Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЖТЕРАТУРЫ
Структурные основы биологических функций иммуноглобулинов.
1.1. Структура иммуноглобулинов 9
1.2. Механизмы активации эффекторных функций антител 11-12
1.3. Сегментальная гибкость иммуноглобулинов 12-14
1.4. Влияние шарнирного участка на свойства молекул иммуноглобулинов 14-18
1.5. Влияние антигенов на пространственную структуру иммуноглобулинов 18-23
1.6. Система кроличьих анти-полисахаридных igG антител , 23-27
1.7. Антитела как аллостерические белки 27-30
1.8. Конформационные изменения igM антител в результате связывания антигенов 30-33
1.9. Механизмы активации системы комплемента 33-36
I.10.Заключение и общая постановка задачи исследования 37-39
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и методы исследования 40-51
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Температурно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия свиных анти-ДНФ igG антител 52-57
2.2.2.Сольвентно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия свиных анти-ДНФ IgG антител 57-59
2.2.3. Исследование конформавди свиных анти-ДНФ igG антител методом дифференциальной
сканирующей микрокалориметрии 60-70
2.2.4. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия анти- Lac IgG антител кролика 71
2.2.5. Температурно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия мышиных моноклональных анти-ДНФ igGi антител 72-74
ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
З.5 Структура ранних (преципитирущих) и поздних антител 75-84
3.2. Изменение конформавди антител при взаимодействии с антигеном ( ,гаптеном ) 84-88
3.3. Структура мышиных моноклональных анти-ДНФ антител 89-90
3.4. Использование иммуноглобулинов G свиней
в аффинных сорбентах 90-92
ВЫВОДИ 93-94
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...;... 97-114
- Структурные основы биологических функций иммуноглобулинов.
- Температурно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия свиных анти-ДНФ igG антител
- Структура ранних (преципитирущих) и поздних антител
Введение к работе
Актуальность проблемы» Выяснение молекулярных механизмов реакций иммунного взаимодействия имеет большое теоретическое и практическое значение.Закономерности структуры и функционирования иммуноглобулинов,центральных молекул гуморального иммунитета, представляют интерес не только для молекулярной иммунологии, но и для медицины.Знание конформационных свойств иммуноглобулинов необходимо и для решения конкретных практических задач,стоящих перед микробиологической промышленностью,в чаотности,для разработки регламента на получение белка А стафилококков с помощью аффинной хроматографии на иммуноглобулиновых сорбентах.
В настоящее время достигнут значительный прогресс в изучении конформапии иммуноглобулинов,в понимании молекулярных механизмов реакции взаимодействия антител с чужеродными для данного организма веществами - антигенами.В результате взаимодействия антител с антигенами запускается целый ряд эффекторных функций антител,направленных на элиминацию антигена ( реакция связывания и активации белков системы комплемента,фиксация на макрофагах и др.).Однако до сих пор неясно,что происходит с молекулами антител в результате связывания антигенов,каков механизм передачи сигнала с антигенсвязывающего центра на эффекторные центры антител,расстояние между которыми составляет 80 - 100 А.Этот вопрос привлекает внимание многих исследователей,применяющих различные физико-химические и биологические методы.При этом получены самые противоречивые результаты.
В процессе развития иммунного ответа происходит переключение синтеза иммуноглобулинов с одного клаоса на другой.Первыми после иммунизации синтезируются антитела класса igM ,затем антитела класса ig g .причем на смену низкоаффинным антителам Образуются антитела высокоаффинные.Для системы свиных анти- динитрофенильных антител отмечен особый процесс - смена одного типа,вероятно,подкласса иммуноглобулинов g другим.Антитела, выделенные на ранних стадиях иммунного ответа,являются типичными преципитинами.Антитела,образующиеся на более поздних стадиях иммунного ответа,несмотря на высокую константу ассоциации,образуют растворимые комплексы с мультивалентными антигенами.Кроме того;ранние и поздние антитела обладают различной устойчивостью к протеолизу.Структурная основа различных функциональных свойств ранних прецшштирующих и поздних непреципитирующих свиных анти-динитрофенильных антител до настоящего времени не была известна. В то же время феномен переключения типов ( подклассов ) иммуноглобулинов G может играть важную роль в адекватности иммунного ответа.
В связи с этим нами поставлены следующие цель и задачи исследования.
Цель работы : изучение конформационных изменений,индуцированных связыванием антигенов і в молекулах антител, имеющих различную структуру и выделенных из животных разных видов.
Задачи исследования :
1. Выявить конформационные различия между ранними преципитирую- щими и поздними непреципитирующими IgG антителами свиньи к динитрофенильным группам.
2. Изучить изменение конформации свиных анти-динитрофенильных
IgG антител и кроличьих анти-фениллактозидных igG антител при взаимодействии с антигенами ( гаптенами ).
3. Выявить конформационные различия моноклональных мышиных анти-динитрофенильных антител,продуцируемых двумя различными гибридомами и принадлежащих к I подклассу иммуноглобулинов G . _ 7 -
4. На основании проведенных исследований сруктуры иммуноглобулинов g свиньи дать рекомендации по их использованию для синтеза аффинного сорбента,применяемого для выделения белка А стафилококков.
Научная новизна. Получены данше,свидетельствующие о том; что конформапионные изменения,индуцированные связыванием антигена, не ограничиваются антигенсвязывающими центрами,а захватывают всю молекулу антител.Впервые показано^что конформапионные изменения, обусловленные связыванием антигена,зависят от типа ( подкласса ) иммуноглобулинов и структуры вариабельных доменов.
Получены данные о различной структуре двух типов свиных ан-ти-динитрофенильных антител,ранних преципитирующих и поздних не-преципитирующих,подтверждающие предположение о том,что эти антитела являются подклассами свиных иммуноглобулинов g .Ранние антитела характеризуются большей стабильностью взаимодействия между Сн2 и Сн3 доменами;чем поздние антитела,что объясняет.различную устойчивость к протеолизу этих антител при определенных значениях рН.В то же время ранние антитела имеют меньшую жесткость структуры других частей молекулы по отношению к температурной пертурбации.Конформапионные изменения,индуцированные гаптеном," больше для ранних преципитирующих антител.
Показано j4to структура вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей в мышиных моноклональныханти-динитрофенильных антителах, принадлежащих к одному подклассу igd и имеющих & тип легкой цепи,существенно влияет на конформационную лабильность молекулы антитела по отношению к температурной пертурбации и связыванию антигена.
Практическая ценность. Данные о конформационных свойствах иммуноглобулинов g свиньи использованы при создании имму-.носорбента,обладающего повышенной устойчивостью к действию протеаз при кислых значениях рН.Кроме того,этот сорбент более экономичный по сравнению с иммуносорбентом на основе igG человека. На основе шщунооорбентаісодержащего в качестве иммобилизованного белка IgG свиньи,разработан лабораторный регламент получения белка А стафилококков и налажено производство опытных партий белка А на базе НИКТИ биологически-активных веществ ( г.Новосибирск ),что позволило в течение 1982 - 1983 гг. сэкономить около 600 тысяч инвалютных рублей.
Структурные основы биологических функций иммуноглобулинов
Иммуноглобулины - это сывороточные гликопротеины,которые синтезируются и секретируются В лимфоцитами как антитела против различных антигенов. Антигены - чужеродные вещества или измененные в результате мутационных и других повреждений собственные молекулы и клетки. ( 7,12 ).В сыворотке присутствует 5 классов иммуноглобулинов ( G ,М,А,Д,Е ),среди которых наиболее распространенный и изученный класс иммуноглобулинов G ( 17,72,73, III,112 ). На Рис.1 схематично представлена структура молекулы иммуноглобулина G 1 человека.
Эти белки состоят из двух полипептидных цепей, называемых тяжелыми н цепями;молекулярный вес которых 50000, и двух легких ь цепей с молекулярным весом 25000. Цепи соединены между собой дисульфидными связями. Каждая полипептидная цепь состоит из гомологичных участков По НО аминокислот, которые формируют в пространстве сходные и относительно независимые глобулярные структуры - домены ( 47 ) .Н цепи построены из 4 доменов, L цепи - из двух доменов. N -концевой домен Н цепи называется вариабельным Vy ,три остальных - константными - Сн1 , Сн2 и С 3, Два домена L цепи обозначаются vL ( вариабельный ) и С ( константный ) .Константные домены различных иммуноглобулинов имеют сходные аминокислотные последовательности, вариабельные - различные, определяющие специфичность данного иммуноглобулина, Собственно вариабельными являются только определенные участки этих доменов, которые называются гипервариабельными. Гипервариабельные згчастки образуют антигенсвязывающие центры антител ( 139 ).Молекула иммуноглобулина G подразделяется на два Fab фрагмента и Рс фрагмент,соединенные т.н. шарнирным участком Н цепи.
Основная масса работ по структурным исследованиям сделана на миеломных иммуноглобулинах классов G ,А и М ( 16,17,37,48-51,72,73,87,110-112 ) человека и мыши.Принято считать,что структура индуцированных и миеломных иммуноглобулинов сходна ( 7 ).
Для всех доменов иммуноглобулинов характерен общий способ трехмерного строения полипептидной цепи,который так и обозначается - "иммуноглобулиновый тип укладки" ( 17,110-112 ).Структуру каждого домена можно представить в виде двух -складчатых слоев, которые окружают внутреннее гидрофобное ядро.Каждый Ji слой построен из нескольких вытянутых отрезков полипептидной цепи,расположенных антипараллельно.Антипараллельные згчастки соединяются сегментами (петлями),некоторые из которых имеют спиральную конфигурацию, другие же - неупорядоченную конформацию. $-складчатые слои соединены внутренней дисульфидной связью и стабилизируются водородными связями.
Интересно отметить,что взаимодействие между доменами различных цепей сильнее,чем между доменами одной цепи,что определяет подразделение РаЪ субъединицы на два модуля V и С, а
Рс субъединицы на С и Сн3 модули ( III,112 ).СН3 домены контактируют друг с другом довольно тесно и напоминают в этом отношении С модуль РаЪ субъединицы.С домены не взаимодействуют между собой,так как между ними расположен углеводный компонент ( 72,73 ).
Температурно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия свиных анти-ДНФ igG антител
Температурно-пертурбащонный дифференциальный спектр свиных антител представлен на Рис. 2 .Спектр тлеет два максимума -на 288 нм и 294,5 нм."Красный" сдвиг максимумов в спектре антител по сравнению с модельными спектрами тирозина и триптофана в водном растворе - 287 нм и 292 нм,соответственно, - свидетельствует о менее полярном характере микроокружения хромофоров в белке.Пертурбируемые температурой тирозиновые остатки имеют микроокружение, полярность которого моделируется 25 - 4В% раствором этиленгликоля, тогда как для окрркения триптофановых остатков хорошей моделью является 45 - 50% раствор этиленгликоля.
В изученном интервале температур зависимость амплитуды максимумов ТПДС антител от температуры имеет линейный характер ( Рис.3 ).Это позволяет использовать для определения числа пертурбируемых хромофоров температурный инкремент экстинкции, предложенный Демченко и Зима ( 3,38 ).Данные по температурной пертурбации хромофоров в изученных белках представлены в таблице $ 2.
Два типа свиных анти-динитрофенильных антител,ранние (пре-пдпитирующие) и поздние (непреципитирующие ),заметно отличаются по количеству пертурбируемых температурой тирозиновьк остатков - 91% и 64%,соответственно.Достоверных отличий по температурной пертурбации триптофановых остатков нет.В РаЪ и Рс фрагментах ранних антител пертурбируется больше тирозиновых остатков по сравнению с фрагментами поздних антител,но отличия меньше, чем для интактных антител.Отличий по пертурбации триптофановых остатков нет.
Структура ранних (преципитирущих) и поздних антител
В нашей работе была поставлена задача изучить структурные различия двух типов свиных анти-дшштрофенильных антител,имеющих различные функциональные свойства.
Свиные анти-динитрофенильные IgG антитела,образующиеся на ранних и поздних стадиях иммунного ответа на введение динит-рофенилированного бычьего IgG ,обладают различными свойствами ( 59-61 ).Антитела,образующиеся на ранних этапах иммунного ответа, прецшштиругот мультивалентные антигены в широком интервале концентраций антигена.Эти антитела называются прецшштирующшли-ранними.Антитела,появляющиеся на поздних стадиях иммунного ответа, прецшштируют антиген неполностью и,исключительно,в узкой зоне избытка антител ( 59 ),йз очень поздних иммунных сывороток молено выделить антитела,которые полностью потеряли способность преципитировать мультивалентные антигены ( 61 ).Однако,поздние непреципитирующие анти-динитрофенильные антитела свиньи являются более аффинными антителами,чем ранние превдпитирующие антитела той же специфичности.Константа связывания,определенная для гаптена - ДНФ-лизина - имеет значение 6,7 X Ю5 1.Г1 для ранних антител и 1,8 X Ю7 М"1 для поздних антител ( 59 ).Несмотря на то,что поздние антитела не могут образовывать нормальную преци-питационную решетку с мультивалентными антигенами,в их молекулах нет стерических ограничений для взаимодействия с крупными антигенами.Эти антитела способны связывать по две молекулы ДНФ-БСА или ДО-ССА одновременно ( 60 ).
Непреципитируюпре поздние антитела в комплексе с антигеном активируют систему комплемента таюке эффективно,как и преципити - 76 рующие антитела ( 61 ).Интересно отметить,что нецреципитпрующие антитела под действием гидрофильных полимеров типа декстрана или полиэтиленгликоля превраідаются в преципктиругощие антитела, то есть приобретают способность образовывать правильную преципи-тационную решетку с антигеном ( 60 ).
Несмотря на значительные функциональные различия,прецшшти-рутощие (ранние) и непрецишітирутощие (поздние) свиные анти-диьштро-фенильные антитела принадлежат к одному классу - иммуноглобулинам G и обладают сходными антигенными свойствами ( 59 ). Структурные основы различных функциональных свойств двух типов свиных антител до конца не выяснены.В нашей работе сравнительное исследование структуры этих антител проведено методами пертурбационной спектрофотометрии и сканирующей микрокалориметрии.
