Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1. Распространение и физиологическая роль целлкшолитических ферментов 8
2. Механизм ферментативного расщепления целлюлозы 12
3. Целлюлазный комплекс 19
3.1. Множественность молекулярных форм целлкшолитических ферментов 19
3.2. Характерные особенности и физико-химические свойства эндоглюканаз 21
3.3. Характерные особенности и физико-химические свойства экзоглюканаз 23
3.4. Глюкозидазы: физико-химические и каталитические характеристики, субстратная специфичность, транс-гликозилазная активность 29
4. Биосинтез и секреция целлкшолитических ферментов 51
5. Механизм регуляции синтеза, секреции и активности ферментов целлкшазного комплекса 58
Экспериментальная часть 66
I. Материалы и методы 66
1.1. Условия культивирования гриба Aspergillus terreus и индукции уз-глюкозидаз и целлкшаз 66
1.2. Получение препаратов клеточных стенок, протопластов и различных ферментных фракций 67
1.3. Исследование отдельных форм -глкзкозидаз в процессе роста гриба A.terreus и при индукции в неростовых условиях 68
1.4. Исследование локализации р-глюкозидаз и целлкшаз иммунохимическим и цитохимическим методами 70
1.5. Очистка /0-глюкозидаз 72
1.6. Изучение свойств и специфичности /з-глюкозидаз 73
2. Результаты и их обсуждение 77
2.1. Выделение и очистка множественных форм уЗ>-глюкозидаз гриба A.terreus 77
2.2. Природные ингибиторы Л-ГЛЮКОЗИДаз гриба A.terreus 83
2.3. Сравнительная характеристика множественных форм -глюкозидаз гриба A.terreus 88
2.3.1. Физико-химические свойства и оптимальные условия гидролиза субстратов глюкозидазами A.terreus 88
2.3.2. Субстратная специфичность /5-глюкозидаз 98
2.3.3. Частичная структурная характеристика ферментов.114
2.4. Изучение индукции /3-глюкозидаз и целлкшаз A.terreus 118
2.4.1. Индукция ферментов в неростовых условиях 118
2.4.2. Индукция ферментов при росте гриба на различных субстратах 124
2.5. Локализация -глюкозидаз и целлкшаз 144
Заключение 156
Выводы 163
Список литературы 164
- Распространение и физиологическая роль целлкшолитических ферментов
- Характерные особенности и физико-химические свойства экзоглюканаз
- Исследование отдельных форм -глкзкозидаз в процессе роста гриба A.terreus и при индукции в неростовых условиях
- Физико-химические свойства и оптимальные условия гидролиза субстратов глюкозидазами A.terreus
Распространение и физиологическая роль целлкшолитических ферментов
Целлюлоза является самым распространенным, постоянно обновляющимся и практически неисчерпаемым природным ресурсом углерода. 40$ земной биомассы - целлюлоза. В естественных условиях конверсия этого биополимера осуществляется, главным образом, микроорганизмами (грибами, бактериями, актиномицетами).
В настоящее время можно выделить несколько направлений исследования деградации целлюлозы: 1. Изучение субмикроскопической, молекулярной структуры целлюлозы и процессов ее метаболизма. 2. Изучение целлюлозоразрушающих микроорганизмов. Выделение высокопродуктивных штаммов. 3. Изучение отдельных ферментов целлюлазных комплексов, их физико-химических свойств, процессов регуляции их синтеза и секреции, механизма ферментативного гидролиза целлюлозы. 4. Исследование разных аспектов применения целлюлолитических ферментов; в сельском хозяйстве (использование сельскохозяйственных отходов, повышение качества корма и его перевариваемос-ти); в пищевой промышленности (повышение выхода белков, жиров, крахмала, фруктовых соков, в тех случаях, когда это связано с разрушением клеточной стенки растительного сырья; получение глюкозы, фруктозы, этанола и др.); в медицине и фармацевтической промышленности (экстракция лекарственных веществ из клеток растений); в препаративной цитологии, цитохимии, молекулярной биохимии, при изучении процессов генезиса и деструкции клеточной оболочки растений, грибов и других вопросов (Билай и др.,1982). Перечисленные области применения целлкшаз свидетельствуют об их большом народнохозяйственном значении. Целлюлолитические ферменты образуют многие микроорганизмы, некоторые беспозвоночные животные, растения. Основная физиологическая роль целлюлолитических ферментов у микроорганизмов и беспозвоночных животных состоит в расщеплении целлюлозы и ее производных до глюкозы, которая используется как источник углерода и энергии, а у микроорганизмов-фитопато-генов - в разрушении растительной клеточной стенки для проникновения в цитоплазму (Hultberg et al., 1976; Родионова, 1981). У растений ферменты, расщепляющие целлюлозу, играют важную регуляторную роль в процессах роста растительной клетки и дифференциации, например, при росте клетки путем растяжения, опадении листьев, удалении пыльцевой трубки, созревании плодов, дифференциации сосудов. Появление такой местной целлюлазной активности в отдельных органах, по-видимому, тонко регулируется и, возможно, находится под гормональным контролем (Hultberg et al., 1976; Родионова, 1981). Наибольшее количество ферментов, расщепляющих целлюлозу, образуют микроорганизмы. В настоящее время трудно перечислить все целлюлолитические микроорганизмы, которые были изучены за последние 25-30 лет, однако удельный вес культур, выделенных из природной среды и способных удовлетворить запросы производства, крайне невысок. Как правило, это определяется либо низкой общей целлюлолитической активностью природных штаммов, либо их низкой активностью по отношению к нативной целлюлозе. Кроме поисков новых продуцентов, в результате селекции уже известных культур получено множество новых штаммов гиперпродуцентов. Из-за большого количества целлюлозы в природе, разлагающие ее микроорганизмы (грибы, бактерии, актиномицеты) играют очень важную роль в процессе минерализации и круговороте углерода (Билай и др., 1982). В аэробных условиях значительная роль в разложении целлюлозы принадлежит грибам. Они превосходят в этом отношении бактерии, особенно в кислых почвах и при разложении древесины (Eriksson, 1982). Из дереворазрушающих грибов можно упомянуть некоторые аско-мицеты, вызывающие "мягкую гниль" древесины, такие как Chaetomi-um globosum, Coniothyrium fuckelii, Thielavia, Stachybotrys , базидиомицеты, вызывающие "бурую гниль" - Pom.itopsis officinalis, и "белую ГНИЛЬ" - Trametes squaveoleus, Corollus versicolor (Билай и др., 1982). Важными представителями грибной флоры почвы являются грибы родов Trichoderma, Aspergillus, Penicilliuni, Geotrichum. Большинство исследований посвящены различным аспектам лизиса целлюлозы, осуществленного разными видами грибов рода Trichoderma (Mandels, Reese, 1964; Wood, 1968; Chang, Usami, 1969; Haliiweii, Griffin, 1973; Кожемякина и др., 1974; Wood, McCrae, 1975; Sternberg, 1976; Herr et al., 1978; Билай И ДР., 1982). Грибы рода Aspergillus уступают по суммарной целлюлазной активности грибам рода Trichoderma, но их преимущество проявляется в том, что в составе их целлюлазных комплексов обнаруживается значительно большая /-глюкозидазная активность, чем у остальных продуцентов (Ташпулатов, 1967; Legler, 1968; Цы:перович, Сургова, 1972; Хохлова, Исмаилова, 1973; Rudick, Elbein, 1973; Olutiola, 1976; Olutiola, 1977; Sternberg et al., 1977; Логинова и др., 1978; Логинова, Тапшулатов , 1978; Megara Matsushi-ma, 1974; Workman, Day, 1982; Свистова, 1984). Большое внимание в исследованиях целлюлолитических комплексов было уделено и представителям рода Penicillium (Selby et al., 1970; Boretti et al., 1972; Колеснева, 1972). Из термофильных грибов наиболее активно разрушают целлюлозу Chaetomium thermophile, Torula thermophile, в меньшей степени _ Humicola insolens и Sporotrichum thermophile (Romanelli et al., 1975; Eriksson, Pettersson, 1975; Eriksson, 4 977; Билай и др., 1982). Нужно подчеркнуть, что для почвенной целлюлозоразрушающей микрофлоры характерна синтрофия. Почвенные грибы разных видов существуют совместно, дополняя друг друга в процессах деградации сложного субстрата. У водных грибов Achlya ambisexualis, Saprolegnia parasitica, Dictynchus monosporus обнаружена корреляция между синтезом целлюлаз и ветвлением гиф. Эти процессы находятся под гормональным контролем ( Thomas, 1970; Mullins, 1973). В большинстве случаев синтез целлюлолитических ферментов грибами фитопатогенами родов Pusarium и Verticillium связан с проникновением возбудителя и развитием патогенеза определенных заболеваний (Cooper, Wood, 1975; Wood, МсСгае,1977; Би-лай и др., 1982).
Характерные особенности и физико-химические свойства экзоглюканаз
В настоящее время известны многие ферменты, которые существуют в виде множественных молекулярных форм. Последние несколько различаются по первичной структуре, но обладают близкой или одинаковой каталитической активностью. Известны некоторые генетические и эпигенетические пути возникновения множественных молекулярных форм. Термин "изоферменты" применим только к генетически детерминированным формам, которые могут быть обусловлены мутациями в структурных генах, существованием "дремлющих генов" ( Кеппеу, 1974; Markert, 1975). К этому следует отнести и мутации в пределах интронных последовательностей ДЕК у эукариот, что в свою очередь является причиной изменения типа вырезания молчащих последовательностей в між и, таким образом, приводит к вариациям в структуре продуктов трансляции (Дубинин, 1979). Термин "множественные молекулярные формы" является более общим и включает, помимо упомянутых выше, также те ферменты, которые возникают эпигенетически в результате изменения первичной структуры с помощью посттрансляционных ковалентних модификаций отдельных аминокислотных остатков , ограниченного протеолиза, вследствие агрегации и конъюгации с молекулами небелковой природы (Иванова, 1981).
В эволюционном отношении существование множественных молекулярных форм отражает тенденцию к специализации биохимических систем, хотя только для небольшого числа ферментов показана биологическая целесообразность существования этих форм. В некоторых случаях обнаруженные формы ферментов выполняют разные функции, связанные с меняющимися потребностями организма во время роста, регуляцией направленности биохимических процессов, с обеспечением адаптации клеток в условиях меняющейся внешней и внутренней среды ( Yermyn, 1962; Umezurike, 1970; Y/hitaker, 1971).
В настоящее время можно считать доказанным существование отдельных компонентов целлюлазных комплексов в виде множественных молекулярных форм. По мнению ряда авторов, множественность форм глюканаз и /-глюкозидаз связана либо с артефактами при очистке и хранении ферментов и не имеет никакого биологического смысла, либо их синтез является генетически обусловленным (Shewale,1982). Синтез отдельных изоэнзимов целлюлаз контролируется генетически, как это было показано в случае двух /-глюкозидаз IT.erassa, трех f -глюкозидаз C.thermophile, уз-глюкозидаз s.sanquinolenurn (Meyers, 1966; Bucht, Eriksson, 1969; Ebergart, Beck, 1973; Lusis, Becker, 1973). В других случаях множественные формы появлялись вследствие диссоциации фермента на составляющие его субъединицы (Umesurike, 1975). Множественность форм может являться следствием образования комплексов между ферментом и определенным количеством разных полисахаридов в среде, как это известно для f-глюкозидаз S.atra (Yermyn, 1962), Друтой возможный путь образования множественных молекулярных форм целлюлаз - это частичный протеолиз одной или нескольких исходных форм, который приводит к образованию нескольких ферментов с более или менее разной структурой и субстратной специфичностью, как это показано ДЛЯ f -ГЛЮКОЗИдаз грибов T.reesei, Monilia sp., Sclerotium rolf-r sii, T.koningii, для целлобиогидролаз T.koningii, T.viride, F.solani, для ЭНДОГЛЮКаназ T.koningii, G.candidum, A.terreus (Wood, 1969; Wood, 1971; Berghem, Pettersson, 1973; ITakayama et al., 1976; Rodionova, 1977; Desphande et al., 1978; Wood, McCral, 1979; Shewale, Sadana, 1981; Dekker, 1981; Wood et al., 1982; Панин и др., 1982).
Протеолитическая модификация ферментов имеет место как in vivo - внутри и вне клетки, так и in vitro - во время очистки ферментов (Selby, Maitland, 1967; Nisizav/a et al., 1974; Yoshikawa et al., 1974; ITakayama et al., 1976; Родионова, 1981; Labudova, Parcaa, 1983; Панин и др., 1983).
Степень структурного сродства ферментов оценивается путем сравнения их иммунохимических, физико-химических и кинетических свойств. В большинстве случаев характеризуются отдельные формы ферментов, причем, как правило, внеклеточные. Однако, к настоящему времени немного работ посвящено изучению динамики по-разному локализованных форм целлюлаз в процессе роста продуцента, а это могло бы помочь пониманию причин и целесообразности появления отдельных форм ферментов в одном и том же организме ( Canajvasci-ni, Meyer, 1979; Козловская, 1980; McHale, Coughlan, 1981; Dekker, 1981).
Большинство целлюлолитических микроорганизмов продуцирует несколько эндоглюканаз, различающихся по физико-химическим свойствам, по способности сорбироваться на целлюлозе, скорости гидролиза типов целлюлозы и образованию продуктов гидролиза, и, возможно, выполняющих разные функции при ферментативном гидролизе субстрата.
Как уже упоминалось, эндоглюканазы неупорядоченным образом гидролизуют внутренние связи в -I,4-глюканов и олигосахаридов, состоящих из остатков р - D-ГЛЮКОЗЫ, С образованием сначала олигосахаридов с более короткими цепями, а в конечном счете - целло-биозы и глюкозы. Эндоглюканазы снижают вязкость водорастворимого производного целлюлозы, карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вызывая образование определенного количества редуцирующих веществ (РВ). Эндоглюканазы с большей скоростью гидролизуют субстраты с более высокой степенью полимеризации, обладают высокой специфичностью к структуре дисахарида, расположенного рядом с расщепляемой связью с невосстанавливающего конца, а также к глюконовой и аглюконовой частям субстрата.
Множественные формы эндоглюканаз, выделенные из одного продуцента, обладают различной субстратной специфичностью. Эндоглюканазы дифференцируют по степени неупорядоченности их действия ( Nlsizawa et al., 1976; Wood, McCrae, 1977; Shoemaker, Brovm, 1978; Wood, McCrae, 1978). Одни ферменты действуют более неупорядоченно и поэтому расщепляют статистически связи во многих цепях, образуя мало РВ; другие гидролизуют концевые связи в одной или нескольких цепях, в результате чего степень снижения вязкости невелика, но образуется значительное количество редуцирующих Сахаров.
Исследование отдельных форм -глкзкозидаз в процессе роста гриба A.terreus и при индукции в неростовых условиях
Так, 0-глюкозидаза дереворазрушащего гриба B.tneobromae с молекулярной массой 355000-380000, состоит из 32 полипептидных субъединиц. При хранении при +4 С фермент диссоциирует на серию молекул с более низкой молекулярной массой. Гельфильтрация показала наличие J -глюкозидаз с молекулярным весом 355000-380000, I70000-I80000, 83000-87000 и 45000-47000, что говорит о диссоциации типа: (8) =2(4) =4(2) =8 (Umezurike, 1975). Ь -Глюкозидазы дрожжей имеют молекулярную массу около 300000 и состоят из 3 или 4 субъединиц, масса которых составляет соответственно 110000 или 80000 ( Marchin, Duerksen, 1968). Методом электрофореза в присутствии ДСН была показана димерная структура ft-глюкозидаз A.fumigatus, A.niger, A.oryzae, G.candidum ЗС, P.oryzae (Kudick, Allan, 1975; Hega, Matsuchima, 1979; Hirayama et al., 1979; Козловская, 1980; Enari et al., 1982). 0-Глюкозидаза D.discoideum (м.м. 160000) состоит из двух разных по молекулярному весу субъединиц - 88000 и 68000 (Dimond, Loomis, 1976). р -Глюкозидазы триходерм характеризуются низкой молекулярной массой, около 50000 (Berghem, Pettersson, 1974; Emert, Brown, 1977).
Оптимум активности J -глюкозидаз находится в кислой области рН (4-5) и при температуре около 50С (табл.3). Существуют и исключения, например, & -глюкозидаза Cguiiiiermondii имеет рН оптимум 6,8 и оптимум температуры 37С ( Roth,Srinivasan, 1978), периплазматическая f -глюкозидаза R.trifolii - рН 6,4 (АЪе, Higashi, 1982), Нейтральное рН является оптимальным ДЛЯ & -ГЛЮКОЗИдаз S.cerevisiae, E.herbicola (Duerksen, 1958; Garibaldi, Gibbins, 1975; Gooney,et al., 1978). Оптимальная температура действия y2-глюкозидаз c.thermocellum и T.auraniacus составляет соответственно 65 и 70С (Ait et al., 1979; Tong et al., 1980). б-Глюкозидазы микроорганизмов представляют собой кислые белки с рН 3,4-5,9. Исключение составляют лишь внеклеточная BG-1 И внутриклеточная IG-1 з -глюкозидазы Monilia sp. изоэлектрические точки которых 8,3 (Dekker, 1981).
Аминокислотный анализ изученных р -глюкозидаз показывает преобладание кислых аминокислот (табл.4), что, как правило, коррелирует с ИЭТ ниже рН 7,0.
Содержание углеводов в молекулах Jb -глюкозидаз различается. Большинство изученных 3 -глюкозидаз является гликопротеинами (табл.3). Так, из 3 ферментов, в молекулах которых не определялось содержание углеводов, 7 f -глюкозидаз не содержат углеводный фрагмент, 2 - содержат до 5#, 6 - более 23,4 углеводов. В молекулах остальных ферментов углеводы составляют 8-10$ от молекулярной массы. Углеводный фрагмент состоит из разных количеств глюкозы, маннозы, глюкозамина (табл.4). Предполагается, что эта часть молекулы стабилизирует фермент и, возможно, является ответственной за его сорбцию на субстрате (Hayashida, Yoshioka,1980; Рабинович, и др., 1982).
Глюкозидазы могут гидролизовать следующие субстраты: 1. алкил-у9- D-глюкозы (метил-/-D-глюкозид) 2. арил- - D-глюкозиды (п-нитрофенил- р- ъ -глюкозид) 3. глюкозиды, содержащие только карбогидратные остатки (целло-биозу). Поскольку некоторым авторам удалось разделить целлобиазную и /9-глюкозидазную активности, было предположено, что существуют два вида /-глюкозидаз: арил-/-глюкозидазы и глюкозидазы, расщепляющие различные дисахариды (Bucht, Eriksson, 1969; Родионова и др., 1977; Румянцева, Родионова, 1982; Shewale, 1982). Дальнейшие исследования показали, что некоторые f -глюкозидазы грибов обладают и арильной, и целлобиазной активностью (Rudick, Elhein, 1973; Berghem, Pettersson, 1974; Sternberg et al.,1977; Родионова И др., 1977; Desphande et al., 1978; Herr et al., 1978; Hirayama et al., 1978; Shewale, Sadana, 1981; Meyer, Cana-vescini, 1981). У S.sangicinolentum обнаружены две целлобиазы и одна /-глюкозидаза, у s.atra - одна 0-глюко-зидаза, не обладающая целлобиазной активностью, у G.candidum -четыре целлобиазы, две арил-уЗ-глюкозидазы со строгой субстратной специфичностью и одна f -глюкозидаза смешанного типа действия ( Yermin, 1962; Bucht, Griksson, 1969; Родионова И др., 1977). Внеклеточная /-глюкозидаза A S.thermophile действует только на арильные производные глюкозидов, в отличие от формы В, которая обладает и целлобиазной активностью (Mayer, Canaves-cini, 1981). Внутриклеточная /2-глюкозидаза того же гриба расщепляет дисахариды с разными типами В -глюкозидных связей и проявляет слабую арил-/-глюкозидазную активность. В фильтрате культуральной жидкости гриба T.aurantiacus обнаружены цел-лобиаза и арил-уэ-глюкозидаза, которая обладала также небольшой целлобиазной активностью ( Shepherd et al., 1981). Позиционная изомерия субстрата не является критичной для действия р -глюкозидаз. Они расщепляют/ -1,2, /3-1,3, j -1,4 и /-1,6 связи. Например, в -глгакозидаза G.candidum расщепляет преимущественно /-1,4, а затем /-1,3 и /-1,6 связи (Козловская, 1980). Слабо действует на /-1,2 и не действует на & -1,1 связи. Фермент не расщепляет также лактозу, которая состоит из /-1,4 связанных остатков глюкозы и галактозы. Внутриклеточная /-глюкозидаза s.thermophile предпочитает /-1,3 связи по сравнению с /-1,2 и /-1,4 связями. Внеклеточная /-глюкозидаза В лучше действует на целлобиозу (/-1,4) и ламина-рибиозу (/-1,3) и в два раза слабее на софорозу (/ -1,2) ( Meyer, Ganavescini, 1981). /-Глюкозидаза A.phoenicis также гидролизует преимущественно /-1,4 глюкозидные связи ( Sternberg et al., 1977). Фермент значительно хуже расщепляет /-1,1, /-1,6 и /-1,3 связи. Софороза является плохим субстратом. Диса-хариды с /-1,2 и /-1,3 связями являются лучшими субстратами ДЛЯ /-ГЛЮКОЗИДаз A.fumigatus, R.trifolii, T.koningii (Rudick Elbein, 1973; Abe, Higashi, 1982; Wood et al., 1982). p -Глюкозидазы B.theobromae, A.niger, S.rolfsii, S.pulve-rulentum, T.reesei, S.thermophile, T.aurantiacus, T.koningii, IG1 Monilia sp., N.crassa, H.insolent, P.funiculosum имеют более высокое сродство к пНФГ, чем к целлобиозе ( Umezuri-ke, 1971, Berghem, Pettersson, 1974; Desphande et al., 1978; Yoshioka, Hayashida, 1980; Dekker, 1981; Shewale, Sadana, 1981; Meyer, Canavascini, 1981; Sheperd et al., 1981; Wood et al., 1982; Parr, 1983). Ферменты ИЗ A.wentii, G.candidum, T.reesei, A.oryzae, T.aurantiacus, A.phoenicis, A.terreus имеют Km для пНФГ выше или равное для целлобиозы (таблица 5).
Физико-химические свойства и оптимальные условия гидролиза субстратов глюкозидазами A.terreus
Ранее Ивановой с соавторами было показано, что гриб Aspergillus terreus при росте на среде с березовыми опилками секре-тирует две р -глюкозидазы и, по меньшей мере, три эндоглюканазы (целлюлазы) (Иванова и др., 1983). Авторами была разработана более простая, чем известные для целлюлолитических ферментов из других продуцентов, схема очистки /2-глюкозидаз и эндоглюканаз.
В связи с этим изучение множественных молекулярных форм р --глюкозидаз, их биосинтеза и секреции грибом A.terreus стало реальным и явилось целью данной диссертационной работы. Пяан диссертационной работы включал: 1) изучение качественного состава р -глюкозидаз при конститутивном и индуцированном различными соединениями биосинтезе ферментов; 2) сравнительную физико-химическую и энзимологическую характеристику ферментов; 3) количественную оценку влияния структуры индуктора (субстрата) и времени культивирования на биосинтез и секрецию как в целом целлюлаз и в-глюкозидаз, так и отдельных форм J5 -глюкозидаз. В качестве индукторов (субстратов) в работе были использованы авицел, аморфная целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, целло-биоза, хлопковый линт и березовые опилки. Главным условием для решения всех поставленных в работе вопросов являлось наличие схемы очистки /0-глюкозидаз, удовлетворяющей следующим требованиям: 1. для определения качественного состава уЗ-глюкозидаз и их свойств - быстрота, эффективность, высокий выход и ограниченное количество всех используемых приемов, то есть пригодность схемы для многократного выделения ферментов на разные сроки культивиро вания гриба при индукции 0-глюкозидаз различными соединениями; 2. для количественной оценки уровня синтезированных и секре тированных Ь-глюкозидаз - полнота сорбции и десорбции ферментов и использование в качестве начальной стадии очистки метода, поз воляющего полностью удалять ингибирующие &-глюкозидазы соединения, наличие которых было показано ранее при выращивании гриба A.ter-reus на березовых опилках (Иванова и др., 1983). Ранее опубликованная схема очистки ферментов не полностью удовлетворяла вышеуказанным требованиям (Иванова и др., 1983). Низкие скорости хроматографической очистки, значительные потери ферментов и необходимость использования не менее двух стадий для полного удаления ингибирующих (Ь -глюкозидазы соединений обусловили необходимость разработки новой удовлетворяющей вышеуказанным требованиям схемы очистки. Внеклеточные, внутриклеточные и связанные с клеточной стенкой р-глюкозидазы при конститутивном и индуцированном их синтезе выделяли из выращенного в течение различного времени гриба A.terreus по схеме очистки, включающей хроматографию и рехрома-тографию на неполисахаридном карбоксильном катионите биокарбе Д и рециркуляционную гельфильтрацию на сефарозе 4В. В качестве типичного примера в таблице 8 суммированы данные по очистке & -глюкозидаз из 10 л фильтрата культуральной жидкости и гомогената 515 г мицелия гриба A.terreus , выращенного в течение 84 часов на среде, содер?кащей в качестве источника углевода 1% авицела. В качестве первой стадии использовали хроматографию на мак-росетчатом карбоксильном катионите биокарбе Д. Исходные пробы (рН 4,0 и электропроводность 20-25 ras) пропускали через колонку (5x25 см) с сорбентом со скоростью 2 л/ч. После нанесения, сорбент промывали їїа-ацетатшм буфером (рН 4,5, электропроводность 35 mS) до полного удаления балластного белка в данных условиях. Элюциго ферментов проводили 2 М раствором ацетата на со скоростью 500 мл/ч (рис.1). Цель данного этапа очистки - концентрирование большого объема раствора ферментов и отделение значительного количества балластных белков, в том числе и ингибиторов у#-глюкози-даз. При этом увеличивалась /3-глюкозидазная активность. Второй стадией очистки являлась рехроматография на колонке (5x10) с катионитом биокарбом Д. Растворы ферментов объемом 450-550 мл наносили при описанных выше условиях (см. стадия I). Сорбент промывали їїа-ацетатным буфером (рН 4,7 и электропроводность 39 mS). Элюцию ферментов проводили возрастающим, линейным градиентом рН и ионной силы (I л исходного буфера - I л I М ацетата натрия). Активность /2-глюкозидаз разделялась на два пика (рис.2). Элюаты содержащие р -глюкозидазу I ( объем 30-35 мл) или р-глюкозидазу П (20-25 мл), концентрировали на мембране иМ-2 до объемов 2-3 мл. Последующая трехкратная рециркуляционная гельфильтрация на колонке (2x90 см) с сефарозой 4В, уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,5 с 0,1 М їїаСІ, позволила полностью разделить обе формы ферментов и отделить примеси балластных белков (рис.2). В результате были получены 20-40 мл электрофоретически гомогенных препаратов /9-глюкозидаз с выходом по активности 50%.
