Метаболические и сигнальные пути, контролирующие секрецию инсулина бета-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, и их роль в норме и при сахарном диабете Шаройко, Владимир Владимирович

Содержание к диссертации

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 10

ВВЕДЕНИЕ 14

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 25

1. Сахарный диабет 25

2. Молекулярные механизмы секреции инсулина 28

3. Метаболизм пирувата в (3-клетках 36

4. Роль фактора трансляции митохондрии 1 В в секреции

инсулина 39

5. Роль фактора транскрипции 1а, индуцируемого гипоксией, в секреции инсулина 42

6. Имидазолиновые соединения 44

7. Провоспалительные цитокины и их эффект на р-клетки 49

8. Белок GAS6 и его рецепторы 51

9. Заключение 55

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57

2.1. Материалы исследования 57

1. Реактивы 57

2. Антитела 59

3. Плазмиды 59

4. siPHK 60

5. Олигонуклеотиды и пробы 61

6. Островки Лангерганса человека 64

7. Базы данных 65

8. Модели животных и их островки Лангерганса 66

9. Клеточные линии 68

2.2. Методы исследования 69

2.2.1. Изолирование островков Лангерганса поджелудочной

железы 69

2. Ведение клеточных линий 70

3. Измерение секреции инсулина 70

4. Измерение высвобождения арахидоновой кислоты 72

5. Выделение фракции митохондрий р-клеток 73

6. Выделение фракции ядер Р-клеток 74

6. Выделение и очистка РНК 75

7. Обратная транскрипция 76

8. Полимеразная цепная реакция 77

9. Секвенирование 77

10. ДНК-микрочип анализ 78

11. Общее содержание мтДНК 79

12. Генотипирование 80

13. Анализ специфического связывания HIF-la с ДНК 80

14. Иммуноблот-анализ 82

15. Иммуноцитохимический анализ 82

16. Протеомный анализ 83

17. Получение компетентных клеток Е. coli 86

18. Получение плазмид 87

19. Трансформация Е. coli 88

20. Выделение и очистка плазмидной ДНК 88

21. Трансфекция плазмид 89

22. Трансфекция siPHK 89

23. Измерение скорости утилизации глюкозы 90

24. Измерение скорости транспорта глюкозы 91

25. Измерение активности комплексов I, II, III и IV электронотранспортной цепи 92

26. Измерение активности АТФ-синтазы 96

27. Измерение скорости потребления кислорода Р-клетками 97

28. Измерение концентрации и кинетики накопления АТФ 98

29. Измерение концентрации лактата 99

30. Измерение активности цитратсинтазы 100

31. Измерение активности пируватдегидрогеназы 101

32. Измерение концентрации NADPH и NADP⁺ 103

33. Газовая хроматография и масс-спектрометрия. Метаболомикс 104

34. Десенситизация 105

35. Индукция гибели Р-клеток 106

36. Измерение выживаемости р-клеток 106

37. Измерение апоптоза (TUNEL) 107

38. Измерение концентрации N0₂" -ионов 109

39. Измерение активности каспаз ПО

40. In vitro анализ активности киназ 111

41. Измерение концентрации HbA]_C Ill

42. Измерение концентрации белка 112

43. Интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе 112

44. Интраперитонеальный тест толерантности к инсулину 113

45. Пероральный тест толерантности к глюкозе 114

46. Измерение цитоплазматического трансмембранного потенциала 114

47. Измерение митохондриального трансмембранного

потенциала 115

48. Морфологический анализ островков Лангерганса 116

49. Приготовление экстракта лишайника рода Cladonia 117

50. Статистическая обработка результатов 118

51. Заключение 120

ГЛАВА 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ
ГЛЮКОЗОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И ГЛЮКОЗОНЕЧУВСТВИТЕЛЬ-
НЫХ КЛОНАЛЬНЫХ р-КЛЕТОК 123

1. Секреция инсулина 124

2. Утилизация глюкозы 125

3. Продукция лактата 126

4. Скорость потребления кислорода 128

5. Общее содержание АТФ и скорость продукции АТФ митохондриями 128

6. Активность комплексов ЭТЦ 130

7. Содержание субъединиц комплексов ЭТЦ 131

8. Плазматический и митохондриальный

мембранный потенциалы 133

3.9. Анализ экспрессии генов энергетического метаболизма

в клональных р-клетках 832/13 135

3.10. Взаимосвязь экспрессии генов энергетического метаболизма в
островках Лангерганса людей с уровнем гликозилированного
гемоглобина 137

3.11. Обсуждение результатов 138

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПОНИЖЕННОЙ ЧУВСТВИ
ТЕЛЬНОСТИ Р-КЛЕТОК К ГЛЮКОЗЕ 148

9. Метаболомикс клональных Р-клеток 832/13 и 832/2 148

10. Скорость потребления кислорода в клональных Р-клетках

832/13 и 832/2 156

4.3. Содержание пируваткарбоксилазы в клональных р-клетках

832/13 и 832/2 157

4. Секреция инсулина в клональных р-клетках 832/13 и 832/2 158

5. Профиль метаболитов в клональных Р-клетках INS-1 и 832/1 158

6. Функциональный анализ клональных Р-клеток INS-1 и 832/1 160

7. Транспорт глюкозы в клональных р-клетках 161

8. Стабилизация HIF-la в клональных р-клетках 161

9. Ингибирование ЛДГ-А в клональных р-клетках 832/2 163

10. Транскриптомный и функциональный анализ островков Лангерганса человека 164

11. Обсуждение результатов 168

ГЛАВА 5. ИЗМЕНЕНИЕ ПРОФИЛЯ МЕТАБОЛИТОВ ВО ВРЕМЕНИ
ПРИ СТИМУЛЯЦИИ р-КЛЕТОК ГЛЮКОЗОЙ 172

1. Перфузия клональных р-клеток 832/13 172

2. Метаболомикс клональных Р-клеток 832/13 173

3. Измерение концентраций NADPH и NAPD⁺ в клональных р-клетках 832/13 175

4. Секреция инсулина клональными Р-клетками 832/13 177

5. Функциональный анализ островков Лангерганса крыс 178

7
5.6. Обсуждение результатов 178

ГЛАВА 6. ПРОЛОНГИРОВАННЫЙ ЭФФЕКТ ГЛЮКОЗЫ В
ПОВЫШЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ И ТНФ-а НА р-КЛЕТКИ 186

6. Эффект глюкозы на секрецию инсулина и экспрессию генов энергетического метаболизма в клональных р-клетках 832/13 186

7. Подавление экспрессии PDK1 и активность пируватдегидрогеназы в клональных Р-клетках 832/13 190

3. Секреция инсулина при подавлении экспрессии PDK1 в клональных Р-клетках 832/13 191

4. Метаболомикс клональных Р-клеток 832/13 192

5. Скорость потребления кислорода в клональных Р-клетках

832/13 194

6. Эффект ТНФ-а на метаболизм в клональных р-клетках 832/13 196

7. Эффект ТНФ-а на островки Лангерганса человека 199

8. Обсуждение результатов 201

ГЛАВА 7. ФАКТОР ТРАНСЛЯЦИИ МИТОХОНДРИИ Bl (TFB1M) В р-
КЛЕТКАХ И ЕГО РОЛЬ В РАЗВИТИИ СД2 206

1. TFB1M в островках Лангерганса человека 206

2. TFB1M в островках Лангерганса мышей 208

3. TFB1M в клональных р-клетках 832/13 211

4. Кондиционный нокаут TFB1M в р-клетках островков Лангерганса мышей 215

5. Обсуждение результатов 222

ГЛАВА 8. ЭФФЕКТЫ НЕКОТОРЫХ КЛАССОВ СОЕДИНЕНИЙ НА
СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА р-КЛЕТКАМИ И МЕХАНИЗМЫ ИХ
ИНСУЛИНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ 228

6. Эффект ВЫ 1282 на секрецию инсулина островками Лангерганса мышей и крыс 229

7. Протеомный анализ островков Лангерганса крыс после пролонгированного воздействия ВЫ 1282 231

8. Эффект пролонгированного воздействия ВЫ 1282 на продукцию. АТФ митохондриями островковЛангерганса крыс 235

4. Мишени воздействия ВЫ 1282 в атональных р-клетках 832/13 и MIN6 островках Лангерганса 237

5. ВЫ1282 и сигнальный путь ГПП-1 242

6. ВЫ 1282 и сигнальный путь арахидоновой кислоты 246

7. Эффект экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia на . секрецию инсулина и механизм его инсулинотропного

действия в клональных Р-клетках 832/13 251

8.8. Обсуждение результатов 255

ГЛАВА 9. СНИЖЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ НА р-КЛЕТКИ ОСТРОВКОВ
ЛАНГЕРГАНСА МЫШЕЙ 261

1. Сочетанное воздействие цитокинов и RX871024 на Р-клетки 261

2. Роль SOCS-1 в повышении устойчивости Р-клеток островков Лангерганса мышей к действию цитокинов 266

3. Обсуждение результатов 270

ГЛАВА 10. БЕЛОК GAS6 И ЕГО РЕЦЕПТОР AXL: ЭКСПРЕССИЯ И
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ В КЛОНАЛЬНЫХ В-КЛЕТКАХ И
ОСТРОВКАХ ЛАНГЕРГАНСА 277

4. Экспрессия GAS6/AXL в клональных р-клетках и островках Лангерганса 277

5. ОА86-индуцированная передача сигнала в клональных Р-клетках 832/13 282

3. Эффект GAS6/AXL на клональные Р-клетки 832/13 285

4. Эффект GAS6/AXL на островки Лангерганса человека 285

5. Обсуждение результатов 286

ГЛАВА 11. ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ 289

ВЫВОДЫ 294

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 297

ПРИЛОЖЕНИЯ 323-340

10 ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АЦ - аденилатциклаза

АДФ - аденозин 5'-дифосфат

АТФ - аденозин 5'-трифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГПП-1 - глюкагоноподобный пептид 1

ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия

ДАГ - диацилглицерол

ИМТ - индекс массы тела

ИФ₃ — инозитол 1,4,5-трифосфат

Кдтф - АТФ-зависимый калиевый канал

КРББ - бикарбонатный буфер Кребса-Рингера

мтДЬЖ — митохондриальная ДНК

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СД1 - сахарный диабет первого типа

СД2 - сахарный диабет второго типа

ФИФ₂ - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

цАМФ - аденозин 3',5'-циклический монофосфат

ЭТЦ - электронотранспортная цепь

яДНК - ядерная ДНК

[Са²⁺]і - внутриклеточная концентрация ионов кальция

ВЫ 1282 - (5-хлор-3-(4,5-дигидро-1Н-имидазол-2-ил)-2-метилиндола

гидрохлорид

(Х-КІС - альфа-кетоизокапроновая кислота

AXL - рецептор семейства тирозинкиназ белка GAS6

DMEM - среда Игла в модификации Дюлбекко

EBSS - сбалансированный солевой раствор Игла

FCCP - карбонил цианид-пара-трифторметоксифенилгидразон

EGFP - enhanced green fluorescent protein

ERK1/2 МАРК - митогенактивированная протеинкиназа, регулируемая

внеклеточными сигналами

GAS6 - growth arrest-specific protein 6, ростозамедляющий белок 6

GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

GRP78 - глюкозорегулируемый белок 78

GWAS - a genome-wide association study

К_Са - кальций-зависимый калиевый канал

CHAPS - 3-3-[(3-холамидопропил)-диметиламмонио]-1-пропан сульфонат

cPLA₂ - кальций-зависимая фосфолипаза А₂

СРТ1 - карнитинпальмитоилтрансфераза 1

GEFII - цАМР-регулируемый фактор II обмена гуаниновых нуклеотидов

ИФ-у - интерферон-у

ИЛ-ір - интерлейкин-1р

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

II - инсулиногенный индекс (insulinogenic index)

ISI - индекс инсулиночувствительности (insulin sensitivity index)

JAK - тирозинкиназа семейства Янус-киназ

JNK - c-Jun N-терминальная киназа

iPLA₂ - кальций-независимая фосфолипаза А₂

IPGTT - интраперитонеальный тест толерантности к глюкозе

HbAic - гликозилированный гемоглобин

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

HIF-la -фактор la, индуцированный гипоксией

HRE - HIF-la responsive element

HPRT — гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза

MALDI - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация

МАРК - митогенактивированные протеинкиназы

NADH/NAD⁺ - никотинамидаденидинуклеотид

NADPH/ NADP⁺- никотинамидаденидинуклеотид-фосфат

OGTT - пероральный тест толерантности к глюкозе

OPLS-DA - дискриминационный анализ разложения ортогональных проекций на

латентные структуры

OR - odds ratio

OXPHOS - окислительное фосфорилирование

р38 МАРК - митогенактивированная протеинкиназа р38

PC - пируваткарбоксилаза

РСА - метод главных компонент

PDC - пируватдегидрогеназный комплекс

PDK1 - киназа пируватдегидрогеназы 1

PHD - пролилгидроксилаза

РКА - протеинкиназа А

РКС - протеинкиназа С

PMPI - plasma membrane potential indicator

Rab3 - ГТФ-связывающий белок

Rim2 - белок, взаимодействующий с Rab3

rPL30 - рибосомальный белок L30

siRNA - малые интерферирующие РНК

SNAP25 - синаптосома-ассоциированный белок 25

SNP - однонуклеотидый полиморфизм (single nucleotide polymorphism)

SOCS-1 - супрессор цитокинового сигнального пути 1

SUR1 -рецептор сульфонилмочевины (субъединица калиевого канала)

STAT1 - переносчик сигнала и активатор транскрипции

T2D - сахарный диабет второго типа

TFAM - транскрипционный фактор митохондрии А

TFB1M - транскрипционный/трансляционный фактор митохондрии В1

TFB2M - транскрипционный фактор митохондрии В2

TLR - toll-like receptor

TMRE — тетраметилродамин

ФНО-а - фактор некроза опухоли а

TUNEL - TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling

Введение к работе

Актуальность проблемы. По определению Международной Диабетической Федерации, сахарный диабет (СД) характеризуется как эпидемия. Предполагаемый показатель распространенности этого заболевания к 2025 году может составить около 330 миллионов человек [1]. Уже сегодня СД является большой медицинской и социально-экономической проблемой общества [2]. 10-15% от общего числа больных СД.составляют люди, страдающие СД первого типа (СД1), тогда как остальная часть приходится на СД второго типа (СД2) [1]: СД1 связан с прогрессивной деструкцией Р-клеток в результате аутоиммунных процессов в островках Лангерганса поджелудочной железы, индуцированных макрофагами и Т-лимфоцитами [3, 4]. Провоспалительные цитокины, в особенности интерлейкин-ір (ИЛ-1р), фактор- некроза опухоли-а (ФНО-а) и интерферон-у (ИФ-у), играют важную роль в патогенезе СД1, вызывая некротическую или апоптотическую гибель р-клеток островков Лангерганса [5].

СД2 является метаболическим заболеванием, в патогенезе которого выделяют два главных компонента: инсулинорезистентность периферических тканей и снижение секреции инсулина Р-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Установлено, что генетические- факторы и факторы внешней среды вовлечены в патогенез СД2 [6]. При действии этих факторов Р-клетки островков Лангерганса не способны компенсировать повышение концентрации глюкозы в крови адекватным увеличением секреции инсулина [7], приводя к развитию гипергликемии и других метаболических нарушений. Подавление инсулиносекреторной функции р-клеток является признаком СД2 и рассматривается как один из вероятных механизмов снижения толерантности инсулинозависимых тканей к глюкозе [8-11]. При СД гипергликемия и воздействие провоспалительных цитокинов вызывают дефицит инсулина как минимум по двум механизмам: снижение секреции инсулина и уменьшение популяции Р-клеток в результате индукции апоптоза или некроза [12]. В связи с этим, разработка стратегии протекции р-клеток в отношении цитотоксического пролонгированного действия глюкозы в повышенной концентрации и провоспалительных цитокинов заслуживает особого внимания.

Глюкоза - главный физиологический стимул секреции инсулина р-клетками. В норме, повышение её концентрации в крови приводит к активации транспорта глюкозы в р-клетки. Последующий метаболизм глюкозы генерирует метаболические и сигнальные каскады реакций, которые вызывают секрецию инсулина по двум основным механизмам: инициирующий и амплифицирующий [13]. Первый из них запускается путем закрытия АТФ-зависимых К⁺-каналов вследствие увеличения отношения [АТФ] к [АДФ] в результате метаболизма глюкозы. При закрытии К⁺-каналов клеточная мембрана деполяризуется, приводя к открытию потенциалзависимых Са²⁺-каналов L-типа. Последующее увеличение внутриклеточной* концентрации ионов Са²⁺ запускает экзоцитоз инсулина. Инициирующий механизм изучен достаточно хорошо [Г4], тогда как амплифицирующий механизм секреции инсулина изучен недостаточно. Более того, остаются до конца невыясненными особенности генной и метаболической регуляции секреции инсулина, а также полиморфных модификаций генов, изменения уровней метаболитов, вторичных посредников, активности трансляционных и транскрипционных факторов в этом процессе.

Для лечения пациентов с СД2 используется широкий спектр фармакологических препаратов с различным механизмом действия, направленных на улучшение гомеостаза глюкозы. В течение многих лет препараты сульфонилмочевины, мишенью воздействия которых являются р-клетки, доминируют на фармацевтическом рынке [15, 16]. Недостатком препаратов этого класса являются эпизоды гипогликемии [17, 18] и стимуляция апоптоза р-клеток [19]. Кроме того, большинство пациентов, получающих лечение производными сульфонилмочевины в течение 3-10 лет, становятся нечувствительными к данному классу препаратов [20]. В этой связи представляют интерес новые классы соединений, синтезированные химическим путем или биологически активные соединения природного происхождения, обладающие глюкозонормализующим эффектом и пониженной токсичностью.

Таким образом, независимо от инициирующих факторов, на начальных и последующих этапах развития СД, в островках Лангерганса наблюдается деструкция и прогрессирующее уменьшение количества Р-клеток вплоть до полного их исчезновения и развития абсолютной инсулиновой недостаточности при СД1-, так и при СД2 [21-23], поэтому перспективным направлением в лечении СД1 является разработка методов сохранения имеющихся Р-клеток на ранней стадии заболевания, а при СД2 - на всех стадиях заболевания. В данной работе обобщены результаты цикла исследований, направленных на выяснение физиолого-биохимических механизмов функционирования Р-клеток в норме и при патологии, результаты которых могут быть использованы при разработке фармакологических и молекулярно-генетических. методов протекции р-клеток не только для предотвращения развития СД, но и уже при развившемся СД.

Цель и задачи исследования

Цель работы. Изучение метаболических и сигнальных путей, участвующих в секреции инсулина Р-клетками островков Лангерганса в норме и при патологии с целью разработки стратегии воздействия на эти пути с помощью фармакологических и молекулярно-генетических методов для нормализации функциональной активности этих клеток.

В ходе исследования решались следующие основные задачи

Разработать экспериментальную модель для исследования механизмов секреции инсулина р-клетками в условиях in vitro.

Используя разработанную модель, изучить особенности метаболизма в р-клетках с нормальной и сниженной секрецией инсулина in vitro.

Изучить эффект глюкозы в повышенной концентрации и цитокинов на метаболизм и секрецию инсулина в Р-клетках in vitro.

Исследовать изменение профиля метаболитов и сигнальных молекул в Р-клетках при стимуляции их глюкозой in vitro.

Выявить полиморфизм генов, связанных с функционированием митохондрий в Р-клетках и риском развития СД2.

Изучить сигнальные пути инсулинотропного действия некоторых имидазолиновых соединений и некоторых классов биологически активных соединений природного происхождения в Р-клетках.

Исследовать протективные свойства некоторых имидазолиновых соединений и супрессора цитокинового сигнального пути 1 в отношении цитотоксического действия провоспалительных цитокинов на р-клетки.

8. Изучить роль в секреции инсулина ряда белковых молекул, которые в р~ клетках ранее не исследовались.

Научная новизна исследования

Проведенное исследование впервые показало, что одним из механизмов снижения чувствительности к глюкозе клональных Р-клеток является стабилизация (т.е. ингибирование протеосомальной деградации) транскрипционного фактора HIF-la (фактора la, индуцированного гипоксией). В этих клетках HIF-la вызывает нарушение метаболизма глюкозы за счет разобщения гликолиза и метаболизма пирувата в митохондриях, которое приводит к подавлению глюкозостимулированной секреции инсулина.

Известно, что при СД2 наблюдается гипергликемия и повышение в крови концентрации ФНО-а, которые участвуют в развитии осложнений СД2 и в том числе снижают инсулиносекреторную активность Р-клеток. Впервые на модели клональных р-клеток и островках Лангерганса человека in vitro установлено, что пролонгированное воздействие глюкозы или ФНО-а в повышенной концентрации приводит к стабилизации HIF-la и, соответственно, к снижению глюкозостимулированной секреции инсулина. При этом обнаружено HIF-la-контролируемое ингибирование метаболизма пирувата в^ реакциях пируватдегидрогеназного комплекса и активация анаэробного гликолиза. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизмов снижения чувствительности Р-клеток к глюкозе при прогрессировании СД2.

При пролонгированном действии глюкозы в повышенной концентрации на р-клетки возрастает экспрессия гена-мишени HIF-la - Pdkl и его белкового продукта - киназы 1 пируватдегидрогеназы (PDK1). Показано, что выключение PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина клональными Р-клетками за счет увеличения митохондриального метаболизма пирувата, дыхания и продукции АТФ митохондриями.

Установлено, что пентозофосфатный цикл участвует в амплифицирующем механизме секреции инсулина р-клетками и в островках Лангерганса человека за счет синтеза NADPH, выступающего в этом процессе в качестве сигнальной молекулы, играющей важную роль в экзоцитозе инсулина.

Используя базу данных полногеномных исследований GWAS (а genome-wide association study) установлено, что полиморфизм гена (rs950994; G—>А) фактора трансляции митохондрии Bl (TFB1M; митохондриальная S-аденозилметионин-б-К,К-аденозил(рРНК)диметилтрансфераза-1) ассоциируется со снижением секреции инсулина, повышением постпрандиального уровня глюкозы и риском развития СД2. Установлен механизм, посредством которого ослабление общей трансляции в митохондриях р-клеток за счет снижения диметилирования 12S рРНК приводит к снижению продукции АТФ в митохондриях и подавлению секреции инсулина.

Изучены некоторые биохимические механизмы действия имидазолинового соединения ВЫ 1282, обладающего выраженным инсулинотропным' эффектом. ВЫ 1282 потенцирует секрецию инсулина путем воздействия на сигнальный путь: АТФ => цАМФ+ОЕИТШпй (СЕИ1-Шт2-цАМФ-активируемый белковый комплекс, участвующий в экзоцитозе инсулина) => 4AMXD-GEFH-Rim2, контролируемый аденилатциклазой и сигнальный путь: фосфолипид => арахидоновая кислота => эпоксиэйкозатриеновая кислота, контролируемый кальций-независимой фосфолипазой А2 (iPLA₂) и цитохромом Р450.

Обнаружены протективные свойства имидазолина RX871024 (уменьшение продукции NO) и SOCS-1 (снижение активности каспаз и апоптоза), частично снижающие цитотоксическое -действие провоспалительных цитокинов на р-клетки.

Идентифицированы белок GAS 6 и его рецептор AXL в р-клетках и показана их функциональная роль в Р-клетках, заключающаяся в контроле секреции инсулина и синтеза ФНО-а. Установлен один из механизмов внутриклеточной передачи сигнала - в р-клетках при действии GAS 6: GAS 6 => аутофосфорилирование AXL => фосфорилирование Р13-киназы => фосфорилирование Akt => => фосфорилирование GAPDH и GRP78=> => эффекторные системы.

Усовершенствована модель субстратно-энзиматических и сигнальных процессов, объясняющая регуляцию секреции инсулина р-клетками.

Научно-практическое значение работы

Данное исследование относится к разряду фундаментально-прикладных работ. Применяя вышеперечисленные подходы (модели) нам удалось получить новую информацию о некоторых механизмах функционирования Р-клеток в норме и патологии, выявить новые белки, являющиеся потенциальными мишенями для фармакологического или молекулярно-генетического воздействия, а также предложить способы коррекции функциональных нарушений р-клеток при СД. Полученные результаты углубляют представления о фундаментальных молекулярных механизмах, лежащих в основе регуляции секреции инсулина под действием глюкозы, инсулинотропных. соединений класса имидазолинов (на примере BL11282 и RX871024) и- биологически активных веществах растительного происхождения (на примере экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia). Данная информация может быть полезна при разработке новых способов управления функциональной активностью' р-клеток и^ коррекции метаболических нарушений при СД2. На использование экстракта из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат "Ягель") в коррекции метаболических нарушений при СД2 подана заявка на патент РФ.

Изучение имидазолиновых соединений продемонстрировало возможность использования имидазолинов в качестве инструмента для изучения путей передачи сигнала в Р-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, и перспективность дальнейшего комплексного исследования имидазолинов с целью разработки фармацевтических препаратов для лечения СД2.

Ингибирование PDK1 усиливает глюкозостимулированную секрецию инсулина, в р-клетках, поэтому создание- селективных ингибиторов данного фермента может рассматриваться как. одно - из направлений фармакологической терапии СД2 при секреторной дисфункции р-клеток.

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза СД2, а также в создании новых подходов для диагностики. Исследование ведущей роли трансляционного фактора TFB1M в механизме секреции инсулина показало, что он является важным компонентом в патогенезе СД2, связанным с нарушением функционирования митохондрий.

Генотипирование полиморфизма (rs950994) гена TFB1M внедрено в панель генов-риска для диагностики предрасположенности к развитию СД2. Полученная информация позволяет проводить анализ нарушений отдельных звеньев в механизме секреции инсулина, связанных с дисфункцией митохондрий.

В качестве in vitro модели для изучения механизмов секреции инсулина в норме и при патологии предложены постоянные клеточные линии глюкозочувствительных и глюкозонечувствительных р-клеток.

Показано; что экстракт из слоевищ лишайника рода Cladonia (препарат "Ягель") стимулирует глюкозозависимую секрецию инсулина in vitro и обладает глюкозонормализующим» действием у пациентов, страдающих СД2.

Результаты, исследований используются автором при чтении лекций для студентов биологических и медицинских специальностей.

Личный вклад автора. Работа выполнена на базе следующих научно-исследовательских учреждений: Лаборатория Экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН (г. Якутск, РФ), Центр исследований диабета и эндокринологии им. Рольфа Люфта Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция), Лаборатория молекулярного метаболизма' центра исследований диабета Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция). Экспериментальные данные получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии. Планирование и проведение экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов и написание статей осуществлялось самим автором, либо при его активном участии. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Метаболомный анализ р-клеток проводился совместно с Петером Шпегелем и Хиндриком Мульдером. Протеомный анализ островков и Р-клеток проводилась в тесном взаимодействии с Томасом Коком и Терезой Ягербринк. LS/MS-MS и MALDI-trap анализ пептидов выполнялся в центре протеомных исследований Лундского университета. Генотипирование производилось в лаборатории центра секвенирования Лундского университета. Анализ данных из GWAS проводился совместно с Валерией Лысенко и Шарлот Линг. Исследование апоптоза осуществлялось совместно с Ириной Зайцевой, Иохимом Сторлингом и Сергеем Зайцевым. Отдельные этапы работы проводились совместно с Борисом Кершенгольцем.

Основные положения, выносимые на защиту

Разобщение аэробного гликолиза и митохондриального метаболизма пирувата играет ведущую роль в прогрессировании инсулиносекреторной дисфункции Р-клеток.

Пролонгированное действие глюкозы в повышенной концентрации и фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) на Р-клетки вызывают стабилизацию фактора, индуцированного гипоксией-1 a (HLF-la), приводя к снижению чувствительности р-клеток к глюкозе.

Пентозофосфатный цикл, в ходе которого генерируется NADPH, вовлечен в амплифицирующий механизм секреции инсулина р-клетками.

Полиморфизм G—>А гена фактора трансляции митохондрии Bl (tfblm; rs950994) ассоциируется с дефектом секреции инсулина и с риском развития СД2.

Инсулинотропное действие имидазолинового соединения ВЫ 1282 опосредовано цАМФ-зависимым механизмом, взаимодействием цАМФ с комплексом GEFII^eRim2 и метаболизмом арахидоновой кислоты в эпоксиэйкозатриеновые кислоты. Кроме того, ВЫ 1282 повышает чувствительность (3-клеток к глюкозе.

Имидазолиновое соединение RX871024 и ингибитор внутриклеточной передачи сигнала цитокинов-1 (SOCS-1) снижают цитотоксическое действие провоспалительных цитокинов.

Белок "growth arrest-specific protein" (GAS6) и его рецептор AXL синтезируются в Р-клетках. Подавление экспрессии рецептора AXL снижает секрецию инсулина.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах кафедры биологической химии Северо-Восточного федерального университета им. М.К. Аммосова (г. Якутск), Лаборатории экологической и медицинской биохимии, биотехнологии и радиобиологии Института биологических проблем криолитозоны СО РАН, Лаборатории молекулярного метаболизма Лундского университета (г. Лунд, г. Мальмо, Швеция), Лаборатории диабета и эндокринологии Каролинского медицинского университета (г. Стокгольм, Швеция).

Отдельные аспекты работы были представлены на следующих международных конференциях: "European Association for the Study of Diabetes" (Rom, Italy, 2008; Vienna, Austria, 2009; Stockholm, Sweden, 2010; Lisbon, Portugal, 2011); "Gordon Research Conferences: Molecular & Cellular Bioenergetics" (Andover, USA, 2009); "What's next" (Malmo, Sweden, 2009); "Islet Study Group", (Steinschaler Dorfl, Austria, 2009); "World Diabetes Congress, IDF" (Montreal, Canada 2009); "Scandinavian Society for the Study of Diabetes" (Malmo, Sweden, 2010).

Публикации. Основные результаты исследования, выводы и положения диссертации опубликованы в 30 печатных работах в отечественной и зарубежной печати, из них 16 работ в журналах, рекомендованных-ВАК РФ.

Благодарности. Я выражаю искреннюю благодарность моим прежним и настоящим коллегам вышеуказанных лабораторий, в которых была выполнена диссертационная работа, за сотрудничество, общение, понимание и поддержку. Выражаю особую признательность моим учителям, профессорам Борису Моисеевичу Кершенгольцу и Алле Николаевне Журавской (Институт биологических проблем криолитозоны СО РАН, г. Якутск).

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (РФ), программы Президиума РАН "Фундаментальные науки - медицине" (РФ), фармацевтической компании Ново Нордиск (Дания), Шведского Совета по исследованиям (Швеция), гранты на исследования Stiftelsen Lars Hiertas Minne (Швеция), Albeit Pahlssons stiftelse for forskning och valgorenhet (Швеция), O.E och Edla Johanssons stiftelsen (Швеция), Crafoordska stiftelsen (Швеция).

Похожие диссертации на Метаболические и сигнальные пути, контролирующие секрецию инсулина бета-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, и их роль в норме и при сахарном диабете

Инсулин-транспортирующие системы крови человека в норме и при сахарном диабете первого типа. Теоретические и прикладные аспектыГарипова Маргарита Ивановна

Исследование метаболизма инсулина в эритроцитах крыс в норме и при экспериментальном диабетеНиколаев Сергей Леонидович

Влияние каптоприла на процессы перекисного окисления липидов в норме и при аллоксановом диабете, особенности фармакокинетики препаратаЕременко Наталья Николаевна

Влияние антиокса и коэнзима Q10 на повышение устойчивости панкреатических бета-клеток к цитотоксическому действию аллоксанаЮрина Марина Анатольевна

ИНТЕГРИНЫ БЕТА-2 И БЕТА-6 - НОВЫЕ МАРКЕРЫ АЛЬВЕОЛЯРНЫХ КЛЕТОК ТИПА IIМУХАМЕТШИНА РЕГИНА ТАЛГАТОВНА

Механизмы токсического действия бета-амилоидных пептидов на эритроциты и клетки мозгаCоломадин Илья Николаевич

Механизмы токсического действия бета-амилоидных пептидов на эритроциты и клетки мозгаСоломадин, Илья Николаевич

Роль динитрозильных комплексов железа в защите биомолекул и клеточных структур от окислительного, нитрозативного и карбонильного стрессовШумаев, Константин Борисович

Роль генов метаболизма эстрогенов в развитии рака молочной железы и эндометрия у женщинШаталова Екатерина Геннадьевна

Роль молекулярных маркеров в диагностике и лечении рака молочной железыКозлов Вадим Викторович