Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 10
Глава 1. Химия алюминия 10
Глава 2. Источники алюминия 13
Глава 3. Содержание алюминия в пищевых продуктах 14
Глава 4. Токсические эффекты алюминия 16
Токсический эффект алюминия на растения 18
Токсический эффект алюминия иарыб... 21
Влияние алюминия на другие водные организмы 22
Влияние алюминия иа млекопитающих 23
Токсический эффект алюминия на человека 24
Глава 5. Предполагаемые заболевания, вызываемые алюминием 26
Глава 6. Модели исследования действии алюминия на живые системы.. 31
Материалы и методы исследования 44
Глава 1. Получение клеточных препаратов 44
Глава 2. Проточная цитометрия 46
Распределение клеток по размерам и гранулярности 49
Определение количества мертвых кіеток 49
Определение внутриклеточного уровня АФК 50
Определение уровня цитоплизматического кальция 51
Определение мембранного потенциала 51
Протокол эксперимента 52
Глава 3. Обработка экспериментальных результатов 53
Результаты исследования и их обсуждение 54
Глава 1. Характеристика клеток с помоидыо проточной цитометрии 54
Глава 2. Влияние АІСЬ на размеры и гранулярность нейронов и тимоцнтов 63
Глава 3. Влияние хлористого алюминия на уровень внутриклеточного кальция и АФК в нейронах и тимоцитах 74
Глава 4. Мембранный потенциал и смертность клеток 86
Глава 5. Экзайтотоксическое действие алюминия 96
Заключение 99
Выводы 105
Благодарности 106
Список литературы 107
- Содержание алюминия в пищевых продуктах
- Предполагаемые заболевания, вызываемые алюминием
- Проточная цитометрия
- Влияние АІСЬ на размеры и гранулярность нейронов и тимоцнтов
Введение к работе
Алюминий является одним из самих распространенных металлов на земле. Алюминий широко представлен в окружающей среде, и все живые существа поглощают его с пищей. При этом зачастую наблюдается накопление алюминия в тканях, поскольку в живых клетках не выработалось специфических систем, способных к его экскреции.
Проблема безопасности употребления алюминия с пищей или водой давно беспокоит людей. Накопление алюминия в организме интенсивно изучается, и существующие факты свидетельствуют о том, что этот процесс в мозге может сопровождать возникновение и развитие таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и паркинсонизм (Crapper et al, 1976; Trapp et al, 1978; Graves et al, 1990).
В то же время, представления о токсичности алюминия для организма человека до сих пор неоднозначны. Для людей, живущих в областях с повышенным содержанием алюминия в окружающей среде, обнаружена корреляция между содержанием алюминия в воде и частотой проявления болезни Альцгеймера (БА) (Martyn et al. 1989; Forbes et al. 1992).
Однако известны и примеры, отмечающие отсутствие у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями накопления алюминия в тканях мозга по сравнению со здоровыми людьми. Расхождения в экспериментальных данных происходят, вероятно, из-за отсутствия достаточной информации о его локализации в пораженных участках мозга, а также и о механизмах его действия на возбудимые ткани.
Так или иначе, увеличивающееся производство алюминия для нужд промышленности и расширяющееся применение алюминиевых изделий в быту делают необходимым количественную оценку его токсического влияния на живые системы.
Содержание алюминия в пищевых продуктах
Показано, что алюминий может вызывать как стимуляцию, так и подавление электрического ответа в разных типах клеток. Однако точных данных о распространении алюминия в целом организме животных или растений (в частности, в разных тканях) неизвестно.
Алюминий имеет высокую степень связывания и слабую реакционную способность по сравнению с такими двухвалентными металлами, как кальций или магний. Поэтому катион алюминия является эффективным ингибитором во многих биологических процессах (Exely and Birchall, 1992). Это подтверждается большим количеством исследований о воздействии металлов на растения, рыб и птиц. Особенно сильно присутствие алюминия отражается на рыбах, живущих в пресной воде.
Восприимчивость клеток к кальцию в присутствии алюминия изменяется. Аккумуляция кальция из внешней среде изменяется в присутствии алюминия. Эти взаимоотношения были достаточно хорошо изучены на модели рыб. Токсичность алюминия у рыб была показана по восприимчивости клеточных мембран к алюминию при разных концентрациях ионов кальция в окружающей среде. Когда концентрация кальция в окружающей среде была низкой, клеточные мембраны были более чувствительны к алюминию. Увеличение концентрации кальция приводило к уменьшению связывания алюминия с клеточной мембраной и поглощения его клеткой. Клетки, находящиеся в обедненной кальцием среде под влиянием алюминия имели менее структурированную мембрану, за счет чего и увеличивалось неспецифическое проникновение ионов в клетку, что приводило к увеличению внутриклеточной концентрации алюминия.
Эпидемиологические данные относительно алюминия показывают, что у людей наблюдаются нарушения, аналогичные тем, что были продемонстрированы на рыбах (Garruto, 1991).
Другой точкой приложения алюминия является трансферин, который является основным железо-переносящим белком в физиологических процессах. Трансферин хорошо связывает алюминий и плохо его высвобождает в нейтральной и слегка щелочной средах (Abreo et al, 1990; Cochran et al, 1991). Связывания алюминия с трансферином препятствует внутриклеточному транспорту железа с помощью этого переносчика (McGregor et al, 1990).
Механизмы воздействия алюминия на биологические мембраны и процессы его аккумулирования внутрь клеток зависят от многих факторов, таких как тип клеток, физико-химический состав клеточной мембраны и наличие белков переносчиков (Bertholf, 1987; Johnson, 2005). В слабо кислой среде (рН 6-7) выявляются три главных способа переноса алюминия: (1) пассивная диффузия незаряженного продукта алюминия с некоторыми анионами, например, AIF3 (Deloncle et al, 1990); (2) пассивная диффузия алюминиевых коагулятов, опосредованная их связыванием с мембранными переносчиками (Exley et al. 1991), сопровождающаяся деструктурирующим воздействием алюминия на клеточную мембрану (Viersta and Haug, 1978); (3) поглощение алюминия посредством пиноцитоза (Akeson and Munns 1990). В более щелочной среде поглощения алюминия при помощи белков переносчиков не показано. Однако Cochran et al. (1990) продемонстрировали, что перенос алюминия через клеточную мембрану есть энергетически зависимый процесс, возможно, включающий перенос кальция и увеличение рН.
Токсический эффект алюминия на растения. Многие исследования показали, что алюминий влияет на корни и стебли растений (Hartwell and Pember, 1918; McLean and Gilbert, 1927; Clarkson, 1965; Goransson and Eldhuset, 1987; Yamamoto, 2002). Ионы алюминия поглощаются растениями и аккумулируются главным образом в корнях и корневых волосках, приводя к редуцированию площади корневых чехликов, что мешает их росту (Rorison, 1960; Fleming and Foy, 1968). Такие корни становятся короткими, толстыми и хрупкими. Когда под влиянием алюминия рост побегов также подавляется, они желтеют, багровеют и вянут.
Концентрация кальция, магния, фосфора и калия уменьшается в корнях и стеблях растений, отравленных алюминием (Rorison, 1965; Clarkson and Sanderson, 1971; Siegel and Haug, 1983). Это может возникать благодаря конкуренции алюминия и кальция за белки, переносящие кальций (например, кальмодулин). А1-Р комплекс накапливается в смоле и способствует уменьшению мембранного потенциала в корнях и уменьшение количества Р в клетках (McCormic and Borden, 1974).
Токсичность алюминия у растений существенно уменьшается при добавлении различных компонентов среды. Весьма эффективным является комплекс алюминиевых лигандов, включающих в себя гидроокись алюминия. Соли щелочноземельных металлов, таких как СаСЬ, где анион не выступает в качестве лиганда для алюминия, не обладают способностью защищать растения от токсичности алюминия (Cramer and Lauchli, 1986; Khasawneh, 1971). При добавлении других солей кальция токсичность алюминия на растения уменьшается.
Предполагаемые заболевания, вызываемые алюминием
Данных о том, что алюминий выполняет какие-либо полезные функции в организме человека, не обнаружено (Zatta, 2003). Общее количество алюминия в организме практически здорового человека составляет менее 50 мг. При этом большая часть тканей содержит менее 4 мг алюминия на 1 кг сухого веса. Так, в печени алюминия содержится 4,1 мг/кг, в селезёнке - 2,6 мг/кг, в костях - 3,3 мг/кг, в сердце - 1,0 мг/кг, в мышцах - 1,2 мг/кг, в сухой обезжиренной ткани головного мозга - 2,4 мг/кг, и только в лёгких алюминий содержится в количестве 43 мг/кг. Содержание алюминия в мозге и в лёгких увеличивается с возрастом (WHO, 1997).
Несмотря на высокое содержание алюминия в природной среде, в организм ежедневно поступает 2-3 мг этого элемента. Определенная часть этого количества поглощается в желудке и проксимальном отделе двенадцатиперстной кишки, откладываясь в печени, костях и сером веществе головного мозга. Избыточному поступлению алюминия в организм препятствует гомеостатический механизм, который способствует выделению этого микроэлемента с мочой. В тех случаях, когда поступление экзогенного алюминия возрастает, в 20 - 40 раз увеличивается его выделение с мочой, которое может достигать 200 - 500 мг в сутки. Тест суточного выделения алюминия с мочой является одним из самых важных показателей функции почек, так как при их недостаточности, в частности, у 80% больных уремией, концентрация алюминия в моче повышена (Alfrey,1976; Scholtz, 1987; Tokutake, 1995).
Другим путём поступления в организм является парентеральное питание, в том числе у больных с нормальной функцией почек. Внутривенное введение больным казеина, обычно существенно загрязненного алюминием, может приводить к значительному накоплению алюминия в организме. В этих случаях организм больного не способен освободиться от избытка алюминия, который накапливается в печени и в костях. Если в норме в печени содержится около 4 мг/кг алюминия, то при задержке алюминия у пациентов с полным парентеральным питанием его содержание доходит до 100 мг/кг. Не менее отчётливы соответствующие соотношения концентраций алюминия в костях - вместо 3,3 мг/кг в норме в некоторых случаях парентерального гипералюминоза его содержание повышается до 265 мг/кг. При гипералюминозах наблюдается отсутствие макрофагальной реакции. На стадии дискуссии находится вопрос о лимфогенном пути распространения алюминия в организме (Oteiza,2004; Oteize, 1993 ; Shin, 2000). Организм человека обычно защищен от возможного патогенного воздействия этого элемента рядом физиологических механизмов, среди которых важное место занимает регулярная экскреция. При нарушении гомео статических механизмов возникают патологии, связанные с избыточным накоплением алюминия в организме. Все эти болезни и синдромы накопления получили название алюминозов. Суммируя факты, полученные в результате многолетних исследований, можно выделить несколько алюминозов — отличающихся различной степенью тяжести и распространённости.
Простое накопление алюминия в ЦНС — хронический процесс, доброкачественный старческий алюминоз с минимальными или умеренными признаками снижения нейропсихической функции у людей старше 65 лет. Такой нейроалюминоз, как правило, не диагносцируется и относится к проявлениям нормального старения. Патологоанатомически при доброкачественном старческом алюминозе в ЦНС обнаруживается относительно небольшое повышение содержания алюминия в нейронах (Alshuaib, 2003; Nayak, 2002). 2. Отложения алюминия при болезни Лльцгеймера (БА), то есть при старческом слабоумии с тяжёлыми поражениями нейропсихической сферы, более ранними и быстро протекающими дегенеративными процессами в мозговом плаще, подкорковых ганглиях, вторичной гидроцефалией, элективной деструкцией гиппокампа, ядер переднего мозга, в частности, базального ядра Мейнерта. Биохимически для БА характерно нарушение обмена холинэргических нейротрансмиттеров, в частности, угнетение холинэстеразы и других ферментов, обеспечивающих холинэргические механизмы. При этой болезни алюминий оказывается прочно связан с ДНК, что ведёт к глубоким механизмам нарушения трансляции и транскрипции в нейронах. Нарушение нейрофибриллярного аппарата ведёт к нарушению механизма аксональной передачи, дисгармонии рецепторной активности и к характерной дегенерации дендритов. Но, несмотря на это, синтез белков в клетке может быть повышен. Есть доказательства связи патогенеза БА с отложением алюминия, но это не является явным подтверждением трактовки БА как злокачественного алюминоза - существуют и другие факторы (Munoz, 1998; Shin, 1994).
Проточная цитометрия
Метод лазерной проточной цитометрии разработан сравнительно недавно (30 лет назад). Современный метод проточной цитометрии позволяет обнаруживать и характеризовать быстрые события: происходящие с каждой клеткой в измеряемой в суспензии, двигающейся в потоке со скоростью до 30 000 клеток в секунду.
Проточные цитометры позволяют производить качественный и количественный анализ физических и биологических параметров клеток, и могут использоваться как для клинических, так и для научных исследований. Проточные цитометры производства компании "Beckman Coulter, Inc." (США) позволяют исследовать сотни клеток в секунду и получать достоверную информацию о размерах, структуре и субпопуляционном составе клеточной суспензии. Пропускная способность прибора в ручном режиме составляет до 60 образцов в час.
Эти приборы позволяют производить измерения параметров клеток в динамике, в режиме реального времени, полностью исключая химическое или физическое воздействие на клетку в ходе эксперимента. Клеточная суспензия, предварительно меченая флуоресцирующими красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют: рассеяние света под малым углом, рассеяние света под углом 90 и интенсивность флуоресценции по четырем каналам.
Измерение этих характеристик позволяет определить размеры клеток, структуру, субпопуляционный состав клеточной суспензии, а также многие другие физиологические параметры. Мы характеризовали свойства клеток по нескольким параметрам: размеру, гранулярности и флуоресценции используемых клеточных зондов. Измерения проводили на приборе Beckman Coulter, EPICS ALTRA.
Исследуемая суспензия клеток под давлением поступает в капилляр, где, сдавливаемая по бокам "обволакивающей жидкостью" (бидистиллированной водой под высоким давлением), образует поток из одного ряда клеток. Это позволяет сфокусированному лазерному лучу пересекать только одну клетку. Прибор измеряет следующие параметры: прямое светорассеяние (Forward scattering, FS), которое соответствует рассеянию света клеткой под углом от 2 до 19 и характеризует размер клеток, и боковое рассеивание (Side scattering, SS), фокусируемое под углом 90, характеризующее гранулярность клеток (Рис. 2) (Haynes, 1988). Прибор снабжен светофильтрами, позволяющими регистрировать флуоресценцию в красной и зеленой областях спектра флуоресценции (Рис. 3). Распределение клеток по размерам и гранулярности. Как показано на рисунке, нижняя область представляет собой совокупность событий, меньших по параметру FSC чем нормальные клетки. Это определяли по калибровочным шарам с диаметром 6 микрон, с помощью которых настраивали прибор, клетки нейронов имеют размеры от 9 микрон. Во время выделения клеток, многие из них повреждаются, поэтому в суспензии наряду с живыми клетками находятся обломки мертвых, которые, тем не менее, воспринимаются прибором. Поэтому для дальнейшей обработки результатов брали клетки, лежащие выше этой границы. Определение количества мертвых клеток. Пропидий йодид (PI, А.ех 485 нм, и Хет 610 нм) проникает только в мертвые клетки, имеющие мембранные дефекты, и прокрашивает нуклеиновые кислоты, образуя с ними t стойкие комплексы. Таким образом, мертвые клетки имеют преимущественно красное свечение. Для окраски некротических клеток в пробу добавляли PI в конечной концентрации 10 мкМ за 5 мин до измерения, окраска остается стабильной в течение 10-30 мин. Определение внутриклеточного уровня АФК. Для регистрации изменения уровня свободных радикалов в клетках использовали — карбокси-2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (CDCF-DA) (Haugland, 2002). CDCF-DA - не заряженная, не флуоресцирующая молекула, которая легко проникает через цитоплазматическую мембрану клетки. В цитоплазме эстеразы отщепляют ацетатные группы от этой молекулы и она превращается в карбокси-2,7-дихлордигидрофлуоресцеин (CDCF), несущий отрицательный заряд и не способный покидать клетку. Таким образом, CDCF накапливается в клетках, где он может окисляться перекисью водорода или Fe2+ до флуоресцирующего продукта карбокси-2,7 - дихлорфлуоресценна (CDCF). Количество накопленного CDCF в клетках может быть измерено по увеличению флуоресценции при 530 нм (возбуждение происходит при длине волны 485 нм). Его растворяли на безводном диметилсульфоксиде так, чтобы концентрация растворителя в образце была не выше 0,1 %. Конечная концентрация CDCF в образце составляла 100 мкМ, % Определение уровня цитоплазматического кальция. Для регистрации концентрации внутриклеточного кальция используется краситель Fluo-3 AM. Fluo-3 AM, как и CDCFH2-DA, изначально незаряженная молекула, она проникает через мембрану и подвергается действию эстераз, приобретая заряд. Fluo-3 AM не способен флуоресцировать, пока не свяжется с кальцием, при возбуждении молекулы светом с длиной волны 488 нм она начинает испускать свет с длиной волны в районе 530 нм (Haugland, 2002). Этот краситель также растворяли в дим етил сульфоксиде и вносили в пробу до конечной концентрации 20 мкМ.
Влияние АІСЬ на размеры и гранулярность нейронов и тимоцнтов
Инкубация клеток с хлористым алюминием приводит к его быстрому накоплению во внутреннем пространстве клеток. В результате этого при инкубации нейронов и тимоцитов с хлористым алюминием наблюдается изменение расположения клеток в координатах прямого и обратного рассеивания. Осмотический эффект алюминия имеет отчетливую временную и концентрационную зависимость, причем тимоциты более чувствительны к алюминию, чем нейроны.
Как в бескальциевой, так и в безнатриевой среде эффект алюминия не претерпевает заметных изменений. Это позволяет заключить, что обнаруженный нами осмотический эффект алюминия не опосредован внеклеточными ионами кальция или натрия, а развивается независимо. В процессе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерение доли мертвых клеток, выявляемых по окраске с PI. Обнаружилось, что инкубация клеток с АІСІз увеличивает окрашиваемость клеток йодистым пропидием, что означает проявление условий для развития некроза. При инкубации нейронов с хлористым алюминием обнаруживается рост внутриклеточной флуоресценции CDCF и FIuo-3 AM, которые считаются маркерами на АФК и свободные ионы кальция. При добавлении в пробы нарастающей концентрации алюминия А1СЬ (50 мкМ - 5 мМ) флуоресценция CDCF и Fluo-3 AM увеличивалась, что должно было соответствовать увеличению количества АФК и внутриклеточного кальция. Одновременно наблюдалась некротическая гибель клеток. Для выяснения роли внеклеточного кальция в токсическом эффекте хлористого алюминия мы провели аналогичные эксперименты в среде с удалением ионов кальция из инкубационной среды и выяснили, что как в нормальных условиях, так и в бескальциевой среде эффект алюминия не претерпевает заметных изменений. Эти опыты позволили заключить, что обнаруженный нами токсический эффект хлористого алюминия развивается независимо от внеклеточного кальция.
Для выяснения того, какую роль играет внутриклеточный кальций в токсическом феномене алюминия, мы провели аналогичные эксперименты с внутриклеточным кальциевым буфером ВАРТА. Обнаружилось, что клетки, выдержанные 30 мин с 10 мкМ ВАРТА и использованные вслед за этим в опытах с АІСІз, продолжают генерировать флуоресцентный сигнал Fluo-3 AM. Это привело нас к заключению, что наблюдаемый нами сигнал отражает увеличение концентрации в клетках алюминия, а не ионов кальция.
В ходе выполнения описанных экспериментов мы проводили измерения мертвых клеток, выявляя их по окраске PL Обнаружилось, что инкубация клеток с А1С13 увеличивает окрашивание клеток йодистым пропидием. При этом доля мертвых клеток не зависела от присутствия ВАРТА, что позволило заключить, что обнаруженный нами эффект алюминия не опосредован уровнем внутриклеточного кальция, а отражает его собственное токсическое действие.
Для выяснения того, какую роль играет уровень АФК в токсическом действии алюминия, мы провели эксперименты с N-ацетилцистеином. В клетках, предварительно нагруженных N-ацетилцистеином, сигнал CDCF действительно уменьшался, демонстрируя, что он определяется внутриклеточным уровнем АФК. Однако на смертности клеток присутствие антиоксиданта не отражалось. Это свидетельствует, что хотя клетки при инкубации с алюминием генерируют повышенный уровень АФК, свободные радикалы в наших условиях не являются основной причиной клеточной смерти.
При инкубации клеток с хлористым алюминием наблюдается не только рост внутриклеточного уровня АФК, но и деполяризация клеточной мембраны. При этом одновременно наблюдается увеличение процента мертвых клеток. Флуоресценция Fluo-3 AM, DiBAC,t(3) и CDCF нарастает примерно одинаковыми темпами, это демонстрирует наличие общей причины, вызывающей эти процессы - накопления алюминия внутри клеток.
По-видимому, даже незначительное накопление алюминия внутри клетки способны вызывать генерацию АФК и резкую деполяризацию мембраны. Все эти изменения и способствуют клеточной смерти. Для выяснения того, по какому пути осуществляется гибель клеток, мы одновременно применили 2 флуоресцентных красителя - на апоптоз (аннексии V) и некроз (PI). Под влиянием инкубации с хлористым алюминием клетки перемещаются по оси PI, а не по оси аннексина V, что соответствует развитию некроза, а не апоптоза.
Известно, что активация нейронов NMDA вызывает в них генерацию АФК. Мы обнаружили, что алюминий усиливает токсичность NMDA. Способность алюминия усиливать ответ нейронов на NMDA означает, что накопление алюминия в тканях мозга будет представлять собой постоянный фактор риска, создающий угрозу нормальному функционированию нейронов.
