Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Ризсфера - уникальная среда битания для микррганизмв 10
1.1.1 Крневые экссудаты растений как млекулярные сигналы в ризсфере 12
1.2 Бактерии рда Azospirillum в ассциативных взаимдействиях с растениями 15
1.2.1 Мрфолгические и физилгические сбеннсти азспирилл... 16
1.2.2 Гликплимеры клетчнй пверхнсти азспирилл - сстав и участие в взаимодействии с растениями 22
1.3 Генетические аспекты синтеза липплисахаридв и экстраклетчных плисахаридв у азспирилл 30
1.4 Сертипирвание и хемтипирвание азспирилл на снвании антигенных свойств липплисахаридв, капсульных плисахаридв и структур О-специфических плисахаридв 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы 41
2.1 Культуры бактерий, услвия их выращивания и хранения 41
2.2 Прибры и материалы 42
2.3 Метды исследвания 44
2.3.1 Выделение капсульных плисахаридв, экстракция липоплисахаридв и плучение О-специфических плисахаридв 44
2.3.2 Хрматографические метды 44
2.3.3 Электрфорез в плиакриламиднм геле 46
2.3.5 Химические метды анализа 47
2.3.6 Серлгические метды исследвания 48
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 50
3.1 Серлгические исследвания липплисахаридв азспирилл 50
3.2 Сравнительный анализ химическг сстава липплисахаридв 54
3.3 Структурные исследвания О-специфических плисахаридв азоспирилл, тнесенных к сергруппе II 59
3.3.1 Исследвание структуры О-специфическг плисахарида бактерий A. brasilense Sp7 59
3.3.2 Структурные исследвания липплисахаридв бактерий A. brasilense Sp7.K2, Sp7.5 , Sp7.2 67
3.3.3 Структурные и серлгические исследвания липплисахаридв бактерий A. brasilense SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 11, SRI 15 и A. lipoferum SR42 73
3.3.4 Устанвление структуры пвтряющихся звеньев О-специфических плисахаридв бактерий A. brasilense SR7 81
3.3.5 Осбеннсти стрения О-специфическг плисахарида бактерий A. halopraeferens Au4 83
3.4 Структурный анализ капсульнг плисахарида бактерий A. irakense КВС1 87
Заключение 91
Выводы 95
Список сокращений и условных обозначений 96
Список использованной литературы
- Бактерии рда Azospirillum в ассциативных взаимдействиях с растениями
- Сертипирвание и хемтипирвание азспирилл на снвании антигенных свойств липплисахаридв, капсульных плисахаридв и структур О-специфических плисахаридв
- Структурные исследвания О-специфических плисахаридв азоспирилл, тнесенных к сергруппе II
- Устанвление структуры пвтряющихся звеньев О-специфических плисахаридв бактерий A. brasilense SR7
Введение к работе
Актуальность темы. Бактерии рода Azospirillum являются типичными представителями ризосферной микробиоты, способными формировать ассоциации с важнейшими хлебными и кормовыми злаковыми культурами и стимулировать их урожайность (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000).
Преобладающие гликополимеры клеточной поверхности азоспирилл – липополисахариды (ЛПС) и капсульные полисахариды (КПС) – вовлечены в процессы агрегации клеток и колонизации корней растений, принимая непосредственное участие в формировании растительно-микробных ассоциаций (Skvortsov and Ignatov, 1998; Burdman et al., 2000; Egorenkova et al., 2001). Изучение химической структуры гликополимеров необходимо для понимания молекулярных механизмов коммуникаций, происходящих в ризосфере между микроорганизмами и их макропартнерами. Это открывает возможности для управления этими процессами и повышения эффективности используемых в сельском хозяйстве технологий.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что азоспириллы продуцируют преимущественно S-формы ЛПС, содержащие О-специфические полисахариды (ОПС), экспонированные на внешней стороне наружной мембраны (Fedonenko et al., 2002, 2004, 2006, 2008; Choma et al., 2008; Boyko et al., 2011, 2012).
На основании серологических перекрестных реакций с бактериями A. brasilense Sp245, Sp7 и A. lipoferum Sp59b, соответственно, были выделены три серогруппы азоспирилл (Коннова и др., 2008; Федоненко и др., 2011, Филипьечева, 2011). Сравнительное исследование структур повторяющихся звеньев ОПС этих бактерий позволило выявить химическую основу серологического родства между отнесенными к серогруппам I и III штаммами (Бойко и др., 2010; Федоненко и др., 2011), большинство из которых являются ассоциантами пшеницы. Cведения о структурах ОПС азоспирилл представителей серогруппы II, изолированных из ризосферы широкого круга злаков трех подсемейств – Pooideae, Panicoideae, Oryzoideae (Коннова и др., 2008; Филипьечева, 2011), – ограничены, в то время как данные серологического анализа свидетельствуют о неоднородности О-антигенных детерминант их ЛПС. Это обуславливает актуальность детализации и расширения существующей серо- и хемотаксономической схем бактерий рода Azospirillum. Серологическая специфичность КПС азоспирилл охарактеризована
лишь для нескольких штаммов. На основании идентичности антигенных свойств ЛПС и КПС было высказано предположение об отсутствии индивидуального капсульного антигена у штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 (Матора и Щеголев, 2002), при этом у бактерий A. lipoferum Sp59b выявлены как антигенные, так и структурные различия между ЛПС и КПС (Смолькина и др., 2010).
Анализ нуклеотидных последовательностей 90 МДа (p90, pRhico) и 115 МДа (p115) плазмид бактерий A. brasilense Sp7 выявил множественные открытые рамки считывания, предсказанные продукты экспрессии которых могут быть задействованы в биосинтезе и экспорте полисахаридов (Vanbleu et al., 2004; Lerner et al., 2009). В связи с этим представляет интерес сравнительное исследование ЛПС A. brasilense Sp7 и спонтанных производных этого штамма, плазмидные профили которых свидетельствовали об утере p115 и изменении структуры p90 (Петрова и др., 2005, 2010).
Цель работы – структурный анализ липополисахаридов бактерий рода Azospirillum, отнесенных к серогруппе II. Для реализации цели в ходе исследования решали следующие задачи:
-
Провести скрининговые серологические исследования штаммов Azospirillum spp. для выявления перекрестных реакций с антителами к ЛПС бактерий – представителей серогруппы II.
-
Охарактеризовать химический состав ЛПС и структуру повторяющихся звеньев ОПС азоспирилл, отнесенных к серогруппе II.
-
Осуществить сравнительный анализ структуры ОПС A. brasilense Sp7 и его спонтанных производных с измененным плазмидным составом – A. brasilense Sp7.K2, Sp7.2 и Sp7.5.
4. Исследовать ЛПС из капсульного материала на примере бактерий A. irakense KBC1.
Научная новизна работы. Впервые для отнесенных к серогруппе II бактерий
рода Azospirillum установлены структуры повторяющихся звеньев ОПС у штаммов A. brasilense Sp7, SR7, SR50, SR80, SR88, SR109, SR111, SR115 и A. lipoferum SR42 и КПС A. irakense KBC1. Выявлена химическая основа серологического родства между A. brasilense SR7 и S17, а также между A. brasilense Sp7, Jm6B2, SR50, SR80, SR88, SR109, SR111, SR115 и A. lipoferum SR42. Показано, что ОПС спонтанного производного A. brasilense Sp7.K2 отличается от ОПС родительского штамма
A. brasilense Sp7 и его производных штаммов Sp7.2 и Sp7.5 наличием рамнанового полисахарида.
Установлено, что антигенная специфичность мембранного и внеклеточного ЛПС A. irakense KBC1 обусловлена различиями макромолекулярной организации этих гликополимеров.
Получены новые данные о характере связывания жирных кислот в липидах А ЛПС исследуемых штаммов.
Научно-практическая значимость. Информация о структурах ОПС будет использована для серо- и хемотипирования азоспирилл. Cведения о составе и топологии углеводных компонентов бактериальной поверхности, определяющих успешность начальных этапов формирования растительно-микробных ассоциаций, могут быть использованы при отборе конкретных штаммов азоспирилл для создания биоудобрений.
Выделенные препараты ЛПС ряда штаммов A. brasilense и A. halopraeferens и полученные к ним поликлональные кроличьи Ат применяются при проведении плановых НИР сотрудниками лабораторий биохимии и иммунохимии ИБФРМ РАН, а также при выполнении учебного плана Учебно-научного центра физико-химической биологии Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» (СГУ) и ИБФРМ РАН.
Представленные в диссертации материалы включены в учебно-методическое пособие для студентов: «Практические занятия по физико-химическим методам исследования биополимеров» / Саратов: Изд-во «Новый ветер», 2013 г. 54 с., (в соавторстве с Г.Л. Бурыгиным, Л.Ю. Матора, С.Ю. Щеголевым), рекомендованное кафедрой органической и биоорганической химии Института химии СГУ и Ученым советом ИБФРМ РАН.
Работа проведена при частичной поддержке РФФИ (проекты 08-04-00669, 11-04-00533, 13-04-01658) и Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение №8852 («Разработка методологии и приборного обеспечения электрооптического анализа вирусов и микроорганизмов»).
Личный вклад соискателя. Автор лично участвовал в планировании экспериментов, обсуждении полученных результатов, формулировании выводов и подготовке публикаций. Культивирование бактерий, выделение и очистка КПС, ЛПС и
ОПС, электрофорез, получение антител, серологические тесты, химические анализы, интерпретация спектров ЯМР проводились автором лично или при его непосредственном участии.
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам ИБФРМ РАН: своим научным руководителям д.б.н., профессору В.В. Игнатову и к.б.н., доценту Ю.П. Федоненко, а также д.б.н., профессору С.А. Коновой, вед. инж. Е.Н. Юдиной, вед. инж. Е.Е. Калашниковой (лаборатория биохимии), д.б.н., профессору Л.Ю. Матора, к.б.н., доценту Г.Л. Бурыгину (лаборатория иммунохимии), д.б.н., профессору Е.И. Кацы, к.б.н. Л.П. Петровой (лаборатория генетики микроорганизмов), к.х.н. О.Е. Макарову и к.б.н. М.П. Чернышовой (лаборатория экологической биотехнологии), на разных этапах участвовавших в проведении исследований и обсуждении результатов. Автор благодарит сотрудников Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН д.х.н., профессора Ю.А. Книреля и д.х.н., профессора А.С. Шашкова за запись спектров ЯМР ОПС и помощь в их интерпретации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Бактерии A. brasilense Sp7, SR7, SR50, SR80, SR88, SR109, SR111, SR115 A. lipoferum SR42 и A. halopraeferens Au4, отнесенные к серогруппе II, продуцируют структурно и иммунохимически гетерогенные ЛПС. Для ОПС A. brasilense Sp7, Sp7.K2, Sp7.2, Sp7.5, SR7, SR115 и A. halopraeferens Au4 характерно присутствие частично метилированных и ацетилированных моносахаридных остатков.
-
ЛПС и КПС бактерий типового штамма A. irakense KBC1 содержат полисахариды с идентичными по первичной структуре полисахаридными повторяющимися звеньями. Серологическая гетерогенность этих гликополимеров может быть обусловлена различиями их макромолекулярной организации.
-
В составе ЛПС азоспирилл 3-гидрокситетрадекановая кислота является эфиросвязанной, а 3-гидроксигексадекановая – амидосвязанной.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 5 статей в отечественных и зарубежных научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, представлены на шести всероссийских и четырех международных конференциях.
Работа выполнена в соответствии с плановыми темами НИР «Биополимеры и низкомолекулярные соединения во взаимодействии растений и микроорганизмов» (2009–2012 гг. № госрегистрации 01200904391) и «Роль биомакромолекул и низкомолекулярных веществ в механизмах адаптации растительно-микробных ассоциаций в составе антропобиоценозов к условиям аридного климата» (2013–2015 гг. № госрегистрации 01201359049) лаборатории биохимии ИБФРМ РАН. Исследование полисахаридов с помощью спектроскопии ЯМР выполнено совместно с сотрудниками Института органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН (г. Москва).
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 239 источников, в том числе 58 источников на русском языке. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 15 рисунков и 12 таблиц.
Общепринятые сокращения и обозначения: Rhap - рамнопираноза, Fucp – фукопираноза, Galp – галактопираноза, Xylp – ксилопираноза, Manp – маннопираноза, Glcp – глюкопираноза, GlcpNAc – 2-ацетамидо-2-дезокси-глюкопираноза, GalpNAc – 2-ацетамидо-2-дезоксигалактопираноза, ManpN(SHb) – 2-дезокси-2-[(S)-3-гидроксибута-ноиламино]маннопираноза, Galf – галактофураноза, Rhap2Me – 2-O-метил-рамнопираноза, Rha2Ac – 2-O-ацетилрамноза.
Бактерии рда Azospirillum в ассциативных взаимдействиях с растениями
Альтернативй синтетическим азтным удбрениям, призвдств и ширке испльзвание кторых мжет нансить серьезный урн кружающей среде, являются биудбрения. Оснвой для них служат пчвенные микррганизмы, спсбные в прцессе билгическй фиксации утилизирвать млекулярный азот из вздуха и пребразвывать ег в различные дступные для растений сединения: сли аммния, нитриты, нитраты, а впследствии в глутамин и др. (Lam et al., 1996; Franche et al., 2009). Впервые сельскхзяйственный препарат на снве биудбрений был запатентован в США в кнце XIX века, чем пзднее сбщалсь в бзорнй рабте (Nobbe and Hiltner, 1896). К настоящему мменту для этих целей прведена селекция мнжества бактериальных штаммв. Однак ширке испльзвание микрбных инкулятв затруднен из-за варьирвания и непстянства результатв, плученных в лабратрных и плевых услвиях. Причина этих расхждений крется в недстатчнй изученнсти кмплекса взаимтншений, взникающих между участниками даннг прцесса: растением, микррганизмами и прирднй средй, в частнсти, пчвй. Управление ключевыми стадиями билгическй фиксации азта мжет существляться при детальнм пнимании этг явления, чт пдчеркивает актуальнсть исследваний, связанных с ег испльзванием для пвышения уржайнсти важных в агрнмическм тншении культур.
Наиблее специфичными и эффективными в тншении фиксации азота являются прцессы с участием ббвых (семейства Fabaceae) и неббвых (семейства Cannabaceae) растений и грамтрицательных альфа-пртебактерий ризобий (Schultze and Kondorosi, 1998; Oldroyd and Downie, 2008; Desbrosses and Stougaard, 2011) и ассциирванных с актинризными растениями грампложительных актинмицетв Frankia spp. Азтфиксирующие цианбактерии (в снвнм Nostoc spp.) также клонизируют различные рганы растений. Эти симбитические взаимдействия выгдны бим партнерам, а их бразвание пртекает п стрг диктуемым растением правилам. Данные тношения бусловлены вовлечением стветствующих генв растения и бактерий, тветственных за изменение метаблических путей и сздание специализирванных клеточных и тканевых структур - бактерида и клубенька, предоставляющих наиблее благоприятные услвия для фиксации азота и ег дальнейшей транспортирвки (Reinhold-Hurek and Hurek, 2011).
Ассциативные взаимодействия тличаются т бобво-ризбиальных тем, чт ни не требуют стль глубкой интеграции их участникв (Лукин и др., 1987; Franche et al, 2009). Ассциации с ширким кругм растений, в том числе злаквых, спсбны бразвывать бактерии, встречающиеся в мнгих семействах: Azotobacteriaceae, Bacilliaceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhodospirillaceae и др. (Baldani et al, 1997). Хотя кличеств фиксируемг в этих системах азта неспставим с таквым в ббв-ризбиальнм симбизе, плевые эксперименты с участием злакв и ассциативных азтфиксатрв демнстрирвали увеличение снабжения растений азтом и пвышение их уржайнсти (Dobbelaere et al, 2003; Vessey, 2003; Verma et al, 2010; Bhattacharyya and Jha, 2012). Среди ассциативных диазотрфов встречаются бактерии, битающие на поверхности корня (Azotobacter, Bejierinkia), и эндфиты, прникающие внутрь растений, не причиняя им видимго вреда (Hallmann et al, 1997; Reinhold-Hurek and Hurek, 2011). Факультативные эндфиты (Azospirillum sp.) спсбны выживать в почве в тличие т блигатных (Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp., Azoarcus spp.), выживаемсть кторых строг бусловлена наличием растения-хзяина (Baldani et al, 1997; Baldani and Baldani, 2005).
Фиксация азота является не единственнй причинй увеличения рста и уржайнсти растений ассоциативными микррганизмами. Стимуляция рста и развития растений в ассциациях с бактериями псредвана как прямыми, так и непрямыми механизмами. Пмим билгическй фиксации азта, прямая стимуляция включает также: 1) прдукцию регуляторв роста - индлилуксуснй кислоты (Spaepen et al., 2007), гибберелинвых кислт (Narula et al., 2006), цитокининв (Haberer and Kieber, 2002); 2) синтез АЦК-деаминазы, снижающей урвень этилена в крнях развивающихся растений (Dey et al, 2004); 3) слюбилизацию сединений фосфора, железа и других минеральных веществ (Hayat et al, 2010); 4) индукцию системнй резистентнсти путем пвышения перксидазнй активнсти растений (Bhattacharyya and Jha, 2012). К непрямым механизмам тнсятся: 1) защита растений т патогенв, включающая прдукцию экзферментов ф-1,3-глюканаз, хитиназ), антибитикв, флуресцирующих пигментв и синильнй кислты (Zahir et al., 2004; Pathma et al., 2011); 2) стимуляция микризальных тншений; 3) бидеструкция пчвенных пллютантов (Glick, 1995). Таким бразм, на снвании механизма действия рст-стимулирующие бактерии пдразделяют на кмпненты биудбрений, фитостимулятры, риздеструктры и бипестициды (Glick, 1995).
Наибльший урвень активнсти пчвенных бактерий зафиксирван в ризосфере - бласти пчвы, нахдящейся пд непсредственным влиянием крней. Этт термин был впервые уптреблен Хилтнерм в начале XX века, а в настоящее время к этму пнятию также тнсятся и ткани крня, заселенные бактериями (Campbell and Greaves, 1990; Hartmann et al., 2008). Клнизация ризосферы является ключевым фактрм, пределяющим эффективнсть испльзуемых инкулятв.
Сертипирвание и хемтипирвание азспирилл на снвании антигенных свойств липплисахаридв, капсульных плисахаридв и структур О-специфических плисахаридв
Струдниками ИБФРМ РАН были прведены серлгические исследвания азспирилл с применением разнбразных иммунлгических метдв. Дт-блт-анализом с использованием конъюгатв кллиднг злота с Ат, плученными к целым клеткам азспирилл, обрабтанным глутарвым альдегидм, был прведен сертипирвание 10 штаммв. В результате автрами было выявлен иммунлгическе схдство штаммв A. brasilense Sp245 и Spl07, их слабе рдств с A. brasilense S27 и KR77, а также наличие перекрестов между A. brasilense SpBrl4 и Jml25A2 (Bogatyrev et al., 1992).
Иммунхимическими метдами с испльзванием пликлональных Ат на ЛПС A. brasilense Sp7 в сставе ЛПС A. brasilense штаммв Sp7 и Cd были выявлены ЛПСІ и ЛПСП (Петрва и др., 2005а), характерные для Sp7 (Матора и др., 1998). Причем Ат, плученные к ЛПС штамма Cd, распзнавали лишь ЛПСІ в гмлгичнм Аг (Петрва и др., 2005). Для штаммв A. brasilense Sp7 и Sp245 на примере их мутантв было пказан, чт ЛПС данных бактерий гетергенны п свим антигенным характеристикам (Матра и др., 2008). Автры рабты устанвили, что эт мжет быть связан с наличием в ЛПС двух различных п структуре ОПС, дин из ктрых включает, п крайней мере, две антигенные детерминанты. При этм втрй ОПС является иммунхимически гмгенным и идентичен днму из плисахаридв, выявляемых в сставе первг ОПС. Автры рабты предплагают, что гетергеннсть ЛПС данных бактерий мжет быть связана с сбеннстями их бисинтеза, кгда дин из ОПС является предшественникм в синтезе другг.
Филипьечевй с савтрами была пстрена система сертипирвания ппуляций чистых культур 70-ти штаммв азоспирилл, бъединяющая четыре сертипа и 37 сервариантв (Филипьечева и др. 2010; Филипьечева, 2011). К первму сертипу были тнесены семь штаммв, имеющих серлгический перекрест с A. brasilense Sp245: A. brasilense Sp245, SR75, S27, Spl07, Sp245 и SR15, A. lipoferum Rg20a и Azospirillum sp. SR81. К вторму сертипу были тнесены штаммы, серлгически близкие A. brasilense Sp7: A. brasilense Sp7, SR55, 7К2, Cd, SR80, SR14 и A. irakense KBC1. Сертип III бъединял штаммы, демнстрирвавшие серлгический перекрест с A. lipoferum Sp59b: A. lipoferum Sp59b, SR38, SR33, SR35, SR61, SR62, SR43, SR65, SR85, SR98, SR99 и SR4. К четвертму сертипу были тнесены стальные исследванные штаммы, не имеющих серлгическг рдства ни с дним из типвых штаммв для каждг из сертипв I-III. Деление азспирилл внутри сертипв на серварианты существлялсь на снвании перекреств с A. brasilense Jml25A2, S17, SR55, SR80, A. lipoferum SRI6 и A. irakense КВС1. Иммунлгические тесты првдили с испльзванием Ат, плученным к целым клеткам, брабтанным глутарвым альдегидм, а ЛПС выделяли из клетк ЭДТА-сдержащим буферм п метду (Lieve et ah, 1968).
При изучении ппуляций бактерий рда Azospirillum Филипьечевой впервые был испльзван эклг-иммунлогический пдхд, пзвливший не тльк првести исследвания серлогических свойств бактерий, н и выявить взмжные крреляции этих свйств с местм и бъектм выделения бактерий (Филипьечева, 2011). Представители сертипа I были преимущественн выделены в Рссии и Бразилии из ризсферы растений триб пшеницевые и мятликвые пдсемейства настящие злаки. Штаммы, тнесенные к сертипу II, выделены из ризосферы растений четырех триб пдсемейства настоящие злаки в Рссии, США, Ираке и Пакистане. Сертип III бъединял штаммы, выделенные в Рссии из ризосферы разных сртв пшеницы и ржи, а также дикрастущих злакв. К сертипу IV были тнесены штаммы, выделенные из ризсферы различных растений, а также из микрбицензв трабтаннг држнг тплива и серных матов. Азспириллы, выделенные из растений трибы брдачевниквые (срг, кукуруза, веерник) были тнесены тольк к сертипу IV.
Струдниками лабратрии бихимии ИБФРМ РАН был прведен хемтипирвание и сертипирвание ряда штаммв азоспирилл на снвании структур пвтряющихся звеньев ОПС и иммунхимических теств с применением Ат к чищенным препаратам ЛПС, в результате чег был выделен три сергруппы. Структуры пвторяющихся звеньев ОПС штаммв азспирилл сергрупп I-III приведены в таблице 1.
Серогруппа I бъединяла штаммы A. brasilense Sp245, SR75, SR15 и A. lipoferum Rg20a, а к сергруппе II был тнесен штамм A. brasilense Sp7 и демнстирирующие серлгическе рдств с ним - A. brasilense Cd, A. irakense КВС1 и A. lipoferum Sp59b, а также предварительн A. brasilense S17 (Кннва и др., 2008). Детальный анализ результатв серлгических исследваний свидетельстввал неднрднсти О-антигенных детерминант представителей сергруппы II и небхдимсти их дальнейшег типирвания. К сергруппе III были тнесены A. brasilense 54, SR65, SR85, SR66, а также A. lipoferum Sp59b на снвании серлгических свйств ЛПС и КПС и A. brasilense SpBrl7 и S17 на снвании данных структуре ОПС (Федненк и др., 2011).
На снвании данных структуре ОПС исследуемых штаммв было устанвлен, чт химическй снвй серлогическг рдства сергруппы I являлсь присутствие в ОПС тетрасахариднг пвтряющегся фрагмента: —»2)-oc-D-Rha/?-(1 2)-(3-D-Rha/?-(1 3)-oc-D-Rha/?-(1 2)-oc-D-Rha/?-(l (Бойк и др., 2010).
Штаммы Azospirillum сергруппы II характеризовались наличием гетерплисахаридных ОПС. В ОПС A. irakense КВС1 был устанвлен гексасахаридне пвтряющееся звен с нетипичн длиннй для бактериальных плисахаридв бквй цепью (Fedonenko et al., 2004). ОПС A. brasilense SR55 также имеет уникальную для азспирилл прирду и сстит из ктасахаридных пвторяющихся звеньев (Boyko et al., 2011).
Структурные исследвания О-специфических плисахаридв азоспирилл, тнесенных к сергруппе II
Критерием для тнесения штаммв азоспирилл к сергруппе II является наличие серлогических перекрестных реакций с Ат к ЛПС типвог штамма A. brasilense Sp7, чт обуславливает актуальнсть исследвания структуры ОПС этг штамма.
Деградация ЛПС в мягких кислтных услвиях и последующая гель-фильтрация пзвлила плучить ОПС A. brasilense Sp7 с выхдм 22+2%. Мнсахаридный анализ ОПС методм ГЖХ ацетатв плилов выявил пребладание Rha, Gal, GlcNAc и Fuc (в стншении -1:1:1:1), а также Rha2Me, Xyl и Glc в меньших кличествах. Методм ГЖХ ацетилирванных S-(2) -ктилгликзидв была устанвлена L кнфигурация Rha и Fuc и D кнфигурация Gal и GlcNAc.
ГЖХ-МС анализом частичн метилирванных ацетатов плилов в ОПС был пределен присутствие терминальнй Fuc, 3-замещенных Gal и Rha, 3,4-дизамещеннг GlcNAc в качестве оснвных кмпнентов, а также небльшие кличества 4-замещеннй Xyl, 3,4-дизамещенной Fuc, 2-замещеннй Rha и терминальных Glc и Rha. Наличие в ОПС 3-замещеннй Rha2Me был устанвлен метдм ГЖХ-МС частичн этилирванных ацетатв плилов.
В 13С-ЯМР спектре ОПС Sp7 присутствовали сигналы разной интенсивности, что указывало на структурную гетерогенность этих молекул. Поскольку методом метилирования в минорной серии были обнаружены моносахаридные остатки с вицинальными диольными группами, ОПС был подвергнут распаду по Смиту (Goldstein et ah, 1968). Образовавшийся в результате полисахарид (ПС) был исследован методами ID и 2D ЯМР спектроскопии.
13С-ЯМР спектр ПС содержал сигналы шести аномерных атомв углерода при 8 100.1-104.6, двух СН3-С групп (С-6 Rha и Rha2Me) при 8 17.8, двух НОСН2-С групп (С-6 Gal и GlcNAc) при 8 62.1, сигнал атма углерда, связаннг с азотм (С-2 GlcNAc) при 8 56.0, сигналы стальных атмв углерда мнсахариднг кльца при 8 69.6-84.1, а также сигнал днй СН3-0 группы при 8 59.3 и двух N-ацетильных групп (СН3 при 8 23.6, СО при 8 175.9 и 176.0). Отсутствие сигналв в бласти при 8 84-88, характеристичных для фуранзидв (Bock and Pedersen, 1983), указывал на пиранзную форму всех мнсахаридых статкв. Сответственн, в -ЯМР спектре ПС присутствовали сигналы шести аномерных протонов при 8 4.49-5.18, двух СН3-С групп при 8 1.28, других протонов моносахаридног кольца при 8 3.45-4.28, двух N-ацетатных групп при 8 2.03 и СН3-0 группы при 8 3.45.
Отнесение сигналов в 1Я- и 13С-ЯМР спектрах был призведен с испльзванием !Н, !Н COSY, TOCSY, ROESY, !Н, 13С HSQC (Рисунк 6) и НМВС экспериментв (Таблица 6). Шесть спин-спинвых систем монсахаридв были идентифицирваны путем выявления крреляций т Н-1 д Н-6 GlcNAc, т Н-1 д Н-5 и т Н-6 д Н-2 для Rha and Rha2Me, т Н-1 д Н-4 Gal в COSY и TOCSY спектрах, учитывая значения характеристических кнстант спин-спинвг взаимдействия. Оставшиеся сигналы Gal были тнесены с пмщью ROESY спектра и путем прслеживания крреляции Н-6/Н-5 в COSY спектре. Плжение метксильнй группы в Rha2Me было устанвлен, исхдя из крреляций между пртонами СН3-0 и С-2 Rha при 8 3.45/80.4 и между углердм СН3-0 группы и Н-2 Rha при 8 59.3/3.94 в Н, С НМВС спектре.
Отнсительн сильнопльная пзиция сигнала С-5 при 8 70.4-70.5 в 13С-ЯМР спектре свидетельстввала б а кнфигурации Rha и Rha2Me (п сравнению с литературными данными 8 70.0 и 73.2 для С-5 a-Rhap и P-Rhap стветственн). Отнсительн слабопльне пложение сигналв С-1 при 8 103.4-104.5 и С-5 при 8 76.4 указывал на Р конфигурацию Gal и GlcNAc.
В 13С-ЯМР спектре ПС был выявлен смещение сигналов С-2 Rha2Me и С-3 Rha, Rha2Me, Gal и GlcNAc в тнсительн слабпльную бласть, псравнению с их пзициями в стветствующих незамещенных монсахаридах (Bock and Pedersen, 1983), чт сгласвывалось с пзициями замещения этих мнсахаридв, выявленными методм ГЖХ-МС. Анализ пследвательнсти мнсахаридв в пвтряющихся звеньях был существлен с испльзванием 2D ROESY и НМВС экспериментв. В /Н ROESY спектре наблюдались следующие крреляции: Rha Н-1, Gal Н-3 при 8 5.04/3.69, Gal Н-1, GlcNAc Н-3 при 8 4.49/3.83 и GlcNAc Н-1, Rha Н-3 при 8 4.78/3.93 в пвтряющемся звене 1; Rha2Me Н-1, Gal Н-3 при 8 5.18/3.71, Gal Н-1, GlcNAc Н-3 при 4.49/3.83, GlcNAc Н-1, Rha2Me Н-3 при 8 4.77/3.94 в пвторяющемся звене 2.
Примечание. аОпубликованные химические сдвиги Fuc Н-4 и C-4 (Belyakov et ah, 2012) были уточнены. Стветственн, в !Н,13С НМВС эксперименте прслеживались крреляции между анмерными пртнами и трансгликзидными углердами: Rha Н-1, Gal С-3 при 8 5.04/81.7; Gal Н-1, GlcNAc С-3 при 8 4.49/83.9 и GlcNAc Н-1, Rha С-3 при 8 4.78/81.4 в пвтряющемся звене 1 и Rha2Me Н-1, Gal С-3 при 8 5.18/81.8; Gal Н-1, GlcNAc С-3 при 8 4.49/84.1 и GlcNAc Н-1, Rha2Me С-3 при 8 4.77/80.4 в пвторяющемся звене 2. Эти данные стветствуют плученным ранее в ГЖХ-МС анализе частичн метилирванных ацетатв плилв и пзициям замещения мнсахаридв, пределенных из анализа химических сдвигв сигналв 13С-ЯМР спектра.
Таким бразм, ПС, плученный в результате распада п Смиту ОПС A. brasilense Sp7, сстит из линейных трисахаридных пвторяющихся звеньев двух типв: 1 и 2, тличающихся лишь метилирванием статка рамнзы (схема 1). Исхдя из стншения интегральной интенсивнсти сигналов анмерных пртнв Rha и Rha2Me в -ЯМР спектре, пвтряющиеся звенья 1 и 2 присутствуют в стншении -1.5:1.
Устанвление структуры пвтряющихся звеньев О-специфических плисахаридв бактерий A. brasilense SR7
Липоплисахариды пчвенных диазтрфных бактерий рда Azospirillum, являясь мажрными кмпнентами наружнй мембраны, участвуют в кнтактных взаимодействиях с другими микрорганизмами и растениями. Для мниторинга формирвания растительн-микрбных ассциаций и распрстранения азспирилл в почве рядм авторв (Кннва и др., 2008; Бйк и др., 2010; Федненк и др., 2011) предлжена схема распределения известных штаммв азспирилл на группы на снвании результатв их серлгическг анализа. Схема снвана на спсбнсти липополисахаридв грамтрицательных бактерий вызывать бразвание антител, специфически узнающих иммундминантные эпитпы О-плисахаридных цепей.
Ранее прдемнстрирвана важная рль D и L рамнзы в формирвании антигенных детерминант в сставе сматических антигенв азспирилл,
тнесенных к сергруппам I и III (Бйк и др., 2010; Федненк и др., 2011). Информация стрении и антигеннй специфичнсти ЛПС Azospirillum spp. представителей сергруппы II, плученная в результате настящег исследвания, дплняет и расширяет существующую на сегдняшний день схему сертипирвания этих бактерий.
Одним из ключевых результатв, плученных в данной рабте, является пределение структуры ОПС типвг штамма бактерий - A. brasilense Sp7. К решению этй задачи обращались мнгие исследватели (Жемеричкин и др., 1987; Vanbleu et al., 2005; Lerner et al., 2009), на результаты кторых мы пирались при изучении структурных особеннстей О-антигенв этих микррганизмв. Однй из собенностей этог штамма, выявленнй в наших исследваниях, является наличие, п меньшей мере, трех типв пвтряющихся звеньев в ОПС. Для почвенных бактерий таке мнгобразие ОПС в сставе ЛПС бнаружен впервые. Из литературных данных известн, чт гетергеннсть О-плисахаридных цепей других пчвенных микррганизмв буслвлена наличием терминальных заместителей в нестехиметрическм сдержании или вариациями в пзициях замещения в снвной цепи (Здрвенк и Здрвенк, 2010; De Castro et al, 2004).
Структурне схдств плисахаридных цепей, гликозилирующих флагеллин полярнг жгутика, и пвторяющихся звеньев ОПС A. brasilense Sp7 является косвенным признакм вовлечения дних и тех же генв в бисинтетические пути этих биплимерв, днак дказательство этог предпложения мжет быть плучен лишь в результате генетических исследваний. Показан, что характерным тличием ЛПС A. brasilene Sp7 т гликанвой цепи флагеллина является наличие метксильнй группы в пложении 2 статка рамнзы. Метилирвание и ацетилирвание мнсахаридных статкв ОПС в свкупнсти с ширким распрстранением 6-дезксисахарв, мжет тражаться на гидрфобнсти клетчнй пверхнсти бактерий, пвышая активнсть их адсрбции на крнях и как следствие -эффективнсть ассциации с растениями. Структурне разнбразие ОПС А. brasilense Sp7 буславливает присутствие различных иммундминантных эпитпв в их ЛПС и мжет являться причинй наблюдаемых различий в антигеннй специфичнсти штаммв Azopirillum, серлогически родственных штамму Sp7.
Присутствие нескльких типв ОПС в сставе ЛПС бнаружен и у бактерий, серлогически рдственных типвму штамму. Исследвания пказали, чт штамм A. brasilense SR7, ассциант ежи сбрнй, излирванный на территории Саратовскй бласти, также прдуцирует в ОПС два типа пвторяющихся звеньев, структура ктрых идентична таквым штамма А. brasilense S17 (Fedonenko et al, 2008), выделеннг из ризсферы прса в Пакистане. При этом бщим структурным фрагментм их ОПС и ОПС штамма Sp7 являются статки Rha2Me, возмжн, буславливающие серлгический перекрест между ними.
Структурн гетергенные ОПС бнаружены у целй группы штаммв (A. brasilense SR50, SR80, SR88, SR109, SRI 15 и A. lipoferum SR42), выделенных в Саратовскй бласти из ризосферы пшеницы, кукурузы и срг, реализующих различные типы фотсинтеза. При идентичнй структуре пвторяющихся звеньев в ОПС этих бактерий выявлены тличия в срдстве их ЛПС к анти-ЛПС антителам штаммв A. brasilense Sp7, Jm6B2 и Sp245. Причинй вариаций серлгическй специфичнсти, наблюдаемых в иммунхимических тестах, мжет являться разне стншение ОПС, имеющих тличающиеся п структуре пвторяющиеся звенья. Следует тметить, чт в ОПС исследуемых штаммв присутствует бщее пвторяющееся звен, структурн близке таквму в ОПС A. brasilense Jm6B2 (Boiko et ah, 2012), днак данный плисахарид является минрным для ЛПС группы упмянутых выше саратвских штаммв и A. brasilense Sp7. Крме тг, общим в стрении преобладающих пвторяющихся звеньев ОПС A. brasilense Sp7 и исследуемых штаммв является наличие терминальных статкв L-фукзы. Эти структурные сбеннсти, чевидн, внсят вклад в бразвание специфических антител и буславливают межштаммве серлгическе рдств.
Характеристика ЛПС призводных штаммв A. brasilense Sp7.K2, Sp7.2 и Sp7.5 пзвлила бнаружить, чт изменения структуры pRhico не влияет на спсбнсть этих бактерий синтезирвать S-формы ЛПС, и прдуцирвать ОПС с пвторяющимися звеньями рдительскг штамма. Плученные сведения структуре ОПС штамма Sp7.K2 являются доплнением к существленнй ранее характеристике антигенных свойств ег ЛПС (Матора и др., 2008). Выявляемая иммунхимическими методами утрата днй из антигенных детерминант в ЛПС этих бактерий бъясняется ее маскирванием в результате синтеза ширк распрстраненнг у азспирилл рамнанвг плисахарида. Подбная крреляция устанвлена в даннй рабте и для ЛПС бактерий A. brasilense SRI 15 при взаимодействии с Ат к ЛПС штамма SR80.
