимости, в самом недалеком будущем может оказаться наиболее эффективным способом воздействия как на фенотип клеток, составляющих органы или ткани взрослого организма, так и на их поведение в организме. Уже сейчас пересадки миобластов, трансфицированных генами hgf и/или igfl, могут стимулировать регенерацию и сохранение массы мышц при различных формах ускоренного старения или миодистрофии (Sheehan et al., 2000). Дифференцированные стволовые клетки после трансплантации в поджелудочную железу формируют инсулинсекретирующие клетки и секретируют инсулин. Это является единственным кардинальным методом лечения диабета I типа. Таким образом, трансормированные линии ЭСК человека могут стать новым источниками для заместительной терапии таких больных (Гривенников, Шкуматов, 2002; Hon et al., 2004).
Другим перспективным направлением в исследованиях на ЭСК млекопитающих является получение на основе этих клеток разных типов кардиомиоцитов (Klug et al., 1996; Caspi, Gepstein, 2006). Прорыв в этих исследованиях был сделан после того, как удалось выделить из гетерогенной популяции ЭТ человека кардиомиоциты, охарактеризовать и идентифицировать их как нодальные, атриальны, вентрикулярные клетки и клетки Пуркинье (Klug et al., 1996; Jackson et al., 2001; Beltrami et al., 2001, Caspi, Gepstein, 2006). Недавние исследования показали, что эмбриональные кардиомиоциты разных типов могут выживать в области инфаркта, дифференцироваться и улучшать работу сердца (Гривенников, Шкуматов, 2002, Не et al., 2003; Caspi, Gepstein, 2006).
Наибольшие успехи в направленной дифференцировке ЭСК млекопитающих достигнуты при получении неирональных и глиальных клеток in vitro. По данным разных авторов, индукция дифференцировки ЭСК млекопитающих с помощью ретиноевой кислоты и методов генетической трансфекции достигает от 15% до 100% (Гривенников, Шкуматов, 2002; Мао, Lee, 2005). При использовании таких экспериментальных подходов из ЭСК можно получить практически гомогенную популяцию неирональных клеток. Специфика индукции дифференцировки с использованием ретиноевой кислоты состоит в том, что этот химически агент активирует формирование ЭТ (Wobus et al., 1997; Gajovic et al., 1998) и рост эктодермальных и мезодермальных производных (Schuldiner et al, 2000). Однако трансплантация генетически измененных ЭСК поднимает вопрос о Т-клеточном иммунном ответе, вызванном синтезом чужеродного белка (Fischbach et al., 2004). Тем не менее, рассмотренные примеры свидетельствуют о возможности получения неограниченного количества зрелых человеческих нейронов для медицинских целей (Гривенников, Шкуматов, 2002; Kim et al., 2002; Мао, Lee, 2005; Keller, 2006).
Полученные из ЭСК нейрональные клетки растут in vitro в течение нескольких дней и дают положительную реакцию на окрашивание различными нейрон-специфическими маркерами. Показано, что их дифференцированный статус поддерживается в течение 6 месяцев после трансплантации в мозг крыс, страдающих болезнью Хангтингтона (Dinsmore et al., 1996). Другой распространенный индуктор дифференцировки ЭСК -ДМСО, как правило, дает смешанную популяцию, состоящую из мышечных клеток, куда входят кардиомиоциты, клетки гладкой и скелетной мускулатуры (Dinsmore, Solomob, 1991; Dinsmore et al., 1996; Burdon et al, 1999).
Известно, что дифференцировка плюрипотентных линий ЭСК в специализированные типы мышечных клеток контролируется геном MyoD -специфическим регулятором мышечной дифференцировки у млекопитающих (Dinsmore et al., 1994, 1996). Высокий уровень экспрессии гена MyoD в сочетании с действием ДМСО обеспечивают рост ЭСК млекопитающих в направлении скелетных миобластов, которые способны к слиянию в миофибриллы и к спонтанным сокращениям.
Несмотря на то, что из ЭСК млекопитающих сейчас получают in vitro нейрональные, мышечные и эпителиальные клетки (Slager et al., 1993; Dinsmore et al., 1996; Reubinoff 2000; Kelly, Rezzino, 2000; Odorico et al., 2001; Boheler et al., 2002; Mao, Lee, 2005; Keller, 2005), кардиомиоциты (Jackson et al., 2001; Boheler et al., 2002; He et al., 2003; Caspi, Gepstein, 2006), клетки крови (Keller et al., 1993; Jackson et al., 2002) и кератиноциты (Bagutti et al., 1996), вопрос использования ЭСК для заместительной терапии остается открытым. Успех экспериментальных исследований на ЭСК и ЭТ млекопитающих породил ряд этических проблем, особенно, если они касаются использования ЭСК для терапевтического клонирования (Hochedlinger et al., 2003). Поэтому предпочтение на данный момент отдается стволовым клеткам соматического происхождения, среди которых первое место занимают мезенхимальные стволовые клетки костного мозга.
Таким образом, несмотря на успешное применение ЭСК млекопитающих в экспериментальных исследованиях по индукции разных типов дифференцировок in vitro, до сих пор остается не ясным поведение этих клеток после их пересадки в организм. Не решены также проблемы регулирования развитием ЭСК и не определены факторы, влияющие на плюрипотентность и дифференцировку. Хотя предложены разные гипотетические схемы регуляции поведения ЭСК in vitro и in vivo, характер развития этих клеток зависит от стадии клеточного цикла, микроокружения, состава среды, а также присутствия в среде различных регуляторных факторов, под влиянием которых могут активироваться как процессы дифференцировки, так и неограниченного роста. Такими регуляторными факторами для ЭСК млекопитающих в условиях культуры in vitro чаще всего являются рекомбинантные белки цитокинов. При чем для каждого вида плюрипотентны ЭСК выявлены факторы преимущественного действия. Для линии ЭСК мыши - это рекомбинантный цитокин LIF.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2.1. ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ.
Для создания конструкций и получения рекомбинантного LIF белка в прокариотах использовали плазмиды pQE-16, pQE-30 (Qiagen) и pET-28b (Invitrogen, США), а также pcDNA3 (Invitrogen, США) для синтеза в эукариотах.
2.2. КЛОНИРОВАНИЕ КДНК ГЕНА lif.
Ген lif мыши был выделен из обонятельного эпителия мыши с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen) в соответствии с рекомендациями пpoизвoдитeля( iorLAnaT>urificatiori/FroniAnimalAndPlantTissuesBacteriaYeastAndFungi/RNY_M ini/1035969_HB.pdf). Обратно-транскриптазную полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили с помощью системы Superscript Ш RNase Н Reverse Transcriptase (Invitrogen) и ген-специфичных праймеров, содержащих на 5'-концах последовательности сайтов рестрикции (BamHI и Xbal для pcDNA3, EcoRI и Hindlll для pET28b, BamHI и Bglll для pQE-16, BamHI и HindIIInJMpQE-30).
Векторы конструировали с применением прямых и обратных праймеров: atagaattcgaaggtcttggccgca-ataaagcttctagaaggcctggacca (рЕТ28Ь), AAGGATCCATGAAGGTCTTGGCCGCA-AAAGATCTCTAGAAGGCCTGGACCAC (pQE-16), AAGGATCCATGAAGGTCTTGGCCGCA-AAAAAGCTTCTAGAAGGCCTG (pQE-30), AAGGATCCATGAAGGTCTTGGCCGCA-AATCTAGACTAGAAGGCCTGGACCAC (pcDNA3).
Полученная кДНК гена ///"была использована для ПЦР-амплификации с помощью TAQ-ДНК полимеразы (Promega) для наработки и последующего клонирования ///^фрагмента. ПЦР проводили в амплификаторе фирмы "Терцик" (Россия) в пробирке на 0,5 мкл (Eppendorf, Германия) под слоем вазелинового масла. Реакции ставили в объемах смеси: 25 мкл (для аналитических) и 100 мкл (для препаративных целей).
Условия реакций: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.4 при 20С), 50 мМ КС1, 1.5 мМ MgCb, 200 мМ каждого нуклеотидтрифосфата (dNTP), 0.25 мМ каждого праймера, 0.01-0.001 мкг ДНК-матрицы и 5 ед. Taq-полимеразы. Температуру отжига для праймеров определяли по алгоритму (). Программа ПЦР: 1) 95С-2 мин (1 цикл);
2) денатурация - 95 С - 30 сек, отжиг - 59С - 40 сек, 30 циклов синтез - 72С - 60 сек; -3)72С-5мин; 4) 4С - хранение. После амплификации ПЦР-фрагмент вырезали из геля, очищали с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, n/QQ_Spin/l 03 6019_Qiag_Complete.pdf) и определяли его размер электрофоретическим анализом в 1 % агарозном геле.
Клонирование ///-фрагмента проводили в разные векторные системы (pcDNA3, pET28b, pQE-16, pQE-30). Количество вставки варьировало в зависимости от количества ДНК вектора и составляло, в среднем, 100 нг на 1 мкг плазмиды. Для этого ДЖ вектора и вставки обрабатывали эндонуклеазами рестрикции: ВашШ, Bglll, Xbal, EcoRI, Hindlll, в течение 2 ч при 37С в присутствии 1-30 ед. активности перечисленных ферментов (рис. 7). Объем реакционной смеси в разных вариантах опыта составлял 10-100 мкл. Реакции проводили в соответствующих для данных ферментов буферах по методике (Sambrook et al., 1989).
Все четыре использованных в работе ДНК-вектора и //^фрагмент дотировали в соотношении 8:1 в 20-30 мкл смеси с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (MBI Fermentas, Литва) в течение 16 ч при 14С. Реакции проводили при следующих условиях: 50мМ Трис-HCl (рН 7.6), ЮмМ MgCb, 1мМ АТР, 1мМ дитиотреитол (DTT), 5% полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ), 5 ед. Т4 ДНК-лигазы. Эффективность лигирования проверяли рестриктным и электрофоретическим анализом в 1 % агарозном геле (гл. 2.3.). Лигазной смесью для увеличения числа копий гена /// трансформировали компетентные клетки E.coli штамма DH5a.
Трансформацию E.coli DH5a проводили по методу Са-преципитации (Sambrook et al., 1989). Трансформированные клетки культивировали на чашках Петри с LB-агаром (бакто-триптон, дрожжевой экстракт, NaCl и бакто-агар, Difco, США) в течение 16-18 ч при 37 С, содержащим для каждой конструкции свои селективные антибиотики (для pcDNA3-// pQE30-//f и pQEl6-///100 мкг/мл ампициллина, 50мкг/мл канамицина для рЕТ28Ь-///).
Из устойчивых к селективным антибиотикам клонов, содержащие рекомбинантные конструкции pcDNA3-// pQE30-// pQE16-///*H pET28b-// выделяли плазмидную ДІЖ с использованием Miniprep Kit (Promega, ). Выделенную ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, ПЦР и рестрикционного анализа. Определение концентрации ДНК проводили относительно ДНК-маркера с шагом в 100 п.н. (Fermentas, Литва).
2. 3. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ.
На каждом этапе работы с рекомбинантной ДНК (рестрикционный анализ, лигирование, выделение ДНК) проводили электрофорез на горизонтальных пластинах с 1-2% агарозным гелем (Sigma, США), приготовленным на ТАЕ-буфере (0.05М трис-НСІ, 0.05М ацетат натрия, 0.5 мкг/мл бромистого этидия, 5мМ ЭДТА, рН 8.0). Перед нанесением ДНК на гель в пробы добавляли Loading буфер (0.25% раствор бромфенолового синего, 0.25% раствор ксилолцианола, 30% раствор глицерина) в соотношении 5 к 1 (v/v).
Электрофорез проводили в режиме 5-Ю В/см геля в течение 0.5-2.0 ч в зависимости от размеров анализируемых фрагментов. ДІЖ выявляли при помощи ультрафиолетового трансиллюминатора при длине волны 312 нм (Vilber Lourmat, Франция).
2.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА lif.Идентичность нуклеотидной последовательности рекомбинантной
ДНК pET28b-/# pQE30-///, pQE16-///h pcDNA3-///K последовательности гена lif мыши оценивали путем секвенирования на автоматическом секвенаторе (Applied Biosystems). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерных программ "GENEPRO" ("Riverside Scientific Enterprises", 1988) и "Omiga" (Oxford Molecular Ltd., 1999).
2.5. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОКАРИОТИЧЕСКОГО БЕЖА LIF.
Для получения рекомбинантного белка LIF в прокариотических системах использовали несколько штаммов E.coli: BL21(DE3), Rosetta и Ml5. Плазмидную конструкцию pET28b-///" вводили в BL21(DE3) и Rosetta, а pQE16-///"b штамм E.coli Ml5.
Трансформацию компетентных клеток проводили из расчета 0.5 мкг плазмидной ДНК на 2x10 кл/мл в 800 мкл реактивной смеси методом Са-преципитации (гл. 2.2., Sambrook et al, 1989). Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с LB-агаром, содержащим селективные антибиотики (50мкг/мл канамицина - для BL21DE3; 25 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина - для М15; 50 мкг/мл канамицина и 34 мкг/мл хлорамфениколла - для штамма Rosetta) и выращивали в течение 16-18 ч при 37С.
Индукцию синтеза рекомбинантного белка в разных штаммах E.coli проводили путем добавления в среду культивирования 1 мМ изопропилтиогалактозила (ИПТГ). Для этого одиночную колонию трансформированных клеток-продуцентов переносили в 5 мл среды LB с селективными антибиотиками, помещали на термостатируемый шейкер (Biosan, Овен, Россия) и культивировали в виде суспензии в течение ночи при 37С. Полученную суспензию клеток разбавляли селективной средой в 50-100 раз и доращивали до оптической плотности 0,4 - 0,6 при длине волны 400 нм (Spekord, Германия).
По достижении такой оптической плотности в суспензию добавляли ИПТГ, после чего клетки выдерживали 4 ч при 37С. Биомассу собирали центрифугированием (Hettich, Германия) в течение 20 мин при 4000 об/мин. Осадок клеток хранили при -70С (Sanyo, Япония) для последующего использования с целью очистки и выделения белка.
Осадок трансформированных клеток, после их индукции 1мМ IPTG, растворяли в лизис-буфере (6М гуанидин-гидрохлорид, 20 mM NaH2P04, 500 тМ NaCl, рН 7.8) при комнатной температуре (10 мин.) с последующим трехкратным лизированием по 5 сек. на ультразвуковом дезинтеграторе (УСДН-5, Россия). Лизат осаждали центрифугированием при 4000 об./мин./20 мин. (Hettich). Из полученного супернатанта выделяли рекомбинантный белок LIF. Очистку рекомбинантного белка проводили на колонках для аффинной хроматографии (BioRad, США).
В качестве носителя использовали 1 мл суспензии Ni-агарозы (Ni-NTA, никель-нитрилоуксусная кислота) фирмы BioRad, США. Суспензию наносили на колонку и 2 раза промывали 4.0 мл специального буфера (СБ) для связывания белка в денатурирующих условиях (8 М мочевины, 20 тМ NaH2P04, 500 мМ NaCl, рН 7.8). На подготовленный таким способом носитель наслаивали 8мл супернатанта, содержащего рекомбинантный белок, и инкубировали 15-30 мин. с Ni-NTA. После инкубации колонку промывали по 2 раза 4 мл СБ с разными значениями рН (7.8, 6.0, 5.3, 4.0) по методу (). Полученные после каждой элюции фракции анализировали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата-Na (SDS) в полиакриламидном геле (ПААГ).
2. 6. БЕЛКОВЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПААГ.
Цитокины семейства LIF
Цитокин LIF принадлежит к семейству интерлейкина-6 (IL-6), куда входят также IL-6, IL-11, кардиотропин-1 (СТ-1), онкостатин М (OSM), целюлярный нейрональный трофический фактор (CNTF) и недавно открытый кардиотропин - подобный цитокин/цитокин-подобный фактор - cardiotrophin like cytokine/cytokine-like factor-1, CLC-CLF (Tomida, 2000; Robb et al., 2002;
Dimitnadis et al., 2005). Некоторые из перечисленных цитокинов (LIF, OSM, СТ-1 и CNTF) связываются с а-цепью LIF-рецептора. Связывание каждого цитокина с его рецептором приводит к димеризации с трансмембранным гликопротеином gpl30 и, в результате, образованию высокоаффинного рецептора с последующей активацией сигнального трансдуктора JAK (Janus kinase), пути передачи сигнала (JAK/STAT) и фактора транскрипции STAT (Hilton, 1992; Taga et al., 1997; Heinrich et al., 1998; Niwa, 2001).
Наравне с другими представителями этого семейства, LIF вовлечен в процессы нейрогенеза, гематопоэза и эмбриогенеза. В системе in vitro LIF секретируется в различных клетках и тканях, клеточных линиях, включая гепатоциты, адипоциты, остеобласты, мегакариоциты; нейрональные, мышечные клетки и ЭСК (Hilton, 1992; Aloisi et al., 1994, Auernhammer, Melmed, 2001). Однако основной уровень LIF-экспрессии в тканях взрослого организма обычно столь низок, что может быть обнаружен только при помощи Northern-blot анализа. Транскрипция гена ///и, как результат, синтез и секреция белка, повышаются в большинстве тканей в ответ на стимулирование бактериальными продуктами, например, липополисахаридами, IL-6, IL-1 и G-CSF (Brown et al., 1994) или ингибируется противовоспалительными агентами - глюкокортикоидами, IL-4,IL-13(Chabaudetal., 1998).
Показано, что продукция LIF взаимосвязана с процессами инфекции и воспаления (Wesselingh et al., 1994). При исследовании сывороток здоровых и больных пациентов была найдена корреляция между количеством циркулирующего в крови LIF и степенью воспаления. В сыворотке здоровых людей цитокин LIF в основном не диагностируется. Сыворотка пациентов с мягкой инфекцией или воспалением содержит низкий уровень LIF, в то время как пациенты с септическим шоком обнаруживают достаточно высокий уровень LIF в крови (Waring et al., 1992, Auernhammer, Melmed, 2001).
Физиологически наиболее важное и интересное место продукции LIF -это эндометрий (Stewart et al., 1992; Yang et al., 1995; 1996; Auernhammer, Melmed, 2001). Максимального значения концентрация LIF в эндометрии достигает в период имплантации бластоцисты в матку (Bhatt et al., 1991). Это показано не только на мышах, но и на других млекопитающих (Kojima et al, 1994; Dimitriadis et al, 2005). Цитокин LIF сильный иммунно-эндокринный модулятор, играющий ключевую роль в процессах подержания беременности у животных и человека (Smith et al., 1998; Vogiagis, Salamonsen 1999; Robb et al., 2002; Dimitriadis et al., 2005).
Плазмидные векторы
Клонирование ///-фрагмента проводили в разные векторные системы (pcDNA3, pET28b, pQE-16, pQE-30). Количество вставки варьировало в зависимости от количества ДНК вектора и составляло, в среднем, 100 нг на 1 мкг плазмиды. Для этого ДЖ вектора и вставки обрабатывали эндонуклеазами рестрикции: ВашШ, Bglll, Xbal, EcoRI, Hindlll, в течение 2 ч при 37С в присутствии 1-30 ед. активности перечисленных ферментов (рис. 7). Объем реакционной смеси в разных вариантах опыта составлял 10-100 мкл. Реакции проводили в соответствующих для данных ферментов буферах по методике (Sambrook et al., 1989).
Все четыре использованных в работе ДНК-вектора и // фрагмент дотировали в соотношении 8:1 в 20-30 мкл смеси с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (MBI Fermentas, Литва) в течение 16 ч при 14С. Реакции проводили при следующих условиях: 50мМ Трис-HCl (рН 7.6), ЮмМ MgCb, 1мМ АТР, 1мМ дитиотреитол (DTT), 5% полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ), 5 ед. Т4 ДНК-лигазы. Эффективность лигирования проверяли рестриктным и электрофоретическим анализом в 1 % агарозном геле (гл. 2.3.). Лигазной смесью для увеличения числа копий гена /// трансформировали компетентные клетки E.coli штамма DH5a.
Трансформацию E.coli DH5a проводили по методу Са-преципитации (Sambrook et al., 1989). Трансформированные клетки культивировали на чашках Петри с LB-агаром (бакто-триптон, дрожжевой экстракт, NaCl и бакто-агар, Difco, США) в течение 16-18 ч при 37 С, содержащим для каждой конструкции свои селективные антибиотики (для pcDNA3-// pQE30-//f и pQEl6-///100 мкг/мл ампициллина, 50мкг/мл канамицина для рЕТ28Ь-///).
Из устойчивых к селективным антибиотикам клонов, содержащие рекомбинантные конструкции pcDNA3-// pQE30-// pQE16-/// H pET28b-// выделяли плазмидную ДІЖ с использованием Miniprep Kit (Promega, http://www.promega.com/tbs/tb225/tb225.pdf). Выделенную ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, ПЦР и рестрикционного анализа. Определение концентрации ДНК проводили относительно ДНК-маркера с шагом в 100 п.н. (Fermentas, Литва).
Экспрессия гена и/в разных типах клеток
Для получения рекомбинантного белка LIF мы использовали ген ///"из обонятельного эпителия мыши, в котором он активно экспрессируется (Getchell et al., 2002). По данным рестриктного анализа и секвенирования выделенный ген имел размерность 0.6 kb (рис. 7, 8), и его нуклеотидная последовательность соответствовала гену lif мыши. Этот ген встраивали в разные экспрессионные системы для того, чтоб ответить на вопрос, какие типы клеток-продуцентов могут синтезировать биологически активный белок LIF мыши. Для этой цели мы использовали три прокариотические векторные системы: pQE-16, pQE-30 и pET28b, а также эукариотическую плазмиду pcDNA3 для экспрессии гена ///"мыши в клетках линии Cos-І (рис. 7).
Отличительной особенностью использованных нами прокариотических векторов являлось наличие в их полилинкерах последовательности 6-ти гистидиновых остатков (6XHis) для последующей очистки рекомбинантного белка с применением высоко аффинной никель-нитрилоуксусной кислоты (Ni-NTA) в качестве хроматографической матрицы. Такой подход используется во многих исследованиях по получению рекомбинантных белков из разных типов клеток-продуцентов (Sulkowski, 1985; Jaenicke, Rudolph, 1990).
Для наработки рекомбинантного белка LIF были использованы три штамма-продуцента E.coli: Ml5 - для pQE-///, Rosetta и BL21(DE3) - для рекомбинантной конструкции рЕТ28Ь-/// Компетентные клетки E.coli штамма Ml 5 содержали репрессорную плазмиду pREP-4, которая регулирует экспрессию рекомбинантного белка. После добавления индуктора ИПТГ в среду культивирования происходит его связывание с белком lac репрессора, кодируемого плазмидой pREP-4, и последующее инактивирование репрессора. В результате, РНК-полимераза клеток-продуцентов считывает последовательность рекомбинантного гена и запускает синтез рекомбинантного белка.
Штаммы E.coli BL21(DE3) и Rosetta содержали ген РНК полимеразы фага Т7 под контролем лактозного промотора (lacUVS), ответственного за биосинтез рекомбинантного белка. Такие системы достаточно хорошо репрессированы, и в клетках-продуцентах BL21(DE3) и Rosetta синтез РНК-полимеразы фага Т7 индуцируется добавлением ИПТГ без дополнительного введения плазмиды pREP-4. Кроме того, наш выбор E.coli Rosetta был обусловлен тем, что этот штамм распознает редкие кодоны и может повышать уровень экспрессии рекомбинантного белка LIF.
