Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. 6
1.1. Анабиоз как явление природы. 6
1.2. Стресс у бактерий и реакция на него. 7
1.2.1. Выживание бактерий в процессе длительного голодания. 9
1.2.2. Стационарная фаза развития культуры. 10
1.2.3. Факторы, определяющие поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ. 11
1.2.4. Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания . 12
1.2.5. Генетическая регуляция переживания бактериальными клетками неблагоприятных
условий. 16
1.3. Покоящиеся формы неспорулирующих бактерий. 19
1.41 Выход бактерий из покоящегося состояния. 22
1.5. Социальное поведение бактерий. 29
1.6. Туберкулез и латентность инфекции. 30
1.6.1. Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных . 31
1.6.2. Модели покоящихся форм М. tuberculosis in vitro. 33
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1. Выращивание бактериальных культур 35
2.2. Оценка жизнеспособности клеток. 36
2.3.Определение общего числа клеток (ОЧК) 36
2.4. Получение супернатантов для восстановления «некультивируемых» форм. 36
2:5. Получение рекомбинантного фактора Rpf. 36
2.6. Аффинная хроматография с использованием антител. 37
2.7. Реактивация «некультивируемых» форм. 38
2.8. Измерение численного распределения клеток. 38
2.9. Флуоресцентная микроскопия. 39
2.10. Сканирующая электронная микроскопия. 39
2.11. Измерение окислительно-восстановительного потенциала. 39
2.12. Трансформация культуры М. smegmatis. 40
2.13. Процедура со-культивирования. 40
2.14. Иммуноферментный анализ. 40
2.15. Получение СН, обладающего ингибиторным действием на рост клеток. 40
2.16. Тестирование активности ингибирующих супернатантов. 41
2.17. Гель - фильтрация СН с ингибирующей активностью. 41
2.18. Ультрафильтрация СН с ингибирующей активностью. 41
2.19. Гидрофобная хроматография. 41
2.20. Тонкослойная хроматография (ТСХ). 42
2.21. Получение фракции липидов из супернатанта с ингибирующей активностью. 42
2.22. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). 42
2.23. Инфракрасная спектроскопия ингибирующего вещества (ИВ). 42
2.24. Включение радиоактивной метки. 43
2.25. Хромато-масс-спектроскопия. 43
Глава 3. Результаты. 45
3.1. Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae.—45
3.1.1. Поведение культуры Rhodococcus rhodochrous в условиях недостатка питательных. веществ . 45
3.1.2. Образование «некультивируемых» форм культурой Mycobacterium smegmatis, как результат действия многих факторов. 48
3.1.3. Формирование покоящихся клеток культурой Mycobacterium tuberculosis при длительном инкубировании в стационарной фазе. 51
3.1.4. Микроскопия клеток, проявляющих способность образовывать покоящиеся формы. 53
3.1.5. Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis . 56
3.2. Изучение вещества, накапливающееся в культуральной жидкости бактерий при переходе в «некультивируемое» состояние. 59
3.2.1. Тестирование активности и физико-биологические характеристики ИВ. 60
3.2.2. Метод очистки. 64
3.2.3. Исследование структуры. 65
3.3. Восстановление покоящихся форм. 82
3.3.1. Разработка процедуры реактивации «некультивируемых» клеток. 82
3.3.2. Биохимический анализ супернатантов, проявляющих активирующую активность. 92
3.3.3; Исследование трансформантов М. smegmatis, содержащих плазмиду со встроенным
белком Rpf. 94
Глава 4. Обсуждение, 98
Выводы 105
Список литературы 106
- Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания
- Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных
- Поведение культуры Rhodococcus rhodochrous в условиях недостатка питательных. веществ
- Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis
Введение к работе
Хорошо известно, что при попадании в неблагоприятные условия, многие бактерии способны переходить, в покоящееся состояние. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным» отсутствием деления. Ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие: бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными. Под.покоящимся состоянием- мы понимаем такое, обратимое состояние бактериальной клетки, при котором уровень метаболической активности значительно снижен, а клетка может существовать в таком состоянии без деления длительное время;[Kaprelyants, 1993].Такие покоящиеся клетки, как правило, изменяют свою форму, утолщают клеточную стенку и становятся менее чувствительными:к агрессивным внешним воздействиям. И; хотя обычные микробиологические: методы зачастую не могут выявить микроорганизмы, находящиеся в покоящемся состоянии, такие бактерии при наступлении благоприятных условий способны продолжить рост.
До недавнего времени существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было установлено, хотя для ряда других неспорулирующих бактерий переход в покоящееся состояние экспериментально установлен.
Известно, что каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis, живя: с постоянным риском перехода в активную форму болезни. До сих пор нет единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется. Существует распространенная точка зрения, что патогенные, медленно растущие микобактерий Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium leprae могут сохраняться в течение длительного времени in vivo после начала инфекции, переходя в покоящееся состояние [Gangadharam, 1995] [Parrish, 1998]. Предполагается, что такие покоящиеся, клетки М tuberculosis могут сохраняться много лет в хозяине (латентная инфекция) с возможным последующим переходом в активное состояние, и, как следствие, активизацией болезни. Однако экспериментальные доказательства такого предположения практически не получены.
Ранее в нашей лаборатории было • обнаружено, что клетки неспорулирующей бактерии; Micrococcus luteus в стационарной фазе при определенных условиях переходят в состояние, которое характеризуется низким уровнем метаболизма и потерей культивируемости клеток на твердых и жидких средах [Kaprelyants, 1993]. Для реактивации таких клеток необходимо было проведение процедуры «оживления»- культивирование покоящихся клеток с добавлением в жидкие среды ростовых факторов. Было обнаружено, что реактивирующей покоящиеся клетки способностью обладает секретируемый в культуральную среду белок М. luteus, названный Rpf (от английского resuscitation promoting factor). Согласно базам данных гомологичные гены rpf имеются в микроорганизмах рода Mycobacterium. Об этом также свидетельствуют результаты гибридизации и ПЦР со специфическими для rpf праймерами. Логично предположить, что продукты rpf-подобных генов в этих бактериях выполняют аналогичные ему функции. В частности, в М. tuberculosis имеется 5 генов и, может быть, они контролируют вход\выход из покоящегося состояния.
Несмотря на значимость изучения латентности туберкулеза, экспериментальная модель покоя клеток возбудителя не описана, тем более не установлена роль белков Rpf в этом процессе.
Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания
В процессе адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды, например к голоданию по какому-нибудь компоненту, метаболизм бактерий начинает меняться. Если в нормальном состоянии происходит преимущественно синтез основных строительных блоков клетки ( белки, жиры, углеводы), которые необходимы для образования новых бактерий, то в состоянии стресса клетка переключается на синтез резервных веществ и вторичных метаболитов. Это происходит в результате следующих событий: 1) исчерпание необходимого питательного компонента, недостаток которого приводит к изменению метаболических путей, что в свою очередь приводит к значительному изменению клеточного состава; 2) увеличение скорости начального метаболизма; 3) увеличение способности поглощения питательных веществ [Harder, 1983]. В каждый конкретный момент жизнедеятельности клетка реализует свои потенциальные возможности лишь незначительно - порядка 10% всего генного материала, а остальной объем генома является фондом, обеспечивающим способность организма перестраивать метаболизм в соответствии с внезапно изменяющимися внешними условиями
Обнаружено, что в условиях роста, когда бактерии не получают количества аминокислот, достаточного для поддержания белкового синтеза, в клетке начинают происходить процессы, получившие название - «сильный ответ». Это сложный набор реакций, в результате которого происходит увеличение деградации белка, уменьшение, мембранного транспорта, резкое снижение синтеза и накопления РНК, снижение эндогенного синтеза нуклеотидов, гликолитических интермедиатов, углеводов, липидов, жирных кислот, полиаминов и пептидогликанов. При этом происходит накопление цАМФ и повышение контроля трансляции белков [Mason, 1986]. Для запуска сильного ответа достаточно голодание по какой-либо одной аминокислоте. Сигналом, инициирующим этот запуск, является явление холостого взаимодействия, когда присутствует ненагруженнаятРНК в участке А рибосомы, блокируя дальнейшее продвижение рибосомы. В процессе голодания по аминокислотам в клетке накапливается нуклеотид - ppGpp (гуанозинтетра-фосфат), а. в некоторых случаях pppGpp (гуанозинпентафосфат): Эти нуклеотиды являются типичными низкомолекулярными эффекторами. Они способны присоединяться к белкам и вызывать в них конформационные изменения [Gallant, 1979].
В процессе адаптации культуры клетками Vibrio sp. SI4 б к недостатку питательных веществ было выделено три физиологических фазы: 1) 0-30 минут после начала голодания -непосредственно сильный ответ; 2) через 30-350 минут наблюдалось ослабление сильного ответа, снижение уровня ppGpp, что сопровождалось частичным восстановлением макромолекулярного синтеза; на этом этапе интенсивно протекали процессы эндогенного протеолиза, а также использования запасных питательных веществ; 3) последняя фаза включала постепенное снижение макромолекулярного синтеза, эндогенного дыхания, а в дальнейшем переход в относительно стабильное (возможно, покоящееся) состояние [Nystrom, 1990].
Было установлено, что полиамины играют немаловажную роль в регуляции адаптивных реакций микроорганизмов на стресс. Введение NaCl или сахарозы в экспоненциально растущую культуру E.coli (при осмотическом шоке) сопровождалось входом калия в клетку и изменением соотношения путресцина. Основным местом связывания путресцина является ДНК. Потеря клетками этого вещества приводила к снижению суперскрученности ДНК. Дальнейшая адаптация к этим стрессовым факторам происходила на фоне обратного переноса в клетку путресцина во второй фазе температурного шока и резкого подъема внутриклеточного калия в аналогичный период! осмотического шока: Оба эти процесса приводили к восстановлению и значительному превышению исходного уровня суперскрученности ДНК [Tkachenko, 2003].
Многие исследователи связывают изменения, происходящие в клетках при голодании, прежде всего с исчерпанием клеточных ресурсов. Действительно, в процессе, голодания наблюдалось снижение содержания углеводов АТФ, липидов, РНК, белков [Morita, 1982] [Mason, 1986]; Уровень ДНК обычно стабилен, иногда с небольшими колебаниями концентрации: в начале голодания [Boyaval, 1985], но показаны случаи его резкого или постепенного снижения, что вероятнее всего связано с гибелью клеток [Hood, 1986] [Diaper:, 1994]:
Для голодающих клеток характерно изменение состава жирных кислот [Gurkert, 1986] [Under, 1989]. По-видимому, это связано с использованием жирных кислот в качестве энергетического источника, но есть данные, что при, этом увеличивается проницаемость мембраны для специфических субстратов [Massa, 1988]. Известно, что в процессе голодания клеточная стенка бактерий становится, более гидрофобной в результате утилизации гидрофильных компонентов. Это, в свою очередь, приводит к повышению адгезивных свойств клеток и способствует их прикреплению к различным поверхностям [Marshall, 1988]. Возможно, гидрофобность стенки определяет повышенную устойчивость голодающих клеток к автолизу [Nystrom І , 1989]. Морита подчеркивает, что клетка, переживающая голодание, переходит в стабильное состояние метаболического ареста. При этом геном сохраняется в интактном состоянии, но утилизируются практически все биосинтетические ферменты [Morita, 1990]. При использовании полимеразной цепной реакции требовалось гораздо большее количество ДНК из «некультивируемых» бактерий в сравнении с нормальными клетками [Brauns, 1991]. Это может объясняться особыми перестройками или специфической упаковкой генома, хотя не исключена возможность потери ДНК. Например, количество ДНК в некоторых олиготрофных клетках, обнаруживаемых в окружающей среде, составляет всего 30-40% от генома Е. coli [Schut; 1993]. Синтез специальных белков также является важнейшим универсальным механизмом, посредством которого клетка способна переживать неблагоприятные условия [Morris, 1993]. Например, при наступлении недостатка питательных веществ, клетка очень быстро начинает синтезировать так называемые белки голодания [Reeve, 1984]. Белки голодания, как правило, можно разделить на две большие группы: универсальные антистрессовые белки, которые синтезируются в ответ на воздействие различных факторов (повышенную температуру, окислительный» стресс, изменение осмотического давления; и т. п.) и белки, специфичные для данного вида голодания [Matin, 1992]. В настоящее время очень хорошо, изучены некоторые из белков, которые синтезируются в ответ на тепловой шок, голодание.-Это, например, характерные для клеток Е. coli белки DnaK, GroEL и другие. Каждый вид голодания характеризовался определенными белками. Например, при голодании клеток Е. coli по углероду, азоту и фосфору синтезировалось соответственно 55, 47 и 35 полипептидов. Но 15 из них синтезировались при любом виде голодания [Matin, 1990]. Важно, что синтез 2/3 белков голодания положительно регулируется уровнем цАМФ [Schultz, 1988]. Эти белки, кодируемые так называемыми est генами, синтезируются при недостатке источника углерода. Было показано, что они не влияли на развитие в голодающих клетках устойчивости к повышенной температуре, гиперосмотичности, воздействию перекиси водорода. Считается, что эти белки способствуют повышению эффективности использования различных источников углерода. Хотя некоторые (например, Usp70) могут играть важную роль в пострансляционной модификации белков [Nystrom, 1994] . Белки, синтез которых не зависит от содержания цАМФ, кодируются рех генами и включают, в частности, широко известные белки теплового шока. Штаммы с делениями гроН гена (продукт которого сигма-фактор регулирует транскрипцию рех генов) имели резко сниженный синтез DnaK, GroEL и HtpG, очень быстро теряли жизнеспособность при голодании, хотя развивали повышенную устойчивость к различным стрессам [Matin, 1992].
Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных
Для изучения латентного туберкулеза необходимо иметь экспериментальные модели с использованием животных. В настоящее время в качестве таких моделей могут быть рассмотрены так называемые модели хронического туберкулеза и Корнеллевская модель. Хронический туберкулез.
Сэвер и Юманс [Sever, 1957 ] внутривенно заражали мышей различными дозами М. tuberculosis и исследовали их через определенные интервалы. Начальная скорость деления туберкулезных бацилл в легких не изменялась приблизительно в течение 2-х недель, после этого число бактерий стабилизировалось в течение, по крайней мере, 80 дней. Этому плато соответствует количество микроорганизмов 4104 — 410б КОЕ в зависимости от исходного размера инокулята. Полагают, что клетки при этом находятся в особом состоянии, близком к покоящемуся . Исследования, подобные этому [Sever, 1957] [Yamamura, 1960] показали, что питание, содержащееся в тканях не является лимитирующим фактором в образовании таких бактерий, а переход в неактивное состояние связан с иммунным ответом организма хозяина на инфицирование. Клетки М tuberculosis, изолированные из тканей животных с хроническим туберкулезом, обладали особыми свойствами [Sever, 1957].
Врукс со соавторами [Brooks, 1999] отметили, что метронидазол, который обладает бактерицидным действием на туберкулезные бациллы, находящиеся в анаэробном состоянии [Wayne, 1994], [Wayne, 1996], оказывает, слабый бактерицидный эффект на МТБ, находящийся в поздней хронической форме в мышах.
Очевидно, клетки возбудителя при хроническом туберкулезе способны к дальнейшей пролиферации. Так Орм с соавторами [Cooper, 1995] [Orme, 1995] [Orme, 1988] аэрогенно инфицировали 3-хмесячных мышей менее чем 10 бактериями и затем следили за течением инфекции в течении всей жизни животных. После обычного начального деления в легких и последующего входа в неделящееся состояние, бактерии остаются неактивными пока мыши не достигают 18-месячного возраста, затем бациллы начинают резко размножается, что приводит к смерти животных. Возобновление бактериального роста в мышах 18-месячного возраста совпадает с возрастными изменениями иммуннологического ответа [Cooper, 1995] [Orme, 1988]. Важно отметить, что возбудитель во всех моделях хронического туберкулеза представлен культивируемыми бактериями. Корнелевская модель. В 1956 году Маккун и Томпсет обнаружили, что комбинация изониазида и пирацинамида, введенная в день внутривенного инфицирования, мышей приводит к. исчезновению туберкулезных бацилл из легких и селезенки [McCune, 1966] . Однако, через 19 дней после окончания 30-ти дневного курса лечения, в тканях 1/3 мышей содержались жизнеспособные бактерии [McCune, 1956]. На эту модель «псевдостерилизации», т.е. исчезновения и появления. туберкулезных бацилл, ссылаются как на Корнеловскую модель (по названию университета). В 1995 году де Вит с соавторами [de Wit, 1995], используя большие инокуляты и небольшие дозы пиразинамида (меньшие, чем в исходной Корнелловской модели), показали, что происходит, по меньшей мере, 107-кратное уменьшение культивируемых бацилл по высевам на твердые среды в зараженных мышах в течение 12 недель после внесения антибиотика. Однако, количество клеток, оцененное по концентрации М. tuberculosis ДІЖ," определенной с помощью ПЦР, уменьшилось только 30-кратно и затем оставалась постоянной в течение 16 недель, что свидетельствовало о том, что большинство клеток находится в «некультивирумом» состоянии. Тем не менее было обнаружено, что. рифампицин, который ингибирует РНК полимеразу [Harshey, 1976], эффективен; при подавлении; рецидива латентной инфекции. Очевидно, что синтезы РНК имеют место и необходимы М. tuberculosis для выживания в недедящейся стадии латентной инфекции в течение всего наблюдения. Отсутствие экспериментов, в которых покоящиеся бактерии в Корнеловской модели могут быть "оживлены" in vitro, создает некоторые трудности интерпретации. С одной стороны, ПЦР может обнаружить существенное количество «некультивируемых» клеток, которые впоследствии оживают in vivo. С другой стороны, этот метод может обнаружить большое число мертвых клеток, вто время как увеличение колониеобразующих единиц (КОЕ) просто отражает рост очень маленького числа-жизнеспособных клеток, которые остались после лечения антибиотиками [Kell, 1998]. 1.6.2. Модели получения покоящихся форм М. tuberculosis in vitro. В 1993 году Корпер и Кон [Согрег, 1933] показали, что выживаемость туберкулезных бацилл в анаэробных жидких культурах сохраняется при 37 С в течение 12 лет. В процессе исследования линейного роста М. tuberculosis, Вейн [Wayne, 1976] показал, что в культурах, которые не перемешивались в течение всего времени инкубации в свободной от глицерина среде, устанавливается равновесие между туберкулезными бациллами в анаэробной нижней части пробирки и делящимися бактериями в верхней, богатой кислородом части. Клетки М. tuberculosis в нижней части пробирки» пребывали в. условиях постепенного истощения кислорода, что привело к формированию анаэробной неделящейся популяции бактерий [Wayne, 1994] [Wayne, 1996]. В этом состоянии, покоящиеся бактерии прекращают синтез белка, но он вновь начинается после нового поступления кислорода [Ни, 1998]. Подобное явление недавно было найдено для М.smegmatis [Dick, 1998] иМ bovis [Lim, 1999]. Для всех этих микобактерий. были характерны такие изменения в течение перехода к «анаэробному покою». Поскольку биохимическим исследованиям таких клеток препятствует гетерогенность оседающих клеток, был разработан улучшенный вариант модели Вейна [Wayne, 1996]. В этой модели использовались запечатанные пробирки, содержащие магнитные метальники. Пробирки помещались на магнитные мешалки, и происходило постоянное перемешивание культуры, при- этом- поддерживалась ее гомогенность. Это приводило к выравниванию концентрации воздуха в жидкой и газовой фазах и затем к полному исчерпанию кислорода [Wayne, 2001 ]. В; течении первых 70-ти часов роста логарифмические клетки удваивались в течение 16,5 часов [Wayne, 1996]. Когда концентрация растворенного в среде кислорода; достигла 1%, почти все клетки резко прекратили деление и вошли в состояние, похожее на покоящееся. При этом наблюдалось утолщение клеточной, стенки бактерий. При. дальнейшей инкубации, когда система достигла анаэробной стадии при кислородном уровне ниже 0,06%, клеточное деление прекратилось совсем. Перенесении клеток в свежую аэрируемую среду привело к началу их синхронного деления [Wayne, 1996]. Эта модель (модель Вейна) приобрела в настоящее время большую популярность, как имитирующая переход М. tuberculosis в покоящееся состояние. Однако, в отличие от Корнелевской модели in vivo, в модели. Вейна покоящиеся клетки являлись культивируемыми. Таким образом, вопрос о том, являются ли анаэробные клетки М. tuberculosis в модели Вейна покоящимися остается открытым.
Поведение культуры Rhodococcus rhodochrous в условиях недостатка питательных. веществ
Клетки R. Rhodochrous первоначально росли на богатой среде Broth Е в. течение различного времени и, затем, использовались в качестве инокулята (10 клеток в мл ) для роста в модифицированной минимальной среде Сатона (увеличенные концентрации фосфатов в этой среде стабилизируют рН культуры в течение стационарной фазы). Стационарная фаза установливалась в пределах 24 часов, и дальнейшая инкубация закончилась. постепенным: снижением жизнеспособности клеток на твердой среде, начинающегося примерно через 30 часов после, засева (рис. 1). Минимальное значение колониеобразующих единиц (КОЕ) наблюдалось между 80-100 часами- инкубации. В дальнейшем: значение КОЕ постепенно увеличивалось, пока не достигло начального значения. После наступления стационарной фазы роста общее число клеток. (ОЧК) и оптическая плотность не менялись, за исключением того, что оптическая плотность слегка упала в момент периода «некультивируемости» (рис. 1). Время, при котором КОЕ достигало минимального значения, менялось от одного эксперимента, к другому, но это совпадало с моментом увеличения окислительно-восстановительного потенциала культуры (Рис. 2). Способность образовывать формы, не образующие колоний, зависела от возраста инокулята. Самый большой эффект наблюдался при использовании инокулята в возрасте приблизительно 18-19 часов (рис. 3), при этом скорость качания должна быть не меньше 200 об/мин. При более медленном перемешивании снижение степени «некультивируемости» практически не наблюдается из-за большой агрегации культур (не показано).
Эффект перемешивания проявился при получении "некультивируемых" клеток/?, rhodochrous на бедной среде. При слабом перемешивании снижение жизнеспособности на твёрдой среде практически не наблюдалось. Это связано, вероятно, с тем, что клетки агрегируют и возможно выделяют факторы химической природы, поддерживающие их жизнеспособность. При более интенсивном перемешивании происходит накопление ингибирующего вещества (рис. 4) и клетки частично теряют культивируемость на твёрдых средах. Оптимальными условиями для получения "некультивируемых" клеток R. Rhodochrous являются: очень бедная среда без тиамина, скорость, качания между 200-250 оборотов в минуту, 12 % - 25 % от объема колбы должен составлять объем среды, определенный возраст инокулята. Подобная комбинация условий указывает на образование каких-то особых межклеточных взаимодействий, которые, приводят к потере жизнеспособности на твердой среде.
Клетки родококка выращивали на богатой среде в течение 18-19 часов, а затем инокулировали в модифицированную среду Сатона. Периодически проводили оценку числа КОЕ и тестировали супернатанты в этих точках на реактивирующую активность. Культура, которую реактивировали имела КОЕ = 8 104 и ОЧК=1,7 109.
При изучении процесса образования «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis было обнаружено, что к этому состоянию приводят различные факторы. Найдено, что образование «некультивируемых» форм наблюдается в результате культивирования клеток- при неблагоприятных условиях выращивания в логарифмической фазе. К таким условиям относятся: различные типы голодания, изменение состава среды роста, кислородный режим, искусственное поддержание постоянства рН. Голодание по таким элементам, как N, С или Р не приводят к формированию «некультивируемого» фенотипа (это достигалось путем 10-кратного снижения концентраций этих элементов в нормальной HdeB среде). Во всех трех случаях рост останавливался довольно быстро, при этом значение КОЕ составляло 107-108 кл\мл. Затем происходило уменьшение КОЕ до 105-10б кл\мл, что было связано с гибелью части культуры, которая детектировалась при помощи окрашивания клеток йодидом пропидия. При дальнейшей инкубации значение КОЕ не изменялось. В отличие от этих типов голодания, культивирование бактерий при неоптимальных условиях роста приводит к значительному снижению скорости роста и образованию покоящихся форм М. smegmatis в стационарной фазе. Значительное снижение КОЕ наблюдается при голодании по кислороду, микроэлементам и К+, изменении температуры и скорости перемешивания при выращивании, а так же при использовании мутантных штаммов с нарушениями метаболизма.
В стандартной HdeB среде культура росла с нормальной скоростью деления, резких изменений КОЕ в стационарной фазе не наблюдалось (рис.5). При модифицировании этой среды путем, снижения концентрации микроэлементов скорость роста бактерий значительно падала по сравнению с контрольной культурой. Максимальное КОЕ составило 107 кл\мл, что в 10 раз меньше, чем в контроле. При этом максимальная плотность культуры (107 кл\мл) достигается, когда культура входит в стационарную фазу. Это наступает примерно через 48 часов после инокулирования и, она примерно в 10 раз меньше, чем в контроле: Дальнейшая инкубация бактерий в стационарной фазе приводит к быстрому снижению выживаемости до значения 103 КОЕ\мл после 4 дней роста, затем снижение жизнеспособности происходит более медленно в течение следующих четырех дней (рис. 5). При этом общее число клеток после достижения культурой стационарной фазы не изменялось. Это состояние «некультивируемости» сохранялось в течение нескольких дней. В другом подобном эксперименте фосфат калия был заменен фосфатом натрия (модифицированная HdeB среда - см. в Методах). В результате число культивируемых на твердой среде форм падало ниже определяемого, уровня после 4-6 дней эксперимента (рис. 5). Однако, когда цитрат, содержащийся в модифицированной HdeB среде, был заменен сукцинатом, не происходило потери культивируемости в течение всей стационарной фазы (рис.6).
Существенную роль в появлении «некультивируемых» форм играет возраст исходного инокулята, выращенного на богатой среде роста и неизменность рН. В зависимости от возраста инокулята покоящиеся формы могут появляться либо через 4-6 дней (рис.7) или через 38 дней, либо не появиться совсем.. Для инокулята, выращенного в течение 27-32 часов на богатой среде, характерно образование покоящихся форм при пересеве в модифицированную HdeB среду через 4-6 дней эксперимента (рис.7). При возрасте инокулята 48 часов наблюдался более медленный процесс образования; «некультивируемых» клеток, инокуляты в возрасте 24 и 72 часа не давали снижения КОЕ в течение 14-ти дней эксперимента (рис.7).
Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis
Во время перехода к состоянию «некультивируемости», мы обнаружили присутствие ингибиторного компонента(ов) в супернатанте, который получен из культуры с низким уровнем жизнеспособности. Такой же эффект был обнаружен при і исследовании СН «некультивируемой» культуры М. smegmatis. При дальнейшем изучении оказалось, что в состав ингибирующего препарата входят мононенасыщенные жирные кислоты, среди которых преобладает олеиновая кислота. Возможно, они образуются при расщеплении триглицеридов в процессе изменения метаболизма при переходе к состоянию «некультивируемости». Демкина и др. показали, что при внесении v в: клеточные суспензии! олеиновой кислоты (химического аналога аутоиндуктора автолиза) с целью интенсификации автолиза. и ускорения выхода из лизированных клеток аутоиндуктора анабиоза — фактора di, процент сохранивших жизнеспособность бактерий был выше, чем в контроле без добавления аналога, на два порядка. (Демкина, 2000). Возможно также, что ненасыщенные кислоты воздействуют непосредственно на мембранный аппарат бактерий, что может привести к синхронному включению ряда биохимических процессов. Действительно, нами было обнаружено, что олеиновая кислота в концентрациях, сходных с теми, что накапливаются при переходе, в покоящееся состояние, ингибирует активность дыхательной цепи (неопубликованные данные). Таким образом, можно предположить, что обнаруженное накопление олеиновою кислоты в наших экспериментах является одним из механизмов образования покоящихся клеток при адаптации микобактерий к субоптимальным условиям роста.
Важнейший вопрос: является ли потеря культивирования отражением включения специальной программы в клетке для переживания клетками неблагоприятных условий. В этой связи было предположено, что двухкомпонентная система передачи сигнала в клетках M.smegmatis-DevR регулирует выживание этих клеток в стационарной фазе [O Toole, 2003]. Властности DevR регулирует адаптацию бактерий к кислородному голоданию. Однако авторы не исключают роль DevR в других видах голоданий. Возможно, образование НК клеток в DevR мутанте при кислородном голодании отражает роль этого регулятора в стационарной фазе в модулировании клеточного метаболизма и жизнеспособности; Это может приводить к нахождению клеток в НК состоянии, зависящем от интенсивности неблагоприятных факторов, которые не всегда могут быть связаны с кислородным режимом.
Имеется существенное: различие между «некультивируемыми» клетками R. rhodochrous, М. smegmatis и М .tuberculosis в их способности к активации. Для первых двух культур необходимым условием реактивации «некультивируемых» клеток являлось добавление в среду активации супернатанта, взятого от активно растущих клеток, или белка Rpf. В то время как вслучае с М. tuberculosis происходило существенное увеличение числа жизнеспособных клеток (до 6 порядков) при культивировании клеток на свежей среде Сатона без специальных добавок (рис.31). Возможно, это свойство возбудителя туберкулеза как-то связано с его способностью к длительной персистенции в организме хозяина и реактивации туберкулеза. Действительно, иммуноферментный метод и иммуноблоттинг обнаруживают в СН R.rhodochrous и М. smegmatis белки иммунологически близкие к Rpf (рис.37, 39). Присутствие в среде активации супернатанта или белка Rpf дополнительно увеличили степень реактивации относительно свежей среды (рис.31). Возможно действующим началом, способствующим реактивации клеток, является белок, сходный с ранее обнаруженным в СН M.luteus, белком Rpf. Действительно, в геноме М.tuberculosis присутствует 5 генов, кодирующих Rpf-подобные белки, которые, очевидно, секретируются в окружающую среду и могут играть сходную с Rpf роль при реактивации «некультивируемых» клеток М. tuberculosis. Самореактивация НК форм М.smegmatis, трансформированных плазмидой, экспрессирующей дополнительное количество Rpf (рис. 38), однозначно подтверждает роль белков,Rpf в: процессе реактивации. Недавно было обнаружено, что в клетках М. tuberculosis, выделенных из органов животных болеющих хроническим туберкулезом, наиболее экспрессируемым белком является один из белков семейства Rpf-Rvl 884с, что интерпретируется как участие этого белка в поддержании роста возбудителя в условиях персистирующей инфекции [Dahl, 2003]. Полученные нами данные с использованием ноль-мутантов М. tuberculosis по генам rpf свидетельствуют также о том, что это семейство белков. необходимо для реактивации покоящихся форм М. tuberculosis, по крайней мере, in vitro. Интересно, что индивидуальные белки Rpf, очевидно, взаимозаменяемы в этом процессе и выполняют сходные функции. Однако, эта взаимозаменяемость имеет пределы и комбинация из нескольких белков оказывается существенной для реактивации ( хотя нормальное размножение клеток происходит и при наличие только двух генов rpf (рис.40). Вышеприведенные данные ясно демонстрируют то, что термин «некультивируемость» имеет операционное значение («некультивируемость» в данных условиях). Бикетовым и др. было показано, что клетки М.. tuberculosis, неспособные к формированию колоний на агаризованной среде, могли расти в жидкой среде при добавлении белка Rpf [Biketov, 2000]. Недавно Дилон с соавторами продемострировали, что в тканях животных с хронической формой туберкулеза лишь -, 1-5% изолированных микобактерий, способны расти на твердых средах, в тоже время оживление этих культур, сходное с используемым нами методом, приводило к увеличению культивируемых форм в 20-100 раз [Dhillon, 2004]. Эти результаты свидетельствуют о значимости образования «некультивируемых» бактерий в развитии- латентных форм туберкулеза. Занг и со-авторы показали, что «некультивируемые» клетки накапливаются при продолжительной инкубации культуры М. tuberculosis. H37Rv в стационарной фазе в присутствии; твина-80 [Sun, 1999] [Zhang, 2001]. В отличие от нашего исследования, их клеточные популяции содержали значительное количество КОЕ. Они показали, что СН из растущей культуры М. tuberculosis содержит фосфолипиды, которые увеличивают число КОЕ в старых культурах, когда добавлены в чашки и позволяют расти низким инокулятам на жидких средах. Другим активным компонентом, изолированным из СН, был белок массой 8кДа (Rvll74c). Химически синтезированные пептиды соответствующие трем различным сегментам Rvll74c были были добавлены в мкМгконцентрациях (больших чем Rpf) к жидкой среде, инокулированной старыми клетками. После 5-10 дней инкубации число восстанавливающихся КОЕ увеличилось. Мы предполагаем, что в данном, случае имело место восстановление поврежденных клеток фосфолипидами и относительно высокими концентрациями пептидов. По ряду свойств (например, сниженная метаболическая активность) «некультивируемые» клетки М. tuberculosis могут быть отнесены к покоящимся формам. Наиболее известная модель перехода М. tuberculosis в покоящееся состояние in vitro - модель Вейна, в которой клеточные суспензии М. tuberculosis подвергались постепенному истощению по кислороду. Это приводило к формированию клеток в неделящемся состоянии [Wayne, 1996]. Предполагается, что в этом состоянии покоящиеся формы бактерий: прекращают синтез белка, но он вновь начинается после поступления кислорода [Ни, 1998]. Подобное явление было показано для М. smegmatis [Dick, 1998]. Однако, в отличие от наших исследований, микобактериальные клетки в модели Вейна сохраняли высокую жизнеспособность и развивали чувствительность к метронидазолу, переходя на «анаэробный» метаболизм [Wayne, 1994].
