Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль эстрогенов в организме в норме и при злокачественных заболеваниях 12
1.1 Биологическая роль эстрогенов в организме 12
1.2 Гормональный канцерогенез... 13
1.2.1 Гормональный канцерогенез: ЭР-опосредованные процессы 14
1.2.2 Гормональный канцерогенез: роль метаболитов эстрогенов 15
1.2.3 Механизм гормонального канцерогенеза 17
ГЛАВА 2. Факторы предрасположенности к злокачественным заболеваниям молочной железы и эндометрия матки 19
2.1 Факторы предрасположенности к раку молочной железы 19
2.1.1 Генетические факторы предрасположенности к РМЖ 19
- Высокопенетрантные генные мутации 19
- Низкопепетраптпые генные мутации 20
2.1.2 Негенетические факторы предрасположенности к РМЖ 23
- Эндогенные факторы 23
- Экзогенные факторы 25
2.2 Факторы предрасположенности к раку эндометрия тела матки 27
2.2.1 Генетические факторы предрасположенности к раку эндометрия тела матки ... 27
2.2.2 Негенетические факторы предрасположенности к раку эндометрия тела матки.29
- Эндогенные факторы 29
- Экзогенные факторы 30
ГЛАВА 3. Ферменты, участвующие в метаболизме эстрогенов 32
3.1 Ферменты окисления , 32
3.1.1 Биологическая роль ферментов окисления 32
3.1.2 Изоформы цитохрома Р450 34
3.2 Ферменты конъюгации 37
3.2.1 Биологическая роль ферментов конъюгации 37
3.2.2 Катехол-О-метилтрансфераза 41
3.2.3 Сульфотрансферазы 43
3.2.3.1 Общая характеристика сульфотрансфераз .43
3.2.3.2 Фенольная сульфотрансфераза (SULT1A1) 45
- Полиморфизм гена SVLT1AI 45
- Функциональное значение аллелей 46
- Эпидемиологические данные 47
3.2.3.3 Эстрогеновая сульфотрансфераза (SULT1E1) 48
3.2.4 УДФ-глюкуронозилтрансферазы 49
3.2.4.1 Общая характеристика УДФ-глюкуронозилтрансфераз 49
3.2.4.2 УДФ-глюкуронозилтрансфераза 51
- Полиморфизм гена UGT1A1 51
- Функциональное значение аллелей 52
Эпидемиологические данные 52
III. Материалы и методы 54
1. Объекты исследования , ,.54
1.1 Рекомбинантиый белок SULTlAl , 54
1.2 Формирование групп больных и здоровых контролей 54
2. Реактивы и оборудование. Методы исследования 55
- Метод определения активности сулъфотрансферазы 1А1 55
- Получение стабильно трансфецированной культуры MCF-7 56
- Определение скорости пролиферации клеток 57
- Выделение ДНК. 58
- Амплификация SULTlAl 58
-Амплификация UGT1A1 , 59
- Пиросеквенирование 59
- ПЦР в реальном времени , 62
3. Статистический анализ 63
VI. Заключение 94
VII. Выводы 95
VIII. Список литературы 96
- Гормональный канцерогенез: роль метаболитов эстрогенов
- Генетические факторы предрасположенности к раку эндометрия тела матки
- Биологическая роль ферментов конъюгации
- Эстрогеновая сульфотрансфераза (SULT1E1)
Введение к работе
В последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной генетики моногенных заболеваний, наследуемых в соответствии с законами Менделя, то есть тех, для которых мутация в определенном гене определяет развитие заболевания. Следующая проблема, которую предстоит решить, заключается в понимании молекулярных и генетических основ полигенных заболеваний человека, возникающих в результате объединенного эффекта нескольких генов. Благодаря прогрессу геномных технологий и завершению проекта «Геном человека» эта проблема может быть решена в ближайшем будущем, что прольет свет па этиологию этих заболеваний и поможет разработке новых методов профилактики и лечения.
Проблема гормонозависимых опухолей у женщин в современной медицине является одной из наиболее актуальных. Повсеместно отмечается неуклонный рост заболеваемости раком молочной железы (РМЖ) и раком эндометрия матки. Так, за последние 20 лет заболеваемость этими новообразованиями увеличилась в среднем в 2 раза как в России, так и в странах Европы и Северной Америки (Максимов С.Ю., 2004). Несмотря на многочисленные физиологические и эпидемиологические исследования, до настоящего времени не сложилось единой концепции механизмов возникновения этих заболеваний. Причиной развития менее 10% злокачественных новообразований молочной железы и эндометрия являются наследственные факторы (Bennett I.C. et al., 1999). В большинстве случаев, однако, совместное действие нескольких факторов риска, как эндогенных, так и экзогенных, обеспечивает возникновение и дальнейшую прогрессию опухоли. Значительное количество данных указывает на взамосвязь особенностей метаболизма эстрогенов и риска возникновения гормонозависимых опухолей (Иванов В.Г., 2002).
В норме, эндогенные эстрогены (эстрои (Е1) и Пр-эстрадиол (Е2), также называемый эстрадиолом) участвуют в регуляции процессов формирования вторичных половых признаков у женщин, контроле менструального цикла и беременности, влияют на состояние кости, кожи, сердечно-сосудистой системы и иммунитета (Tapiero Н. et aL, 2002). Гормональный канцерогенез, индуцированный эстрогенами, бьш убедительно продемонстрирован на лабораторных животных и человеке (Liehr J.G., 2001). Данные, полученные на различных линиях мышей и крыс, свидетельствуют о том, что эстрадиол повышает количество случаев возникновения опухолей молочной железы, гипофиза, эндометрия и шейки матки, лимфоидной системы, кости и других органов (Highman В. et al., 1980; Highman В. et а!., 1981; Huseby R.A., 1980; Inoh A. et al., 1985; Nagasawa H. et al., 1980; Noble RX. et al., 1975; Shull J.D. et al., 1997). У человека длительное воздействие эстрогенов принято рассматривать как фактор риска аденокарциномы эндометрия (Greenwald P. et al., 1977; Key T.J. et al., 1988; Weiderpass E. et al., 1999); также была найдена ассоциация РМЖ и концентрации эстрогенов в плазме крови и моче (Adlercreutz Н. et al., 1994; Toniolo P.G. et al., 1995). Эстрогеносодержащие медикаменты, в свою очередь, вносят свой вклад в увеличение риска РМЖ и рака эндометрия. Хотя данные по исследованию связи между приемом оральных контрацептивов или гормонозаменяющей терапией и частотой возникновения РМЖ противоречивы, исследователи сходятся на том, что гормональные препараты, особенно в случае долгого их применения, негативно сказываются на риске возникновения эстрогенозависимых заболеваний (Colditz G.A., 2005; Иванов В.Г., 2002; Kaaks R. et al., 2002).
Эндогенный синтез эстрогенов у женщин в детородном возрасте обеспечивается яичниками и надпочечниками. В период постменопаузы основными источниками эстрогенов являются жировая клетчатка и кожа (Simpson E.R. et al., 2001). Эстрогены функционируют в гормонозависимых клетках через взаимодействие с эстрогеновым рецептором (ЭР). Гормональньш канцерогенез обусловлен следующими механизмами.
Во-первых, благодаря своей функции стимуляции пролиферации клеток-мишеней, связьшаясь с ЭР и активируя транскрипцию генов-мишеней, эстрогены потенциально способны вызвать увеличение числа спонтанных ошибок в результате репликации ДНК. Стимулируя пролиферацию, эстрогены также могут обеспечить увеличение пула клеток с возникшей, благодаря тому или иному механизму, мутацией. Во-вторых, продукты окисления эстрогенов, катализируемого изоформами цитохрома Р450 (CYP), такие как катехолэстрогены, семихиноны и хиноны, содержат активные формы кислорода и являются электрофильпыми молекулами, которые могут участвовать в повреждении ДНК и образовании ее аддуктов (Cavalieri E.L. et al., 1997; Stack D.E. et al., 1996). По такому механизму метаболиты эстрогенов могут индуцировать мутации, которые, в случае локализации в функционально важной последовательности, становятся причиной развития опухоли (Cavalieri E.L. et al., 1997). Конъюгация эстрогенов с сульфатной и глюкуроновой группами и катехолэстрогепов с метальной, сульфатной и глюкуроновой группами инактивирует эти потенциально канцерогенные молекулы и таким образом защищает клетку от эстроген-опосредованных митоза и мутагенеза (Zhu В.Т. et al., 1998). Окисление эстрогенов катализируется ферментами CYP1A1, CYP1A2, CYP3A4 и CYP1B1. В конъюгации эстрогенов и их окислитенных метаболитов участвуют сульфотрансферазы (SULT) 1А1 и 1Е1, катализирующие присоединение сульфата, и УДФ-глюкуронозилтрансфераза 1А1 (UGT1A1), катализирующий присоединение остатка глюкуроновой кислоты. Фермент катехол-о-метилтрансфераза (СОМТ) катализирует присоединение метильной группы к гидрокси-производным эстрогенов. Гены, кодирующие эти ферменты являются полиморфными, и различные аллели кодируют функционально отличающиеся аллозимы. Эти гены являются, таким образом, потенциально способными обеспечивать различие метаболизма эстрогенов, и, следовательно, возникновение и течение эстрогенозависимых заболеваний, у разных индивидов.
Цель и задачи работы. Цель данной работы - изучение роли генов метаболизма эстрогенов в определении риска и фенотипа рака молочной железы и эндометрия. Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи: анализ способности аллозима SULTIA1*2 присоединять сульфат к молекуле эстрадиола и влиять на пролиферацию клеток карциномы молочной железы в ответ на стимуляцию эстрадиолом; анализ роли полиморфных вариантов генов SULT1A1 и UGT1A1, кодирующих аллозимы с различной активностью, в риске возникновения и фенотипе рака молочной железы и эндометрия в разных этнических группах; сравнение распределений аллелей и генотипов генов SULT1A1 и UGTJA1 у больных раком молочной железы и эндометрия и контрольных женщин в разных этнических группах; сравнение распределений генотипов и групп генотипов полиморфных генов метаболизма эстрогенов (CYP1A1, CYPJA2, CYP3A4, CYP1B1, СОМТ, SULT1AJ, SULT1EJ и UGT1A1) в группах больных раком молочной железы, эндометрия матки и контрольных женщин, и анализ роли этих генотипов в риске возникновения и фенотипе этих заболеваний.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Гормональный канцерогенез: роль метаболитов эстрогенов
Возможность того, что эстрогены напрямую способствуют мутагенезу, химически повреждая ДНК, стала исследоваться недавно. Повреждение ДНК (генотоксичность, (Bershtein L.M., 2000)) является, во-первых, результатом взаимодействия с вновь образованными свободными радикалами. Например, такие метаболиты эстрогенов как катехолэстрогены, к которым относятся 2-гидрокси- и 4-гидроксиэстрадиол (2- и 4-ОНЕ2) и 2-гидрокси- и 4-гидроксиэстрон (2- и 4-ОНЕ1), участвуют в реакциях окисления-восстановления и могут быть обратимо окислены до соответствующих семихиноновых и далее до хиноновых форм (Liehr J.G. et al., 1986; Roy D. et al., 1988). Семихиноны и хипоны могут участвовать в реакциях одно-электронного окисления и восстановления с молекулярным кислородом и формировать кислородные радикалы (Li Y. et al., 1994; Roy D. et al., 1988). В соответствии с этими наблюдениями, различные типы повреждений ДНК, вызванные свободными радикалами, были индуцированы эстрадиолом и/или катехолэстрогенами in vivo, в культурах клеток или в бесклеточных системах (Han X. et al.( 1994; Han X. et al., 1995; Ho S.M. et al., 1994; Li Y. et al., 1994; Mobley J.A. et al., 1999; Nutter L.M. et al., 1991; Nutter L.M. et al., 1994; Wang M.Y. et al., 1995), и катехолэстрогенами, но не исходными гормонами (Han X. et al, 1995). Эти индуцированные свободными радикалами повреждения включают одноцепочечные разрывы ДНК, гидроксилирование гуаниновых оснований по 8 положению (8-гидроксилирование), и формирование ДНК-аддуктов (комплексов ДНК с соответствующим соединением, (Берштеин Л.М., 2000)). Два типа таких модификаций ДНК были обнаружены в эпителии молочной железы пациентов, с диагнозом РМЖ: 8-гидроксилирование гуаниновых оснований и ДНК-аддукты (Malms D.C. et al., 1995; Wang M.etal., 1996).
Ковалентное связывание эстрогеновых хинонов с гуаниновыми и адениновыми основаниями нуклеиновых кислот было также исследовано в бесклеточных системах и in vivo на лабораторных животных, крысах и хомячках (Cavalieri E.L. et al., 1997; Roy D. et al., 1997; Shen L. et al., 1998; Stack D.E. et al., 1996). Было показало, что хиноновые соединения гидроксилированных по 4-подожению эстрогенов образуют нестабильные аддукты с молекулой ДНК, способные распадаться и формировать потенциально мутагенные апуриновые сайты, в то время как 2-гидроксилированные метаболиты эстрогенов образуют стабильные ДНК-аддукты (Cavalieri E.L. et al., 1997). В работах с полициклическими углеводородными канцерогенами апуриновые сайты проявляли себя как более мутагенные, чем стабильные аддукты (Chakravarti D. et al., 1995). Согласуясь с этими наблюдениями, исследования на моделях мышей и хомячков показали, что 4-гидроксиэстрадиол более канцерогенен, чем 2-гидроксиэстрадиол (Li J.J. et al., 1987; Liehr J.G. et al., 1986; Newbold R.R. et al., 2000).
Таким образом, существует значительное количество экспериментальных доказательств того, что эстрогены индуцируют генотоксичность, и этот вывод опирается на исследования в бесклеточных системах, на культурах клеток и лабораторных животных. Повреждение ДНК является, скорее всего, результатом ковалентного изменения нуклеиновых кислот метаболитами катехолэстрогенов, так как в бесклеточных моделях присутствовали только катехолэстрогены и их производные хиноны, но не исходные молекулы эстрогенов. In vivo это повреждение ДНК часто индуцируется в органах с повышенным образованием катехолэстрогенов (Liehr J.G., 2000).
Перечисленные выше данные демонстрируют, что гормоноиндуцированные онкологические заболевания, включая рак молочной железы и эндометрия у человека, являются комплексными заболеваниями, и характеризуются взаимодействием мутагенных и пролиферативных эффектов эстрогенов. Генотоксическая и мутагеїгная активность эстрогенов согласуется с их двойственной ролью канцерогенов (инициаторов озлокачествления) и гормонов (стимуляторов клеточной пролиферации). В клетках, экспрессирующих эстроген-4-гидроксилазы, такие как изоформы CYP, эстрадиол и эстрон конвертируются в 4-гидроксилированные метаболиты эстрогенов. Если эти катехолэстрогены не детоксифицируются белками II фазы метаболизма, такими как СОМТ, UGT и SULT, то они (катехолэстрогены) подвергаются метаболическому циклу окисления-восстановления, результатом которого является установление балланса между хиноновой и гидрохиноповой (катехольной) формами (Liehr J.G., 2000; Liehr J.G. et ai.s 1986; Roy D. et al., 1988). Промежуточными молекулами семихиноновой природы в этом цикле окисления-восстановления являются свободные радикалы, которые генерируют кислородные радикалы, и являются причиной множественного повреждения ДНК (Cavalieri E.L. et al., 1997). Хиноны эстрогенов могут ковалентно связываться с нуклеиновыми кислотами и формировать потенциально мутагенные ДНК-аддукты или алуриновые сайты (Берштейн Л.М., 2000; Cavalieri EX. et al., 1997). Множественные генетические повреждения могут быть индуцированны этими разными видами генотоксичности на уровне хромосомы или гена. Возможность возникновения мутаций и повреждения реактивными метаболитами эстрогенов, определяет метаболический балланс клетки между биосинтезом гормонов, действием гормонов и катаболической трансформацией в биологически неопасные продукты, как способ контроля неблагоприятных событий. Опухоль может возникнуть из клеток, потерявших способность контролировать биосинтез и метаболизм гормонов, и в последующем трансформированных эстроген-индуцированными мутациями, и в то же время отвечающих на рецептор-опосредованную стимуляцию эстрогенами клеточной пролиферации.
Генетические факторы предрасположенности к раку эндометрия тела матки
Данные, описывающие семейную форму рака эндометрия скудны (Adami Н.О. et al., 2002). В соответствии с итальянским исследованием, только 6% госпитализированных больных в семейном анамнезе указали рак эндометрия у близких родственников (Fornasarig М. et al., 1998). Увеличение относительного риска рака эндометрия в связи с присутствием в анамнезе рака яичников (Kelsey J.L. et al., 1982), молочной железы и толстого кишечника (Nelson C.L. et al., 1993) указывает на то, что в некоторых случаях рак эндометрия встречается у генетически предрасположенных индивидов. С другой стороны, обнаруженные факты могут быть объяснены, частично или целиком, сходными факторами риска для перечисленных заболеваний. В исследовании на близнецах наследственные факторы не оказали никакого влияния на риск рака эндометрия, тогда как факторы внешней среды, воздействующие на обоих близнецов из пары, и в большей степени факторы, воздействующие на одного из близнецов, определяли риск заболевания (Lichtenstein Р, et al., 2000).
Интерес к гипотезам, касающимся эффекта низкопенетрантных генов на риск эндометрия, самих по себе или во взаимодействии с другими генами или факторами внешней среды, увеличивается. Изучается роль полиморфизма ключевых генов в потенциально канцерогенных путях метаболизма гормонов (Garte S. et al., 1997). Принимая во внимание важность эстрогенов в генезе рака эндометрия, исследования генетической предрасположенности в большой мере фокусируются на роли полиморфизма в генах, оказывающих влияние на эффект эстрогенов.
Фермент ароматаза, кодируемый полиморфным геном CYP19, катализирует синтез эстрогенов из андрогенов (Paynter R.A. et al., 2005). Анализ гаплотипов, включающих разные сочетания одиннадцати полиморфных участков, показал ассоциацию самого распространенного гаплотипа с повышенным риском рака эндометрия, по сравнению с другими гаплотипами (Paynter R.A. et al., 2005). В другом исследовании, аллели Аб и А7 были связаны с повшением риска рака эндометрия и циркулирующих концентраций эстрадиола и тестостерона (Берштейн Л.М. с соавт., 2001).
Полиморфный ген GSTP1 семейства GST, кодирующих белки, инактивирующие многие эндогенные и экзогенные канцерогены, включая электрофильные метаболиты эстрогенов, является одним из генов-кандидатов, которые могут оказать влияние на риск рака эндометрия. Действительно, в группе китайских пациенток было обнаружено, что потенциально функционально важный полиморфизм IIel05Val связан с увеличением риска рака эндометрия (Chan Q.K. et al., 2005).
Мутации гена р53 часто обнаруживаются в опухолевых клетках. Наличие полиморфных участков также обнаружено в экзонах и интронах р53 как в нормальных, так и в опухолевых клетках. Исследование ассоциации гаплотипов р53, включающих сочетание трех полиморфных участков, свидетельствует о том, что р53 может участвовать в определении предрасположенности к раку эндометрия (Peller S. et al., 1999).
Ген р21 является медиатором р53, и кодирует белок - ингибитор циклин-зависимых киназ (Lukas J. et al., 1997). Генетические изменения в р21 являются потенциально важными для развития злокачественных новообразований у человека, так как они могут оказывать влияние на контроль клеточного цикла (Lukas J. et al., 1997). Повышение риска рака эндометрия у носительниц аллеля Рго72 гена р53 и гомозиготного генотипа Ser31/Ser31 гена р21, отдельно и в комбинации, было показано для группы корейских больных (Roh J.W. et al., 2004).
Несколько исследований установили связь между раком эндометрия и IGF-1 (Druckmann R. et al., 2002). Обнаружено повышение циркулирующиего уровня IGF-1 у постменопаузальных женщин с раком эндометрия (АуаЬе Т. et al., 1997). IGF-1 оказывает митогешіьш эффект на культуры клеток разных типов рака эндометрия (Reynolds R.K. et аЦ 1998).
Так как действие эстрогенов на клетку осуществляется через ЭР, полиморфизм соответствующего гена (ER) могут быть ассоциированы с изменением риска возникновения рака эндометрия. Несколько работ подтверждают это предположение, свидетельствуя о том, что носительство вариантных генотипов связано с пониженным риском развития рака эндометрия (Iwamoto I. et al., 2003; Sasaki M. et al., 2002; Weiderpass E. et al., 2000).
Стимуляция эндометрия эстрогенами без одновременного противодействия прогестерона является фактором риска рака эндометрия (Асе C.I. et al., 1995; Ehrlich СЕ. et al., 1981; Persson I. et al., 1989), Так как антипролиферативное действие прогестерона осуществляется через рецептор прогестерона, кодируемый у человека геном hPK, генетические варианты в этом гене могут играть роль в определении предрасположенности к раку эндометрия. Действительно, была показана ассоциация полиморфного участка 331G/A, повышающего транскрипцию гена hPR, с повышением риска рака эндометрия (De Vivo I. et al., 2002).
Эндогенные факторы. Преобладающее число факторов риска связано со стимуляцией эндометрия повышенными концентрациями эстрогенов без адекватной сбалансированной стимуляции прогестероном. Было предположено, что риск рака эндометрия увеличивается у женщин, имеющих повышенный уровень эстрогенов или пониженный уровень прогестерона в плазме крови (Key T.J. et а]., 1988; Suteri Р.К., 1978). Это предположение основано на двух наблюдениях: 1) повышение скорости пролиферации клеток эндометрия в фолликулярную фазу менструального цикла, когда уровень прогестерона невысок (Ferenczy A. et al., 1979; Key T.J. et al., 1988), и 2) повышение риска рака эндометрия у женщин, принимающих препараты эстрогенов. Прогестерон уменьшает эффект эстрогенов в эндометрии, стимулируя локальный синтез 17р-гидроксистероиддегидрогеназы (фермента, катализирующего превращение активного эстрадиола в менее активный эстрон) и сульфотрансферазы эстрогенов (SULTIE1, фермента, катализирующего присоединение сульфата к эстрадиолу и эстрону, тем самым инактивируя их) (Clarke C.L. et al., 1982; Kitawaki J. et al,, 1988),
Многие исследования указывают на обратную зависимость количества беременностей и риска рака эндометрия (Persson I., 2000). Беременность сопровождается циркуляцией повышенного количества прогестерона, а отсутствие беременностей само по себе может быть фактором риска рака эндометрия, в том случае если оно связано с отсутствием овуляций, и, таким образом, с пониженной концентрацией прогестерона (Henderson I.C., 1983). Нерегулярный менструальный цикл и позняя менопауза вместе способствуют более продолжительному периоду несбаллансировашюй прогестероном эстрогеновой стимуляции, и повышенному риску рака эндометрия (Persson I., 2000).
Биологическая роль ферментов конъюгации
Образование эстрогеновых конъюгатов является основным путем метаболизма эстрогенов (рис. 1) (Guengench F.P., 1990). Как эндогенные, так и синтетические эстрогены подвергаются конъюгации у человека (Williams С. et al., 1996; Zhu ВТ. et al, 1998). Из всех возможных конъюгатов эстрогенов, циркулирующих в крови, самым распространеным является сульфатный коїгьюгат, чуть менее распространенный — глюкуроновый. Необходимо отметить, что конъюгаты эстрогенов не являются лигандами для эстрогеновых рецепторов, и, таким образом, не инициируют рецептор-опосредованных клеточных событий (Zhu В.Т. et аї., 1998). Ранее существовало мнение о том, что сульфаты и глюкурониды эстрогенов являются результатом метаболического пути, превращающего эстрогены в менее активные, более полярные и потому легче экскретируемые молекулы. Как было показано позже, сульфаты эстрогенов имеют больпгую продолжительность жизни (Coughtrie M.W. et al., 1998; Pasqualini J.R. et al., 1989; Zhu B.T. et al, 1998), а также представлены в гораздо большем количестве в кровотоке (Pasqualini J.R. et al, 1989), чем неконъюгированные молекулы. Поэтому, зная также о возможности последующей десульфатации эстрогеновых сульфатов, было предположено, что сульфаты стероидных гормонов играют роль гормонов-предшественников (Hobkirk R., 1985; Zhu В.Т. et al, 1998). Также, многочисленные данные свидетельствуют о том, что реакции присоединения и отсоединения сульфата могут представлять эндогенную систему регуляции биологической активности стероидных гормонов в тканях-мишенях (Coughtrie M.W. et al., 1998; Hobkirk R., 1993). В настоящее время существует гипотеза, что неактивный сульфат эстрона транспотируется по системе циркуляции к ткани-мишени, захватывается клеткой-мишенью, наиболее вероятно, с помощью анионного транспортера, гидролизуется до эстрона при участии мембраносвязанной стероидной сульфатазы (арилсульфатаза С) и затем гидроксилируется до активного 17р-эстрадиола при помощи 170-гидроксистероидцегадрогеназ (Coughtrie M.W, et al., 1998; Eckhardt U. et al., 1999; Williams С et al., 1996; Zhu BX et al., 1998). 17р-Эстрадиол, являясь лигандом для ЭР, активирует последний, и этим инициирует ряд ЭР-опосредованных событий, таких как активация транскрипции некоторых генов.
Белки, ответственные за присоединение и отсоединение глюкуроновой частицы к молекулам эстрогенов, экспрессируются во многих клетках, включая клетки эпителия молочной железы (Albert С. et al., 1999; Albin N. et al., 1993) и зіщометрия матки (Lepine J. et al., 2004). Клетки опухоли молочной железы экспрессирутот высокий уровень р-глюкуронидазы, фермента, который катализирует гидролиз глюкуронидов эстрогенов (Albin N. et al., 1993). Хотя роль глюкуронидов эстрогенов как предшественников стероидных гормонов исследовалась, общепринята все же концепция об экскреторной функции этих соединений. Глюкуроновые коиъюгаты эстрогенов выводятся из организма как с желчью, так и с мочой (Ebner Т. et al., 1993).
Как эстрогены, так и катехолэстрогены, способны вступать в реакции конъюгации, результатом которых являются неактивные молекулы (см. рис, 1) (Zhu В.Т. et al., 1998). В большинстве случаев, активные катехолэстрогены детоксифицируются в процессе биотрансформации в метильные конъюгаты, и в меньшей степени в глюкуроновые и сульфатные (Zhu В.Т. et al, Ї998). Детоксификация хинонов происходит через конъюгацию с глутатионом (Cavalieri E.L. et al., 1997). Таким образом, риск повреждения ДНК с участием катехолэстрогенов зависит от способности клетки конъюгировать катехолэстрогены и хиноиы в соответствии со скоростью формирования этих токсичных метаболитов.
Количественно, наиболее активным путем конъюгации катехолэстрогенов является метилирование. Метилирование катехолэстрогенов катализируется СОМТ, членом семейства метилтрансфераз (Lennard L., 1997). СОМТ, классический фермент второй фазы метаболизма, катализирует перенос метальной группы с ко-фактора S-аденозилметионина на гидроксильную группу катехольных субстратов, включая катехолэстрогены. В норме, большая часть катехолэстрогенов метилируется до 2- и 4-метильных эфиров, которые выводятся из организма (Ball Р, et al., 1983). Существование этого метаболического пути объясняет очень короткое время полужизни катехолэстрогенов и обнаружение преимущественно О-метилэфирных форм катехолэстрогенов, особенно 2-метилэстрогенов, в моче (Lipsett М. et al., 1983). Однако, в обстоятельствах, когда способность к О-метшгарованию уменьшена, или ингабирована большим количеством катехольных форм, время полужизни катехолэстрогенов может увеличиться. Этот феномен может иметь особенное значение для определенных клеток, таких как клетки эпителия молочной железы и эндометрия, где катехолэстрогены образуются (Raftogianis R. et al., 2000). СОМТ может играть важную роль, защищая геном от повреждения, вызванного активацией пути образования хинонов катехолэстрогенов (Raftogianis R. et al., 2000).
Эксперименты на почках хомячков были первыми исследованиями взаимосвязи СОМТ и эстроген-индуцированного рака (Weisz J. et al., 1998). У хомячков, получавших эстрогены, эстрон и эстрадиол, были зарегистрированы опухоли кортекса почки (Weisz J. et al., 1998). Было доказано, что канцерогенные свойства эстрогенов в почке хомячков являются результатом комбинации факторов: 1) повышенное количество 2- и 4-гидроксилированных катехолэстрогенов, и 2) экспрессия относительно неактивной формы СОМТ (Liehr, 1994). У человека экспрессия СОМТ была обнаружена в нормальных и злокачественно измененных эпителиоцитах молочной железы и эндометрия (Бочкарева Н.В. с соавт., 2004; Lundstrom К. et al., 1995; Ulmanen I. et al., 1997; Weisz J. et al., 2000).
Эстрогеновая сульфотрансфераза (SULT1E1)
Глюкуронидация является одним из основных путей метаболической трансформации эстрогенов, также как и многих липофильных эндобиотиков (таких как стероиды, желчные кислоты, гормоны, билирубин) и ксенобиотиков (лекарства, поллютанты окружающей среды, канцерогены и т.д.) (Tukey R.H. et al., 2000). УДФ-ппокуронозидтрансферазы катализируют эти реакции и представляют собой суперперсемейство димерных белков (Ghosh S.S. et al., 2001). UGT являются мембраносвязанными белками, основная часть которых, включая активный сайт, локализована внутри мембраны эндоплазматического ретикулума (Geese B.J., Raftogianis Blanchard, R., 2002).
Глюкуронидация включает перенос гликозильной группы глюкуроновой кислоты на молекулу-акцептор; карбоксильную, гидроксильную, сульфурильную, карбонильную или аминогруппу. Получившийся в результате p-D-глюкуронидный метаболит обладает свойством растворимости в воде и легко выводится из организма с желчью и мочой. Таким образом, глюкуронидация представляет собой важный путь детоксификации для многих ксено- и эндобиотиков. Однако, глюкуронидация также представляет путь биоактивации некоторых соединений, таких как морфин, стероиды, желчные кислоты и ретшюиды (Radominska-Pandya A., Czemik, P. J., Little, J. М., Battaglia, Е., and Mackenzie, P. I., 1999), Интересно, что глюкуронидация является также путем распределения лекарств в организме. Например, глюкуронидные конъюгаты лекарств, попав в желчь, могут подвергаться деглюкуронидации при участии р-глюкуронидазы. Регенерированное лекарство может далее реабсорбироваться в кишечнике. В этой связи глюкуронидныи конъюгат может рассматриваться как предшественник лекарственного препарата (Fisher MB., Vandenbranden, М, Findlay, К., Burchell, В., Thummel, К. Е., Hall, S. D., and Wrighton, S. A., 2000). Такая циркуляция между активной и неактивной формами является распространенным механизмом регуляции биодоступности веществ.
Глюкуронидация стероидных гормонов описана у человека в печени, молочной железе, эндометрии (Albert С. et al., 1999; Clarke D.J. et al., 1994; Ebner T. et al., 1993; Lepine J. et al., 2004), а также тонком кишечнике, толстом кишечнике, желудке, почке и предстательной железе (Fisher М.В., Vandenbranden, М., Findlay, К., Burchell, В., Thummel, К. Е., Hall, S. D., and Wrighton, S. A., 2000; Tukey R.H. et al., 2000).
У человека было описано два семейства UGT, UGT1 и UGT2 (Mackenzie P.I. et al., 2005). Показаны значительные индивидуальные различия в способности присоединять глюкуроновую группу. Полиморфные участки описаны почти для всех представителей семейства UGT1 и некоторых представителей семейства UGT2 (Mackenzie P.I. et al., 2005). Однако, биохимическое значение этих полиморфных участков находится в процессе исследования; еще меньше известно об их клиническом значении. Из всех UGT, UGT1A1 является наиболее изученным белком в плане клинической значимости.
Экспрессия UGT1A1 была обнаружена в большом количестве в печени (Ritter J.K. et al., 1992), культурах эпителия карциномы молочной железы (Guillemette С. et al., 2000), эндометрии матки (Lepine J. et al., 2004) и органах желудочно-кишечного тракта (Fisher М.В., Vandenbranden, М., Findlay, К., Burchell, В., Thummel, К. Е., Hall, S. D., and Wrighton, S. A., 2000; Strassburg C.P. et al., 1998). Субстратами UGTIA1 являются эстрадиол, 2-OHE1, 4-OHE1, 2-OHE2, 4-OHE2, 2-метоксиэстрадиол, билирубин и другие (Ebner Т. et al., 1993; Guillemette С, 2003; Iyer L. et al., 1998; Lepine J. et al., 2004).
Полиморфизм гена UGT1AL Известно более 60 аллельных вариантов гена UGT1A1 (Mackenzie РЛ. et al., 2005). Наиболее распространенный и фенотипически охарактеризованный полиморфизм затрагавает последовательность ТАТА-бокса промотора и заключается в изменении количества динуклеотидов (ТА). Аллель UGT1A1 ! (дикий тип) содержит последовательность А(ТА)бТАА, в то время как аллельный вариант UGT1A1 28 содержит А(ТА)?ТАА (Bosma P.J. et al., 1995; Mackenzie РЛ. et al., 1997). Частота аллеля UGT1A1 \ у европеоидов составляет 0.60-0.62; у негроидов - 0.46-0.52 и 0.84 - у монголоидов (Beutler Е. et al., 1998; Guillemette С. et al., 2000). Частота аллеля UGT1A1 2% у европеоидов 0.38-0.40; у негроидов 0.38-0.43; у монголоидов 0Л6 (Beutler Е. et al., 1998; Guillemette С. et al., 2000). У русских европеоидов аллельная частота аллелей UGT1A1 не исследовалась. Аллели с пятью (UGT1AJ 33) и восемью (UGT1A1 34) ТА-повторами были найдены в основном в популяции негроидов с частотой 0.07-0.09 и 0.02-0.04, соответственно, и достаточно редки в других этнических группах (Beutler Е. et al., 1998).
Функциональное значение аллелей. Beutler et al., 1998 охарактеризовали молекулярный механизм, благодаря которому динуклеотидные инсерции и делеции внутри промоторной ТАТА-последователыюсти влияют на экспрессию белка. Было показано, что уровень транскрипта обратно пропорционален количеству ТА-повторов промотора (Beutler Е. et al., 1998). Таким образом, этот полиморфизм изменяет уровень экспресии UGT1A1 и проявляется фенотипически в суммарном снижении активности белка, кодируемого UGT1A1 28 и 34 по сравнению с белком, кодируемым UGT1A1 \ и 33. Активность фермента, кодируемого аллелем UGTJA1 2$ (семь ТА-повторов), составляет примерно 60% от активности белка дикого типа, кодируемого UGT1A1 \ (шесть ТА-повторов), а активность фермента, кодируемого UGT1A1 34 (восемь ТА- повторов) - еще меньше. Активность же белка, кодируемого UGT1A1 33 (пять ТА-повторов) в 1,5 раза больше активности фермента дикого типа (Beutler Е. et а!., 1998).
Эпидемиологические данные. Несколько работ было проведено по исследованию ассоциации генотипа UGT1A1 и риска развития РМЖ. В группе американских негроидов показана ассоциация аллелей UGT1A1 28 и 34, характеризующихся низким уровнем активации транскрипции гена, с повышенным риском развития РМЖ, однако, в аналогичном исследовании американских европеоидов те же авторы не обнаружили ассциации между аллелъным полиморфизмом UGT1AI и риском РМЖ (Guillemette С. et al., 2001; Guillemette С. et al., 2000). Еще одно исследование, включающее группу китайских пациенток, показало ассциацию аллеля UGT1AI 28 с повышенным риском РМЖ (Adegoke O.J. et al., 2004), а в исследовании с участием американских европеоидов и монголоидов был показан сниженный риск РМЖ у пациенток, гомозиготных по UGT1AI 2S (Sparks R. et al., 2004). У русских женщин ассоциация аллелей и генотипов UGT1A1 и риска возникновения рака молочной железы и эндометрия не исследовалась. В единственной работе по исследованию ассоциации аллелей UGT1A1 и рака эндометрия авторы показали, что UGT1AJ 2S связан с уменьшением риска этого заболевания (Duguay Y. et al., 2004).
