Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1 1 Состояние «некультивируемости» -стратегия выживания бактериальных клеток в неблагоприятных (стрессовых) условиях? 7
1.1.1 Явление "некультивируемости" в бактериальных популяциях , 7
1.1.2 Критерии состояния "некультивируемости" 9
1 1 3 Образование "некультивируємых" форм бактерий в различных условиях 12
1 2 Реактивация («оживление») нкформ бактерий 21
1 3 «социальное» поведение бактериальных популяций и состояние «некультивируемости» 27
1 4 Латентность туберкулезной инфекции 29
1 4 1 Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных 30
1 4 2 Модели получения покоящихся («некультивируемых») форм Mycobacterium tuberculosis tn vitro 33
1 5 Биохимические изменения в клетках микобактерий при моделировании латентного туберкулеза 37
1 6 Генетическая регуляция ми ко бактериальной персистенции 40
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
2 Выращивание бактериальных культур . 48
2 2 Подсчет общего числа клеток .. 49
2 3 Микроскопические исследования . 49
2 4 Оценка культивируемости клеток 50
2 5 Реактивация «некультивируемых» клеток 50
2 6 Приготовление клеточных экстрактов 51
2 7 Выделение мембран . 51
2 8 Определение концентрации белка . 51
2 9 Определение активностей внутриклеточных ферментов 52
2.10 Определениеоксидазныхидегидрогеназныхактивн0стей ... ,52
211 Определение плавучей плотности клеток . 53
2 12 Выделение и очистка рнк .. 53
2 13 Обратная пцр 54
2 14 Транскриптомный анализ , 55
2 15 Получение рекомбинантных белков rpf . 55
2 16 Определение мурамидазной активности белков rpf и его модификаций 56
2 17 Электрофорез белков rpf в пааг 57
2 18 Иммуноблоттингбелковкр^ 57
2 19 твердофазный иммунофермектный анализ 58
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 59
3 Получение нк форм бактерий р mycobacterium 59
3 2 Характеристика нк форм м smegmatis активности ферментов и исследование уровня транскрипции генов при переходе клеток в состояние «некультивируемости» . .70
3 Роль белков семейства rpf в процессах перехода клеток микобактерий в нк состояние и последующей реактивации 95
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 110
Выводы 126
Список цитируемой литературы 127
- Состояние «некультивируемости» -стратегия выживания бактериальных клеток в неблагоприятных (стрессовых) условиях?
- Выращивание бактериальных культур
- Получение нк форм бактерий р mycobacterium
- Обсуждение результатов
Введение к работе
Известно, что при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды бактериальные клетки способны переходить в покоящееся состояние, сопровождающееся значительным снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Традиционно покоящееся состояние бактерий связывают с образованием специализированных структур (спор, цист и т.д.) Однако в последние годы была экспериментально установлена возможность перехода в покоящееся состояние и для неспорулирующих бактерий, происходящего без образования специализированных структур.
Особенный интерес представляет образование покоящихся форм неспорулирующими клетками микобактерий, и в частности, возбудителем туберкулеза бактерией Mycobacterium tuberculosis, в связи с предположением о том, что латентная форма туберкулезной инфекции связана с переходом бактерий в организме хозяина в покоящееся состояние. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - М. tuberculosis, но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что микобактерий туберкулеза, находясь в человеческом организме в латентном состоянии, в течение длительного времени сохраняют свою жизнеспособность, и как следствие, опасность развития заболевания, но детектировать их крайне сложно, поскольку они, очевидно, обладают свойством «некультивируемости», то есть неспособностью расти на стандартных лабораторных средах.
Предпринимались многочисленные попытки моделирования латентного состояния туберкулеза in vitro. Достаточно популярной моделью перехода клеток в покоящееся состояние считается так называемая модель Вейна, заключающаяся в длительной инкубации клеток М. tuberculosis в условиях постепенного снижающейся концентрации кислорода (Wayne, 1994), однако в случае такого экспериментального подхода у покоящихся клеток не наблюдается формирования «не культи вируємо го» (НК) фенотипа. Поэтому степень адекватности такой модели для имитации латентной туберкулезной инфекции остается под вопросом, поскольку латентное состояние клеток М. tuberculosis in vivo в первую очередь характеризуется потерей культи вирує мости. Кроме того, данное покоящееся состояние, возможно, является лишь отражением адаптации клеток микобактерий, являющихся аэробами, к недостатку кислорода. Недавно в нашей лаборатории была разработана модель получения покоящихся форм клеток М. tuberculosis, обладающих свойством «некультивируемости» (Shleeva et al., 2002), но этот процесс, также как и в модели Вейна, происходил в анаэробных условиях. Сложно сказать, насколько анаэробные условия отвечают реальным условиям, в которых туберкулезные бактерии находятся в тканях организма-хозяина после инфицирования. В частности, совсем недавно в литературе появилось экспериментальное свидетельство того, что при формировании гранулемы в легких инфицированных мышей бактерии М. tuberculosis не испытывают недостатка кислорода (Tsai et aL, 2006). Поэтому разработка модели перехода бактерий М. tuberculosis в НК состояние именно в аэробных условиях, на наш взгляд, представляет большую важность.
Ранее сотрудниками нашей лаборатории была показана возможность перехода бактерии М. smegmatis, быстрорастущего непатогенного родственника М. tuberculosis, в покоящееся состояние при культивировании в длительной стационарной фазе в аэробных условиях (Shleeva et al., 2004). При этом такие покоящиеся клетки теряли способность расти на твердых питательных средах, то есть являлись «некультивируемыми», но могли быть ревертированы в активное состояние при участии белков Rpf (Shleeva et al., 2004). Мы предполагаем, что такие НК клетки М. smegmatis могут рассматриваться как модель латентной туберкулезной инфекции in vivo.
Однако, по существу, к моменту начала настоящего исследования было известно только о существовании самого феномена «некультивируемости» М. smegmatis, но детальная характеристика клеток в НК состоянии не была проведена, также оставалось неясным, какие факторы оказывают влияние на переход М. smegmatis в НК состояние, а также является ли этот процесс генетически программированным, активным, или же он связан с деградацией клеток и их последующей гибелью. Кроме того, необходимо выяснить, какие механизмы лежат в основе процесса реактивации покоящихся клеток микобактерий.
Возможность получения НК клеток М. smegmatis без ограничения концентрации кислорода вселяла надежду на то, что могут быть найдены такие условия культивирования, в которых будет возможно формирование НК фенотипа в аэробных условиях и для клеток М. tuberculosis.
В связи с чем были сформулированы следующие цели и задачи исследования.
Цель данной работы заключалась в биохимической характеристике НК форм микобактерий, а также изучении механизмов перехода бактерий в НК состояние и выявлении факторов, обеспечивающих их последующую реактивацию. В соответствии с целью работы были поставлены задачи:
1.Оптимизация метода получения in vitro «некульти вирує мых» форм бактерии Mycobacterium smegmatis - быстрорастущего непатогенного родственника Mycobacterium tuberculosis.
2 Разработка метода получения in vitro покоящихся («некульти в и руемых») форм бактерии М. tuberculosis в аэробных условиях,
3. Биохимическая характеристика клеток М. smegmatis в «некультивируемом» состоянии
4.Исследование изменения уровня экспрессии генов (транскриптомный анализ) при переходе М. smegmatis в «некультивируемое» состояние.
5.Изучение механизмов функционирования белков семейства Rpf в процессе реактивации «некультивируемых» форм микобактерий.
Состояние «некультивируемости» -стратегия выживания бактериальных клеток в неблагоприятных (стрессовых) условиях
Находясь в окружающей среде, бактерии подвергаются воздействию широкого спектра стрессогенных факторов, таких как недостаток питательных веществ, экстремальные значения температуры и рН, воздействие токсичных компонентов, изменение содержания кислорода (Edwards, 2000). Бактериальные клетки снабжены целым арсеналом средств, позволяющих переживать стрессовые воздействия при нахождении клеток в естественной среде обитания, сохраняя при этом их целостность и поддерживая необходимые внутриклеточные процессы (Storz and Hengge-Aronis, 2000; Neidhardt, 2002). Простейшим ответом на стресс, по-видимому, следует считать отрицательный хемотаксис - стремление бактерии к перемещению на максимально далекое расстояние в ответ на присутствие в среде обитания неблагоприятных для жизнедеятельности химических компонентов. Однако большинство механизмов, направленных на сохранение жизнеспособности клеток в ответ на воздействия стрессов требуют включения хорошо организованных механизмов регуляции специфических генов (Storz and Hengge-Aronis, 2000), которые зачастую являются универсальными для различных по своей природе стрессов, а также продукции специфических ферментов {например, сверхсинтез каталазы и супероксиддисмутазы в ответ на окислительный стресс (Hengge-Aronis, 1993)) или специфических защитных соединений, таких как низкомолекулярные осмопротекторы трегалоза и бетаин (Hengge-Aronis, 1993). Существенный вклад в ответ на стрессовое воздействие и последующее выживание клеток вносят универсальные стрессовые белки (Nystrom and Neidhardt, 1994), а также специфические ДНК-связывающие белки, предохраняющие ее молекулу от деградации (Gupta et al., 2002; Frenkiel-Krispin etal.,2001).
Вслед за так называемыми «быстрыми ответами» обычно включаются различные долговременные программы выживания клеток, сопровождающиеся снижением метаболической активности. При непродолжительном падении уровня метаболизма бактерии оказываются способными к продолжению роста сразу же после снятия воздействия неблагоприятных условий. При достаточно протяженном и существенном снижении метаболической активности бактериальные клетки могут вслед за этим перейти в состояние покоя (Kaprelyants et al., 1993; Мулюкин и др., 1996; Kell et а!., 1998).
Выращивание бактериальных культур
Mycobacterium smegmatis. Штамм дикого типа тс2155, а также штаммы, полученные при трансформации плазмидой pAG, кодирующей синтез секреторной формы Rpf - (штамм AGR) и его мутантных форм, выращивались первоначально в течение 20-48 ч при 37 С на орбитальной качалке (240 об/мин) в колбах объемом 50 мл, содержащих 20 среды Nutrient Broth ("Himedia", Индия), к которой был добавлен твин-80 до концентрации 0,05% об. Затем 1 мл полученной культуры был инокулирован в колбу объемом 750 мл, содержащую 150 мл модифицированной среды Hartman s-de Bont (H-dB). Состав модифицированной среды H-dB (на 1 литр): 17,9 г Na2HPCy12H20,1,2 г лимонной кислоты, 20 г (NbUbSO, , 30 мл глицерина, 10 мл 5% раствора твин-80 и 10 мл раствора микроэлементов. Раствор микроэлементов (г/л): ЭДТА -1; МдСІгбНгО - 10; СаСІ2-2НгО - 0,1; С0СІ26Н2О - 0,04; МпСІ2-2НгО - 0,12; Na2Mo02H20 - 0,02; ZnS04-7H20 - 0,2; CuSO5H20 - 0,02 и FeSCWhteO -0,5. Для приготовления раствора микроэлементов сначала готовили раствор ЭДТА, рН которого ДОВОДИЛИ до 7,5 с помощью NaOH, затем добавляли соли. Для получения «некультивируємых» клеток к модифицированной среде H-dB добавляли стерильный раствор БСА (Cohn Analog) {«Sigma», США) до конечной концентрации 0,5%. В ряде случаев клетки, выращенные на среде Nutrient Broth, пересевали затем на синтетическую среду Sauton с добавлением 0,05% Твина-80. Состав среды Sauton (г/л): К2НР04 - 0,5; MgSCy7H20 -1,4; L-аспарагин - 4; цитрат железа-аммония - 0,05; трехзамещенный цитрат натрия - 2; ZnSC 4 - 0,001; глицерин - 60 мл. Полученный раствор был доведен до рН 7,0 с помощью NaOH, При выращивании штаммов, полученных трансформацией плазмидами, к среде роста был добавлен гигромицин в концентрации 50 мкг/мл.
Получение нк форм бактерий р mycobacterium
Оптимизация модели перехода культуры М. smegmatis в «некультивируемое» состояние при росте в стационарной фазе в аэробных условиях. Как известно, бактерия М. smegmatis при росте в стационарной фазе на не содержащей калия модифицированной среде Hartman s-de Bont в аэробных условиях обладает способностью переходить в НК состояние (Shleeva et al, 2004). Однако данная модель отличалась большой зависимостью эффективности перехода в НК состояние от возраста инокулята. Только инокулят, возраст которого находился в очень узком интервале - около 30 ч - позволял добиться снижения числа КОЕ в мл культуральной жидкости до нуля, что создавало ряд трудностей для исследования явления «некультивируемости» и характеристики НК форм М. smegmatis (Рис. 1).
Попытки оптимизировать имеющуюся модель путем вариации количества посевного материала, скорости перемешивания культуры, соотношения водная/воздушная фаза не приводили к существенному увеличению эффективности перехода клеток М. smegmatis в НК состояние. Однако добавление к модифицированной среде Hartman s-de-Bont бычьего сывороточного альбумина в количестве 0,5%, позволило значительно расширить диапазон возраста инокулята, приводящего к формированию «некультивируемого» фенотипа. Использование инокулята различного возраста - 20, 32, 35, 48 ч с последующим культивированием клеток в стационарной фазе приводило к полной потере способности бактерий расти на твердых средах. Кроме того, в присутствии БСА снижение числа КОЕ в 1 мл культуральной жидкости происходило быстрее. Так, полная потеря клетками М. smegmatis способности культивироваться на твердых средах происходила уже после 72 ч роста, а не 96, как это было показано ранее
