Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 13
1.1 Ассоциативные азотфиксирующие ризобактерии рода Azospirillum 13
1.2 Взаимодействие рода Azospirillum с корнями растений и роль отдельных метаболитов в этом процессе 15
1.3 Липополисахариды грамотрицательиых баїсгерий и их роль во взаимодействии с растениями 19
1.3.1 История исследования липополисахаридов грамотрицательиых бактерий 19
1.3.2 Липополисахариды грамотрицательиых бактерий, их топология в клетке и функции 20
1.3.2.1 Роль липополисахаридов в реализации растительно-микробных взаимодействий 24
1.3.3 Особенности первичной структуры липополисахаридов и связанные с пей функции 26
1.3.3.1 Структура и функции липида А 29
1.3.3.2 Структура и функции олигосахарида кора 34
1.3.3.3 Структура и функции О-специфических полисахарид пых цепей 36
1.4 О-аптигеиные свойства и серологическая классификация липополисахаридов различных видов бактерий 38
1.4.1 Серологические исследования бактерий рода Azospirillum 40
1.5 Характеристика методов исследования липополисахаридов 42
1.5.1 Выделение и очистка липополисахаридов 42
1.5.2 Разделение липидного и углеводного компонентов липо-полисахарида 44
1.5.3 Изучение строения О-специфических полисахаридов 46
1.5.3.1 Деструктивные химические методы с применением газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии 46
1.5.3.2 Структурный анализ полисахаридов методом ядерного магнитного резонанса 49
1.6 Липополисахариды и О-специфические полисахариды бактерий ро- № Azospirillum 53
Материалы и методы 57
2.1 Микробные культуры и условия их выращивания и хранения 57
2.2 Приборы и материалы 59
2.3 Методы исследования липополисахаридов бактерий рода Azospirillum 61
2.3.1 Экстракция липополисахаридов азоспирилл 61
2.3.2 Хроматографические методы 61
2,3.2.1 Гель-фильтрация 61
2.3.2.2 Ионообменная хроматография 63
2.3.2,3 Газо-жидкостная хроматография 64
2.3.2,3.1 Определение состава жирных кислот липо полисахаридов 64
2.3.2.3.2 Определение моносахаридного состава поли сахаридов 64
2.3.2.3.3 Определение абсолютных конфигураций моносахаридов 65
2.3.3 Колориметрическое определение состава углеводсодержащих полимеров 65
2.3.4 Получение антител 65
2.3.5 Реакция агглютинации 66
2.3.6 Встречная двойная иммунодиффузия 66
2.3.7 Электрофорез в полиакриламидном геле 66
2.3.8 Иммуиоферментный анализ (ELISA) 67
2.3.9 Выделение О-полисахаридов кислотным гидролизом липополисахаридов 67
2.3.10 Распад по Смиту 67
2..11 Анализ полисахарида методом метилирования по Хакомори 68
2.3.12 Масс-спектрометрия частично метилированных ацетатов полилов 68
2.3.13 ЯМР - спектроскопия 69
2.3.14 Методы работы с ДНК 69
Результаты исследований и их обсуждение 70
3.1 Выделение, хроматографическая очистка и исследование химического состава липополисахаридов 70
3.2 Выделение и исследование липидов А 75
3.3 Получение и характеристика антител на ЛПС бактерий A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС1 80
3.4 Выявление общих антигенных детерминант у ЛПС различных штаммов и видов азоспирилл с использованием полученных антител 84
3.5 Сравнительное исследование О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense S17, Cd, SR75, A. irakense КВС1 и A. Upoferum Sp59b 96
3.5.1 Выделение О-специфических полисахаридов, определение их моносахар ид ного состава и абсолютных конфигураций нейтральных моносахаров методом ГЖХ 96
3.5.2 Определение характера замещения моносахаридных остатков методом метилирования с последующей ГЖХ-масс-спектрометрией 100
3.5.3 Выявление структур повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий A. brasilense S17, Cd, SR75, A. irakense КВС1 и A. Upoferum Sp59b методом 'Н и 13С-ЯМР-спектроскопии 103
3.5.3.1 Исследование структуры повторяющегося звена О-специфического полисахарида A. irakense КВС1 103
3.5.3.2 Исследование структуры повторяющегося звена О-специфических полисахаридов бактерий A. Upoferum 8р59ЬиЛ. brasilense Cd 108
3.53.3 Исследование структуры повторяющегося звена О- специфического полисахарида Л. brasilense SR75 112
3.5.3.4 Исследование структуры повторяющегося звена О- специфического полисахарида A. brasilense S17 117
3.6 Деление липополисахаридов бактерий A. brasilense Sp245, SR75, Cd, Sp7, S17, A. lipoferum RG20a, Sp59b и A. irakense KBCl на хемотипы 125
Заключение 128
Выводы 136
Список использованной литературы 137
- Взаимодействие рода Azospirillum с корнями растений и роль отдельных метаболитов в этом процессе
- Разделение липидного и углеводного компонентов липо-полисахарида
- Микробные культуры и условия их выращивания и хранения
- Получение и характеристика антител на ЛПС бактерий A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС1
Введение к работе
Актуальность темы. Исследования азотфиксирующей активности в корневой зоне небобовых растений и свойств микробов, за неё ответственных, стали основой отдельного направления в прикладной микробиологии, посвященного изучению явления ассоциативной азотфиксации. Наибольший интерес среди бактерий, осуществляющих ассоциативное взаимодействие с корнями растений, представляют Azospirillum spp. Эти микроорганизмы относятся к группе ризобактерий, стимулирующих рост растений, благодаря потенциально высокой азотфиксирующей активности, способности продуцировать фитогормоны и иные физиологически активные вещества (Okon and Vanderleyden, 1997). Начальным и важнейшим этапом формирования ассоциации является адсорбция микроорганизмов на корнях растений.
Известно, что в прикреплении бактерий к корням участвуют как неспецифическая сорбция, которая определяется зарядом и гидрофобностью бактериальной поверхности, так и специфические взаимодействия, которые на разных стадиях опосредуются поверхностно локализованными белками и полисахаридами (ПС) (Michiels et al., 1991; Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Выявление молекулярных механизмов «узнавания» и клеточного контакта корней злаков и бактерий рода Azospirillum требует изучения компонентов клеточной поверхности и материалов, секретируемых в окружающую среду, среди которых полисахаридам микроорганизмов отводится существенная роль (Del Gallo et al., 1989; Del Gallo and Haegi, 1990; Konnova et al., 1994; Коннова с соавт., 1995; Skvortsov and Ignatov, 1998; Коннова с соавт., 1999; Коннова с соавт., 2001; Федоненко с соавт., 2001; Fedonenko et al., 2002; Коннова с соавт., 2003; Федоненко с соавт., 2004; Коннова с соавт., 2005). Следовательно, одним из ключевых направлений в изучении этой проблемы следует признать анализ строения и функций различных структурных элементов клеточной поверхности почвенных ассоциативных микроорганизмов, так как они являются соединениями, непосредственно материализующими процесс взаимодействия.
Азоспириллы продуцируют ряд ПС и полисахаридсодержащих полимеров, играющих важную роль во взаимодействии с растениями, и выполняющих ряд других биологических функций. Однако недостаток информации о структуре углеводных компонентов поверхности микроорганизмов препятствует формированию целостной картины взаимодействия бактерий с растениями на молекулярном уровне.
Особый интерес представляет исследование липополисахаридов (ЛПС) - главного компонента внешней мембраны грамотрицательных бактерий. ЛПС, специфичность в контактных взаимодействиях которых определяют полисахаридные составляющие, играют важную роль в серотипировании грамотрицательных бактерий (Rietschel et al., 1994; Варбанец и Винарская, 2002; Caroff and Karibian, 2003). Основываясь на строении О-специфических цепей, бактериальные штаммы одного рода разделяют на хемотипы (Kauffmann, 1960). В литературе большое
внимание уделено детальному серологическому анализу фитопатогенных бактерий (Kauffmann, 1957; Kauffmann et at, 1961; Книрель, Кочетков, 1994; Варбанец, 1994; Pier, 2003), в то время как аналогичные аспекты изучения ассоциативных азотфиксаторов находятся на периферии исследовательских интересов.
Дальнейшее изучение структурных и серологических особенностей индивидуальных препаратов поверхностных полисахаридных антигенов бактерий рода Azospirillum остается актуальным как для таксономических исследований, так и для выяснения их роли в процессах взаимодействия с корнями растений.
В связи с этим целью работы было выявление структурных особенностей ли-пополисахаридов и серологического родства бактерий рода Azospirillum.
Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:
выделение гомогенных препаратов липополисахаридов внешней мембраны бактерий A. brasilense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b, RG20a;
анализ биополимерного состава липополисахаридов названных выше микроорганизмов, а также состава жирных кислот липидов А;
проведение серологических исследований различных штаммов азоспирилл при помощи поликлональных кроличьих антител, полученных на препараты липополисахаридов;
выделение О-специфических полисахаридов из липополисахаридов, и определение первичной структуры повторяющихся звеньев О-специфических полисахаридов бактерий: A. irakense КВС\,А. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, SR75 и S17.
Научная новизна работы. Впервые установлена тонкая химическая структура ОПС, выделенных из ЛПС пяти штаммов трех видов азоспирилл, из которых А. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b являются типовыми для соответствующих видов микроорганизмов.
Впервые продемонстрировано сходство повторяющихся звеньев ОПС бактерий рода Azospirillum, принадлежащих к разным штаммам одного вида (A. brasilense Sp245 и A. brasilense SR75), и к разным видам (A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd). На примерев, brasilense SI7 установлено наличие в составе ЛПС двух существенно отличающихся по структуре О-специфических полисахаридов, в которых выявлено присутствие 1Ч-ацетил-В-глюкозамина и неуглеводного заместителя (8)-3-гидроскибутирата.
Проведено деление исследованных штаммов бактерий рода Azospirillum на се-рогруппы, а соответствующих ЛПС на хемотипы.
Научно-практическая значимость. Данные о структурах ОПС азоспирилл необходимы для понимания молекулярных механизмов формирования растительно-микробных ассоциаций.
Полученная нами информация о первичной структуре О-специфических полисахаридов^, irakense КВС\, A. brasilense Cd, A. lipoferum Sp59b,A brasilense SR75 и A. brasilense SI7, а также результаты серологического исследования могут быть использованы при установлении филогенетического родства с другими бактериальными видами.
Препараты ЛИС и ОПС A. brasilense, A. lipoferum, A. irakense, а также поликло-нальные кроличьи антитела на препараты ЛИС применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лаборатории биохимии, лаборатории физической химии клеточных структур, лаборатории микробиологии и микологии, лаборатории растительно-бактериальных симбиозов Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН). Полученные антитела необходимы для дальнейшего серологического анализа коллекционных культур азоспи-рилл, а также вновь изолированных из природной среды микроорганизмов.
Результаты диссертационной работы используются в ходе преподавания студентам биологического и химического факультетов СГУ курсов: «Основы глико-логии» и «Методы химии и биохимии углеводов», а также при подготовке курсовых и дипломных работ учащимися этих факультетов.
Представленные в диссертации разработки включены в подготовленное для студентов и аспирантов, специализирующихся в области бактериохимии, учебно-методическое пособие: «Выделение и анализ гликополимеров растительного и бактериального происхождения» / Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2005 г. 40 с, (в соавторстве с С.А. Конновой, Ю.П. Федоненко, О.А. Сачковой), одобренное Учебно-методической комиссией биологического факультета и Ученым советом СГУ им. Н.Г. Чернышевского.
Апробация работы. Материалы исследований, изложенные в диссертации, были представлены на 7-й, 8-й, 9-й, 10-й Международных Путинских школах -конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века» (Пущино, Россия, 2003 - 2006 гг.), на 4-й, 5-й Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, Россия, 2003, 2005), на 7-й, 8-й Молодежных научных школах - конференциях по органической химии (Екатеринбург, Россия, 2004; Казань, Россия, 2005), на 3-й Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004), на 2-й, 3-й Региональных школах-конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, Россия, 2004, 2006), на Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты» (Саратов, Россия, 2005), на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005), на 2-й конференции стран Балтии по микробным углеводам (Росток, Германия, 2006).
Доклад «Структурное и серологическое исследование О-антигена бактерий Azospirillum brasilense Cd», представленный на научной конференции студентов и аспирантов «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, Россия, 2005) был удостоен диплома первой степени.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории биохимии ИБФРМ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 7 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Липополисахариды бактерий рода Azospirillum на основании структурных исследований их О-специфических полисахаридов разделены на четыре хемотипа. К первому отнесены липополисахариды штаммов A. brasilense Sp245, SR75; ко второму -A. lipoferum Sp59b и A. brasilense Cd; к третьему -A. irakense КВС1; и к четвертому -A. brasilense S\7,A. lipoferum SpBrl7.
Идентичные структуры повторяющихся звеньев характерны для О-специфических полисахаридов двух пар штаммов A. brasilense Sp245, SR75 и для A. lipoferum Sp59b,A brasilense Cd.
Бактерии рода Azospirillum на основании серологических исследований разделены на две серогруппы. К первой отнесены A. brasilense Sp245, SR75 и A. lipoferum RG20a, а ко второй - A. lipoferum Sp59b, A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7, A. irakense KBC1 и A. brasilense S17.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 288 источников, в том числе - 225 зарубежных. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 13 таблиц.
Работа выполнена в лаборатории биохимии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Структуры гликополимеров и их функции в растительно-микробных взаимодействиях» (№ госрегистрации 0120.0403358).
Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований: в 2002-2004 гг. «Структура липополисахаридов и О-специфических полисахаридов бактерий рода Azospirillum» № 02-04-48224, в 2005-2006 гг. «Сравнительное исследование структуры липополисахаридов и О-специфических полисахаридов серологически родственных штаммов бактерий рода Azospirillum» № 05-04-48123, а также грантами Президента РФ на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных школ на выполнение научных исследований НШ-1529.2003.4 в 2003 - 2005 гг. и НШ - 6177.2006.4 в 2006 г.
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору С.А. Конновой, а также заведующему лабораторией биохимии ИБФРМ РАН заслуженному деятелю науки Российской Федерации, доктору биологических наук, профессору В.В. Игнатову за неоценимую поддержку на всех ключевых этапах выполнения данной работы. Автор выражает благодарность за плодотворное сотрудничество коллегам из лаборатории биохимии - к.б.н., с. н. с. Ю.П. Федоненко, к.б.н., н. с. И.В. Егоренковой, ст. лаб-иссл. О.А. Сачковой, сотрудникам ИБФРМ РАН д.б.н., с.н.с. Л.Ю. Матора, к.б.н., н.с. Г.Л. Бурыгину, к.х.н., с.н.с. О.Е. Макарову, д.б.н., с.н.с. Е.И. Кацы, к.б.н., н.с. И.В. Борисову, а также сотрудникам лаборатории химии углеводов ИОХ РАН (Москва).
Взаимодействие рода Azospirillum с корнями растений и роль отдельных метаболитов в этом процессе
Ассоциация бактерий рода Azospirillum с корнями растений является эффективной только в том случае, если микроорганизмы в состоянии выживать в почве и колонизировать корневую систему хозяина. Известно, что последняя выделяет в окружающую почву так называемые корневые эксудаты. Подвижность и хемотаксис дают возможность бактериям передвигаться к корням растения, где они используют питательные вещества, входящие в состав эксудатов, как источник углерода и энергии. Точный механизм того, как азоспириллы взаимодействует с корнями, еще не изучен (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000). Хемотаксис требует не только хемо-аттрактантов, но также напрямую зависит от бактериальной подвижности. Известно, что подвижность Azospirillum обеспечивается двумя видами жгутиков (Krieg and Dobereiner, 1984; Moens et al, 1995). В жидких средах индивидуальные клетки азоспирилл (Mot+) плавают благодаря вращению одиночного полярного жгутика (Fla). При концентрации агара в среде от 4 г/л и выше на бактериальных клетках появляются также многочисленные латеральные флагеллы (Laf).
При использовании мутантов A. brasilense, различающихся по подвижности, было показано, что перемещение является необходимым условием для инициации бактериальной колонизации (Vande Broek et al, 1998). Благодаря движению бактериальных флагелл, клетки способны перемещаться в более выгодные для жизнедеятельности условия. Флагеллы также играют важную роль в процессах прикрепления микроорганизма к растению-хозяину (Moens and Vanderleyden, 1996).
Изучение молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе формирования ассоциативного типа взаимоотношений, затруднено скрытым, слабо проявляющимся морфологически характером растительно-бактериального взаимодействия (Michiels et al., 1991), в отличие от бобово-ризобиального симбиоза.
Прикрепление бактерий к корням растения-хозяина является основой для образования эффективной ассоциации. Используя эксперименты in vitro, было показано, что этот процесс является двухфазным. На первом этапе единичные бактериальные клетки быстро адсорбируются на корнях, причем этот процесс происходит быстро, является слабым и носит обратимый характер. Есть данные о том, что фазу адсорбции опосредует полярный жгутик (Michiels et al, 1991).
Сразу за адсорбцией следует фаза «заякоривания», во время которой формируются бактериальные агрегаты, необратимо закрепляющиеся на поверхности корней. Предполагается, что эта фаза обусловлена продукцией бактериями экзополи-сахаридов (ЭПС) и капсульных полисахаридов (КПС). Было показано, что в состав капсульного материала бактерий рода Azospirillum входят сложные полисахаридсо-держащие комплексы: липополисахарид-белковые (ЛПБК) и полисахарид-липидные (ПСЛК) (Коннова с соавт., 1995; Skvortsov and Ignatov 1998; Коннова с соавт., 1999). Внеклеточные полисахариды иногда рассматривают как продукт сверхсинтеза гликанов клеточной стенки (Sutherland, 1972). Однако в большинстве случаев их образование является самостоятельным процессом.
В литературе отмечено, что формирование агрегатов азоспириллами при адсорбции на корнях растений происходит за счет фибриллярного материала (Patri-quin et al, 1983; Boddey et al, 1986). Однако тонкие механизмы этого процесса при формировании растительно-микробной ассоциации до конца не выяснены. Известно, что экстраклеточные полисахариды могут формировать фибриллоподобные структуры (Skvortsov and Ignatov, 1998; Burdman et al, 1998).
Кроме того, было выдвинуто предположения о том, что лектин корня вовлечен в процесс его колонизации (Umali-Garsia et al, 1980), а также, что агглютинин зародышей пшеницы (АЗП), аналогичный корневому лектину пшеницы, представляет собой сигнальную молекулу процесса ассоциации между Azospirillum и корневой системой растения. Было показано, что при взаимодействии с АЗП происходили изменения в клеточном метаболизме A. brasilense Sp245, которые приводили к стимуляции азотфиксации, выделению ионов NH/, а также увеличению продукции индолилуксусной кислоты (Antonyuk et al, 1993). Подобное увеличение азотфик-сирующей способности в присутствии АЗП было продемонстрировано для A. U-poferum (Karpati et al, 1999). Интересные результаты были получены при использовании лектинов различной специфичности, как инструмента для анализа ПС. Исходя из предположения о вовлечении компонентов поверхности клеток азоспирилл в прикрепление к корням злаков, в поисках гликанов, участвующих в этих процессах, было исследовано родство ЛПБК, ПСЛК и ПС к АЗП (Konnova et al, 1994). Экспериментально показано, что все вышеперечисленные препараты исследованных штаммов азоспирилл (за исключением двух - Sp7-S и SR15) обладали сродством к АЗП. С использованием экспериментов по ингибированию взаимодействия между ПС и АЗП препаратом GlcNAc было показано, что имело место как специфическое связывание лектина с ПС, так и сочетание специфического с неспецифическим. Наиболее высокое сродство, как отмечалось, проявляли ПС штаммов, ассоциированных с пшеницей, по сравнению с полисахаридами бактерий выделенных с корней диких злаков. Авторы предположили, что это явление обусловлено, возможно, более точным соответствием их детерминантных групп активному центру лектина. Наличие же общих структурных блоков в молекулах рассмотренных гликополимеров создавало предпосылки для их сродства к АЗП или АЗП-подобным лектинам растений.
Было также показано наличие специфического связывания бактериального лектина A. brasilense Sp7 с капсульпыми полисахаридпыми комплексами (КПС) этого же штамма. Взаимодействие лектинов с КПС бактерий A. brasilense 75, A, brasilense Sp7 и A. lipoferum Sp59b не носило специфического характера. ЭПС с лектинами также не давали перекрестного межштаммового взаимодействия (Никитина с соавт., 2001). Исследования показали, что полисахаридные комплексы некоторых штаммов азоспирилл способны вступать во взаимодействие с поверхностными агглютинирующими белками бактерий Bacillus polymixa и R. leguminosarum, чем, возможно, объясняется образование в прикорневой зоне растений многокомпонентных бактериальных азотфиксирующих ассоциаций (Карпунина с соавт., 2001). Продемонстрировано участие углеводных компонентов капсулы бактерий А. brasilense в обеспечении устойчивости микроорганизмов к экстремальным воздействиям (Коннова с соавт., 2001).
Сведения об участии ЛПС в формировании ассоциативных взаимоотношений азоспирилл с растениями остаются малочисленными и довольно разрозненными. Установлено, что A. brasilense и A. lipoferum после удаления с поверхности их клеток капсульних материалов не взаимодействовали с АЗП (Del Gallo and Haegi, 1990). На основании данных, полученных авторами, был сделан вывод о том, что ЛПС азоспирилл не вовлечен во взаимодействие с лектином пшеницы.
Было выдвинуто предположение о присутствии в клеточной стенке лектино-подобных белков (внешние мажорные мембранные белки 42 кДа), которые могут быть вовлечены в процессы узнавания и колонизации корневой поверхности (Casellanos et al., 1998). Предполагалось, что при определенных условиях роста происходит интермедиация белков и экзополисахаридов во внешнюю мембрану, приводящая к агрегации и флокуляции (Burdman et al., 1999).
Разделение липидного и углеводного компонентов липо-полисахарида
Для химических исследований ПС и области кора, как правило, проводят разделение углеводной и липидной частей ЛПС. Для решения этой задачи используют ряд методов, среди которых наиболее распространен гидролиз. Как уже было сказано выше, кор присоединен к липиду А кислотолабильной гликозидной связью остатка КДО, которая может быть расщеплена в условиях мягкого кислотного гидролиза. Применение чрезмерно длительного гидролиза в жестких условиях неизбежно приведет к некоторому дефосфорилированию и де-О-ацетилированию липи-да A (Karibian et al., 1995). Такие модификации уменьшают биологическую актив-кость липида А. Соблюдение умеренных условий при проведении гидролиза (рН 4.5 в буфере ацетата натрия) показало свою эффективность в большинстве случаев (Caroff and Karibian, 2003). Смягчить гидролитические условия также возможно при введении в реакционную смесь детергентов. Этот метод наиболее ценен тогда, когда О-полисахаридные цепи имеют кислотолабильные связи, или для предотвращения раскола диэфирфосфатных групп в О-цепи (Caroff еґ aL, 1988).
При использовании этих методов ЛПС может быть легко разделен на липид-ную часть и водорастворимую фракцию, называемую «деградированным полисахаридом». Обычно гидролиз проходит в течение 1-2 ч. При неполном гидролизе и малом выходе липида А могут быть увеличены температура или время гидролиза. Выбор оптимальных условий гидролиза зависит от структуры молекулы, которая может повлиять на длительность гидролиза. Иногда полной деградации удается достичь только добавлением 0.01 М НС1. При установлении структуры олигосаха-рида кора R-штаммов часто применяют щелочную деградацию ЛПС, приводящую к полному деацилированию липида А и получению углеводной основы ЛПС (Vinogradov et aL, 1995; Caroff and Karibian, 2003).
Для разделение полисахаридной и липидной частей иногда прибегают к реакции р-элиминирования. Эта процедура основана на периодатном расщеплении в пределах КДО, освобождении диола и умеренной щелочной обработке при комнатной температуре, что позволяет получить липид А с минимальным количеством деструктивных изменений. Этот способ является альтернативным кислотному гидролизу и применяется в случае возникновения трудностей при проведении последнего (Lebbar et aL, 1995; Caroff and Karibian, 2003).
Деградированный ПС, получаемый после отделения липида А центрифугированием, также представляет собой смесь различных по своему строению и молекулярному весу веществ. Обычно для разделения этих компонентов используют гель-проникающую хроматографию на полимерных носителях Sephadex. Они представляют собой высокогидрофильные декстраны с поперечными «сшивками», которые набухают в воде, образуя гели, действующие подобно молекулярному ситу. Фракционирование происходит в зависимости от молекулярного веса, и, таким образом, можно разделить полисахаридную фракцию, олигосахарид кора и низкомолекулярные продукты, образующиеся при реакции (КДО, фосфаты и др.). По характеру элюционной кривой можно также судить о полноте гидролиза: если деградация прошла не до конца, присутствует высокомолекулярная фракция ЛПС (Ос-терман, 1985).
Полисахаридная фракция, выделенная таким образом, не всегда гомогенна и может содержать различающиеся по своему строению ПС. Для их дальнейшего разделения применяется хроматография на ионообменных носителях на основе целлюлозы или декстрана (ДЭАЭ-целлюлоза, ДЭАЭ-сефадекс, КМ-целлюлоза, КМ-сефадекс и др.). При ступенчатой элюции буферами различной молярности происходит разделение в зависимости от «кислотности» ПС (количества кислотных групп, приходящихся иа одно повторяющееся олигосахаридное звено). Используется также высокоэффективная жидкостная хроматография на носителях с обращенной фазой - силикагелем с ковалентно присоединенными углеводородными цепями, содержащими от 8 до 18 атомов углерода (гидрофобная оболочка). В этом случае разделение происходит по степени гидрофильности составляющих смеси (Самуэльсон, 1966).
Относительно недавно был предложен простой и быстрый метод извлечения О-полисахаридной части ЛПС из целых клеток бактерий рода Vibrio (Kondo and Hi-satsune, 1988), исключающий стадию выделения ЛПС. Он включает в себя обработку влажной бактериальной массы уксусной кислотой, что, как и в случае кислотной обработки ЛПС, вызывает гидролиз кислотолабильной кетозидной связи между липидным участком молекулы биополимера и его углеводным фрагментом, и переход последнего в растворимое состояние. Позднее было показано, что предлагаемый подход, несмотря на более жесткие условия обработки, не приводит к существенной деградации молекулы ЛПС, что позволило предложить его в качестве упрощенного метода, пригодного для выделения ОПС из других видов грамот-рицательных бактерий (Красикова с соавт., 1998).
Первым этапом в изучении структуры ПС является установление сахарного состава и соотношения моносахаридов в молекуле. Один из наиболее распространенных способов - это исследование продуктов их полного кислотного гидролиза Sletmoen et al, 2003) с последующей газожидкостной хроматографией (ГЖХ) ацетатов полиолов, получаемых по стандартной методике (Savardecker et al, 1965).
Гликозидные связи в ПС могут значительно различаться по своей устойчивости в кислой среде, и, соответственно, применяемые условия реакции и тип кислоты различны. Для этой цели чаще всего используются 2 М трифторуксусная и соляная кислоты, 1 М серная и концентрированная муравьиная кислоты. Уроновые кислоты идентифицируют при помощи ГЖХ эфиров метилгликозидов, получаемых кислотным метанолизом ПС (Perepelov et al, 1999; Vinogradov et ai, 2003).
Следующим шагом является установление абсолютных конфигураций моно-сахаридных компонентов. Для этого в основном используется анализ методом ГЖХ ацетилированных гликозидов с оптически активными спиртами (S-2-октанолом или S-2-бутанолом) (Gervig et al, 1978; Leontein et al, 1978). Наряду с этим, для определения абсолютной конфигурации таких Сахаров, как Glc и Gal, используют ферментативное окисление гидролизатов ПС (D-глюкозоксидазой и D-гапактозоксидазой, соответственно). Абсолютные конфигурации могут быть установлены также путем анализа эффектов гликозилирования в спектрах ядерного магнитного резонанса (ЯМР) ПС (Shashkov et al, 1988). Этот метод обычно применяется для необычных моносахаридов, например, таких, как диаминосахара. Обычно монозы существуют в D-и L-конфигурации, гексозы же чаще всего представлены как D-caxapa. Некоторые монозы, такие, как арабиноза, Rha и фукоза, имеют тенденцию существовать в форме L-caxapa (Sletmoen et al, 2003). Но в литературе есть сведения, показывающие, что рамноза в составе полисахаридов может существовать и в D-форме. Присутствие D- или L-Rha как преобладающего или даже единственного компонента ОПС также было отмечено для некоторых азотфиксирующих ризобактерий и фитопатогенных микроорганизмов (Fontaine et al, 1995; Knirel et al, 1999; Fedonenko et al, 2002).
Микробные культуры и условия их выращивания и хранения
ЛПС играют важную роль во взаимоотношениях бактериальных клеток с окружающей средой. В настоящее время значительное внимание уделяют ЛПС грамотрицательных азотфиксируїощих бактерий. Исследование молекулярных механизмов взаимодействия растений и азотфик сирующих микроорганизмов остается актуальным и сегодня. Одним из важных направлений в изучении данной проблемы следует признать анализ строения и функций различных структурных элементов клеточной поверхности почвенных ассоциативных микроорганизмов, так как они являются соединениями, непосредственно материализующими процесс взаимодействия. Особенности структуры (хемотип) ОПС липополисахарида и иммуноспецифичность (серотип) являются консервативными фенотипическими характеристиками микроорганизмов, которые имеют важное таксономическое значение. Однако серологическая классификация бактерий рода AzospirHlum на основе строения О-антигена пока не разработана.
В качестве объектов исследования были выбраны бактериальные штаммы, представленные в таблице 1. Нами была поставлена задача выделения и исследования ЛПС и ОПС бактерий, принадлежащих не только к разным штаммам, но и к разным видам рода AzospirHlum. Для получения ЛПС был выбран один из наиболее широко применяемых методов их экстракции из клеток грамотрицательных бактерий - водно-фенольный метод. Жидкий фенол является прекрасным растворителем многих белков. При контролируемых условиях рН и ионной силы белки почти полностью переходят в фенольную фазу в двухфазной смеси фенола с водой. Полисахариды ЛПС и нуклеиновые кислоты обычно растворимы в воде и нерастворимы в феноле. Смесь фенола и воды имеет высокую диэлектрическую постоянную. На этом основано распределение белков и полисахаридов между фенолом и водой. Данный способ экстракции является оптимальным для извлечения S-формы ЛПС. Препараты, полученные этим методом, отличаются минимальным содержанием примесей белка, в отличие от ЛПС, экстрагируемых ЭДТА. ЛПС, выделенные водно-фенольной № экстракцией, для дальнейших структурных исследований требуют лишь выделения гомогенных высокомолекулярных фракций при помощи гель-фильтрации.
Таким образом, ЛПС перечисленных в таблице 1 штаммов азоспирилл экстрагировали из сухой биомассы культур водным фенолом. Водную и фенольную части, образовавшиеся после центрифугирования, диализовали отдельно и очищали методом гель-фильтрации на сефарозе (колонка 1, табл. 2). Высокомолекулярные фракции ЛПС, выходившие с нулевым объемом колонки при делении водной и фенольной частей, объединяли. Профиль элюции ЛПС A. brasilense SR75, представленный на рисунке 5, был характерным для ЛПС всех штаммов. ЛПС бактерий содержались в водной части, что говорит о достаточно высокой гидрофилыюсти полимеров. Белки переходили в фенольпые слои, в которых также были обнаружены небольшие количества ЛПС, что объясняется неполным удалением водных частей, т.к. процесс отделения осуществлялся механически. По сравнению с водными фенольные слои экстрактов отличались меньшим содержанием высокомолекулярных фракций ЛПС. В основном в фенольную часть переходили ЛПС с меньшей молекулярной массой, которые могли образоваться в результате частичного разрушения при выделении горячим фенолом. Выход очищенных и лиофилизированных препаратов ЛПС составил от I до 3.2 % (табл. 3) от массы сухого «ацетонового порошка» отмытых от капсулы бактериальных клеток.
Как известно, на поверхности клеток содержится капсульный материал, включающий в себя ПСЛК и ЛПБК (Skvortsov and Ignatov, 1998). Бактерии освобождали от капсульного материала и тестировали полноту удаления капсулы, как описано в работе (Федоненко с соавт., 2001). Удаление капсульного материала в данном случае являлось принципиально необходимым, т.к. многочисленные капсульные гликополимеры, часто имеющие сходный с ЛПС моносахаридный состав, порой оказывают эффект маскировки последнего, что может вызывать затруднения в трактовке полученных данных.
При исследовании биополимерного состава специфическими колориметрическими реакциями на каждый компонент было показано, что на долю углеводов в ЛПС приходилось от 20 до 60 % от массы препарата (табл. 4). По убыванию содержания углеводов препараты ЛПС можно расположить в следующем порядке: ЛПС8р7, ЛПСС(Ь ЛПС317, ЛПС5р59ь, ЛПСКО20а, ЛПС3к75, ЛПСКВСі. Разброс в № содержании углеводов, учитывая, что по результатам дальнейших исследований все изучаемые препараты отнесены к S-форме, может быть объяснен штаммовыми различиями в соотношении гидрофильной и гидрофобной компонентов молекулы ЛПС. В составе всех выделенных препаратов ЛПС была идентифицирована КДО единственный структурный элемент, который всегда присутствует в ЛПС, независимо от их бактериального происхождения. Для ЛПСзіш ЯПСа, ЛПС$Р59Ь и ЛПСяогоа ее содержание составило примерно 3 - 4 %, а для ЛПСКВСі и ЛПС$і7 - в 4 раза ниже (табл. 4). Небольшое количество КДО, как особенность ЛПС азоспирилл, было показано ранее для некоторых штаммов A. brasilense и A. lipoferum (Choma et al.t 1984; Choma et oL, 1987; Федоненко с соавт., 2004). В ЛПС3іш, ЛПС5р59ь было обнаружено небольшое количество фосфора (менее 1 %), в ЛПСяо2оа он отсутствовал вовсе. В составе ЛПСзп, ЛПССа, ЛПСКВсь ЛПС5р7 содержание фосфора было значительным (от 2 до 3.5 %) (табл. 4). Известно, что фосфатные группы, локализованные главным образом в липиде А и во впутренней части кора, являются высокоэффективными катионсвязывающими участками в молекуле ЛПС. Степень ионизации отрицательно заряженных групп определяет силу отталкивания между ними, гидратацию полярной части и образование водородных связей, что влияет в конечном итоге на субмолекулярную организацию ЛПС в мембране (Соловьева с соавт., 1992). Следует отметить, что использование хроматогрофических методов фракционирования экстракта позволило добиться высокой степени очистки ЛПС, о чем свидетельствует низкое содержание белков (менее 1 % в JlllCsn, ЛПСсб ЛПСКВСі и 2 % в ЛПСшз, ЛПС5Р5%) и НК (следовые количества в ЛПСвп, ЛПСс ь ЛПСквсі и 0.2 % в ЛПСзіш, ЛПС$Р59ь) Таким образом, нами были выделены, хроматографически очищены и охарактеризованы гомогенные препараты ЛПС бактерий A. brasilense SR75, S17, Sp7, Cd, A. irakense КВС1, A. lipoferum Sp59b и RG20a. Для них было характерно низкое содержание белка и нуклеиновых кислот. Во всех выделенных препаратах было обнаружено присутствие КДО и достаточно высокое содержание углеводов (от 20 до 60 %).
Получение и характеристика антител на ЛПС бактерий A. brasilense Cd, A. brasilense Sp7 и A. irakense КВС1
Иммунохимическим свойствам клеточной поверхности бактерий рода Azospirillum посвящен ряд работ, в которых использовались AT, полученные на целые клетки бактерий, обработанные глутаровым альдегидом (Bogatyrev et al., 1992; Матера с соавт., 1998; Петрова с соавт., 2005; Матора с соавт., 2005). Однако на сегодняшний день детальная серологическая классификация азоспирилл на основе строения О-антигена не разработана. Получение AT на изолированные и хроматографически очищенные препараты ЛПС дает возможность выявлять идентичные антигенные детерминанты в препаратах, структуры которых еще не были исследованы, и соотносить их с уже известными структурами.
Иммунизацией кроликов хроматографически очищенными препаратами ЛПСса, ЛПС$Р7, ЛПСквсі были получены поликлональные антитела (АТдпсса ATjmcspT, АТлпсквсі, соответственно), которые характеризовались способностью к агглютинации убитых нагреванием гомологичных клеток. Данная работа проводилась совместно с сотрудниками лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН. Следует отметить, что использованная в данной работе процедура (см. раздел 2.3.4) показала свою высокую эффективность, поскольку уже после второй иммунизации концентрация специфических антител в сыворотках крови кроликов была достаточной для образования выраженного преципитата в тесте двойной радиальной иммунодиффузии.
Антисыворотка на ЛПСзр? проявляла высокую активность по отношению к клеткам A. brasilense Sp7, покрытым капсулой, и ее максимальное работающее разведение составило 1:640. Для того, чтобы определить, насколько эффективно происходит взаимодействие с капсулированными и бескапсульными клетками A, brasilense Cd, агглютинацию проводили с АТлпса. Взаимодействие с капсулированными клетками происходило до концентрации иммуноглобулинов 3 мг/мл, а с бескапсульными - до 1 мг/мл. На основании полученных результатов можно сказать, что степень связывания АТлпсса с макромолекулами поверхности покрытых капсулой клеток была в три раза ниже, чем бес капсул ьных. Взаимодействие АТлпсса а также антисыворотки на ЛПС5р7 с капсулированными клетками, очевидно, обусловлено двумя причинами. Первая - это связывание с экспонированным на поверхности через капсулу ЛПС. Вторая - взаимодействие с локализованным в капсульном материале азоспирилл липополисахарид-белковым комплексом (ЛПБК) - экстраклеточной формой ЛПС. Более высокая активность AT в отношении бескапсульных клеток вызвана, очевидно, возможностью свободного экспонирования антигенных детерминант ЛПС внешней мембраны.
Необходимо отметить, что аитисыворотка на ЛПСКВС1 не взаимодействовала с гомологичными капсулированными клетками. После отмывания бактерий от капсулы антитела агглютинировали клетки, но их активноть была невысокой. Максимальное работающее разведение сыворотки в реакции агглютинации составило 1:160. Капсульный материал A. irakense KBCI не взаимодействовал с АТлпсквсі в тесте двойной радиальной иммуподиффузии, что позволяет сделать предположение о различиях в строении антигенных детерминант (а возможно и структуры ОПС) ЛПС внешней мембраны и ЛПС, входящего в состав полисахаридных комплексов капсулы. Следует отметить, что проводимые ранее исследования методами иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, антигенного родства капсульпых полисахаридов и ЛПС модельных штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 выявили их антигенную идентичность (Матора и Щеголев, 2002).
Исходя из полученных результатов, мы предположили, что капсульный материал азоспирилл (который помимо ЛПБК содержит полисахарид-липидный комплекс, свободные полисахариды и протеины), для некоторых штаммов полностью, для других - частично экранирует О-антиген внешней мембраны. При этом детерминанты экстраклеточного ЛПС, возможно, менее доступны для взаимодействия со специфическими AT из-за образования комплекса с белком. Таким образом, эксперименты выявили различия между штаммами азоспирилл в степени экспонирования через капсулу О-антигенных цепей, и, как результат, штаммовую вариабельность в реализации различных механизмов контактных взаимодействий этих бактерий с растениями.
Методом иммунодиффузии с использованием соответствующих антител было визуализировано не менее двух антигенных детерминант в составе ЛПСса, JHlCsP7, и не менее трех в ЛПСквсі (Рис- А, Б, В, Г, Д, Е). В связи с тем, что фотографии стекол с двойными радиальными иммунодиффузиями не передают всех деталей, видимых глазом, мы посчитали необходимым привести их схемы. Следует отметить, что конформация детерминант не изменялась ни в ходе длительного кипячения растворов препаратов ЛПС, ни в результате их обработки протеолитическим ферментом протеиназа К, что демонстрирует небелковую природу всех детерминант, на которые были получены антитела. Препараты также не утрачивали свою серологическую активность, а иммунодиффузионная картина после депротеинизирования не изменялась, и полосы преципитации имели одинаковую интенсивность.
