Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1. Общие сведения о сигнальных системах растений 10
1.1.1. Антероградная сигнальная система 10
1.1.2. Ретроградная сигнальная система 13
1.1.2.1. Митохондриальный ретроградный контроль 13
1.1.2.2. Пластидный ретроградный контроль 15
1.1.3. Взаимодействие сигнальных систем хлоропластов и митохондрий 18
1.2. Пластидные сигналы 21
1.2.1. Тетрапирролы, как возможные сигнальные молекулы,
участвующие в регуляции экспрессии ядерных генов 21
1.2.1.1 .Краткое описание биосинтеза тетрапирролов 21
1.2.1.2. Роль тетрапирролов в регуляции экспрессии ядерных генов 29
1.2.1.3. gun мутанты - модельные объекты для изучения роли интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в передаче пластидного сигнала 33
1.2.1.4. Основные доказательства участия тетрапирролов в передаче сигнала от пластид к ядру 40
1.2.1.5. Компоненты пути передачи сигналов, индуцируемых интермедиатами биосинтеза тетрапирролов 44
1.2.1.6. Действительно ли молекулы тетрапирролов являются ретроградными сигналами? 49
1.2.2. Редокс-сигналы пластид 59
1.2.2.1. Активные формы кислорода как пластидные сигналы 59
1.2.2.2. Редокс-состояние фотосинтетической электрон-транспортной цепи в регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков 64
1.2.3. Продукты синтеза белка в пластидах как ретроградный сигнал, участвующий в регуляции экспрессии ряда ядерных генов белков пластид 69
1.3. Краткое описание некоторых сигнальных систем клетки 72
1.4. Белки светового стресса пластид ELIP 79
ГЛАВА 2 CLASS . Объекты и методы исследовани CLASS я 92
2.1. Растения и условия выращивания 92
2.2. Обработка растений ингибиторами 93
2.3. Условия светового и холодового стрессов 97
2.4. Выделение РНК 98
2.5. Очистка РНК от примесей 99
2.6. Электрофорез РНК 99
2.7. Подбор праймеров 100
2.8. Получение цепи комплементарной ДНК с помощью реакции обратной транскрипции 102
2.9. «Real-time» ПЦР 103
2.10. Стандартная ПЦР 105
2.11. Электрофорез ПЦР-продуктов 108
2.12. Рестрикционный анализ ДНК 108
2.13. Определение содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов 109
2.14. Измерение фотохимической активности ФС2 ПО
2.15. Статистический анализ 111
ГЛАВА 3. CLASS Результаты и обсуждени CLASS е 112
3.1. Участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в ретроградной
регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков
ELIP1 иЕЫР2 у Arabidopsis 112
3.1.1. Экспрессия генов ЕЫР и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений 112
3.1.2. Действие норфлуразона на экспрессию генов ЕЫР у пуи gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis 120
3.1.3. Влияние экзогенного и эндогенного Mg-Proto на экспрессию генов ЕЫР1 и ЕЫР2 у gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis 127
3.1.4. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов у gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis, выращенных в присутствии или без НФ 130
3.2. Влияние других типов пластидных сигналов на экспрессию генов ЕЫР при нарушении биосинтеза тетрапирролов у hy и gun мутантов Arabidopsis 140
3.3. Влияние некоторых сигнальных систем клетки на экспрессию генов ЕЫР при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis 155
3.3.1. Действие пластидного сигнала при разной интенсивности света на экспрессию генов мультигенного семейства белков LHC: ELIP1, ЕЫР2 и Lhcb2 и экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов (НЕМА1,НЕМА2иСЫН) 155
3.3.2. Влияние регуляторов роста растений и углеводов на экспрессию генов ЕЫР 159
Заключение 176
Выводы 179
Список литературы 181
- Антероградная сигнальная система
- Редокс-состояние фотосинтетической электрон-транспортной цепи в регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков
- Обработка растений ингибиторами
- Экспрессия генов ЕЫР и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений
Введение к работе
Хлоропласты являются не только центрами фотосинтетической деятельности растительных тканей, но принимают участие также в биосинтезе аминокислот, витаминов, пиримидинов, начальных этапах биосинтеза абсцизовой кислоты, восстановлении сульфатов и ряде других процессов. Хотя хлоропласты имеют собственный геном, большинство белков, необходимых для их функционирования, кодируется ядерным геномом и только небольшая часть кодируется геномом органелл (Leister, 2003; Одинцова и Юрина, 2003). Координированная экспрессия генов ядра и пластид, необходимая для развития и функционирования растительной клетки, достигается путем внутриклеточных взаимодействий ядра и пластид с помощью антероградного (от ядра к пластидам) и ретроградного (от пластид к ядру) механизмов регуляции (Taylor, 1989; Rodermel and Park, 2003). Важная роль ретроградных пластидных сигналов показана для биосинтеза хлорофилла, транспорта белков в органеллы и ответных реакций растений на стрессовые воздействия (Strand et al., 2003; Юрина и Одинцова, 2007). Роль таких сигналов выполняют продукты синтеза белка в пластидах, тетрапирролы (интермедиаты биосинтеза хлорофилла), а также редокс-состояние пула пластохинонов фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) пластид (Leister, 2003; Strand et al., 2003; Beck, 2005; Погульская и др., 2006; Юрина и Одинцова, 2007; Осипенкова и др., 2007). Для исследования ретроградных пластидных сигналов используют genome uncoupled (gun) мутанты Arabidopsis с нарушенной передачей пластидных сигналов (Strand et al., 2003). Идентифицированы пять неаллельных gun мутантов, у которых экспрессия кодируемых ядром генов хлоропластных белков, таких как Lhcbl (ген, кодирущий хлорофилл а/-связывающие белки светособирающего комплекса фотосистемы 2 (ФС2)) и RbcS (ген, кодирущий малую субъединицу рибулезобифосфаткарбоксилазы), увеличивалась на свету в присутствии гербицида норфлуразона, подавляющего синтез каротиноидов и вызывающего значительные фотоокислительные повреждения хлоропластов
8 из-за образования активных форм кислорода (АФК) (Strand et al., 2003). Клонированные гены соответствовали пяти оригинальным локусам GUN1-GUN5, четыре из которых (GUN2-GUN5) кодировали белки, участвующие в метаболизме тетрапирролов (Mochizuki et al, 2001; Larkin et al., 2003). Было высказано предположение, что высшие растения могут использовать Mg-протопорфирин IX (Mg-Proto) и его монометиловый эфир (Mg-ProtoMe) в качестве сигнальных молекул хлоропластов (Woodson and Chory, 2008), хотя до сих пор этот вопрос остается спорным.
Так как растения постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, особый интерес приобретает исследование экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ЕЫР (Early Light Inducible Proteins; ранние светоиндуцируемые белки), которые играют важную роль в защитных реакциях растений в ответ на действие стрессовых факторов(Огітт and Kloppstech, 1987; Adamska, 1997). Эти белки синтезируются на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Adamska et al., 2001). У высших растений низкомолекулярный (ELIP1) и высокомолекулярный (ELIP2) белки, относящиеся к мультигенному семейству белков LHCP (Light Harvesting Chlorophyll a/b Proteins, светособирающие хлорофилл я/6-связывающие белки) (Strasser and Butler, 1977), кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, и в форме предшественников пост-трансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane and Kloppstech, 2000).
Имеющиеся данные о ретроградных сигналах не позволяют судить о том, какие соединения являются сигнальными молекулами и как влияют пластидные сигналы на экспрессию генов белков светового стресса. Изучение экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов Arabidopsis поможет получить информацию о роли пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов фотосинтеза.
Целью настоящей работы было изучение роли ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 с помощью gun и hy (аллельных gun) мутантов Arabidopsis, характеризующихся нарушениями биосинтеза тетрапирролов.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Изучить влияние нарушений передачи тетрапиррол-медиированного
ретроградного пластидного сигнала на экспрессию ядерных генов стрессовых
белков пластид ЕЫР1 и ELIP2, а также корреляцию между экспрессией этих
генов и содержанием хлорофилла на разных стадиях развития hy и gun
мутантов Arabidopsis.
2. Выяснить роль предшественников биосинтеза тетрапирролов в
экспрессии генов ЕЫР у hy и gun мутантов с помощью ингибиторного анализа
и увеличения содержания Mg-протопорфирина IX. Определить содержание
предшественников тетрапирролов (протопорфирина IX, Mg-протопорфирина
IX и его монометилового эфира).
3. Изучить действие других типов пластидных сигналов (активных форм
кислорода и редокс-состояния пула пластохинонов) на экспрессию генов EL1P1
и ELIP2.
4. Изучить влияние некоторых сигнальных систем клетки (световой,
гормональной и углеводной) на экспрессию генов ЕЫР при нарушении
пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.
Антероградная сигнальная система
Клетки растений содержат две энергообразующие органе ллы: хлоропласты, которые превращают солнечную энергию в химическую в форме АТФ и сохраняют энергию в виде соединений углерода (таких как сахара и липиды), и митохондрии, которые превращают запасенную энергию в АТФ (рис. 1). Клеточные органеллы содержат тысячи различных белков, большинство которых кодируется ядерными генами, и только немногие гены, кодирующие компоненты, главным образом, системы экспрессии генов и дыхательной цепи (в митохондриях) или фотосинтеза (в хлоропластах), локализованы в геномах органелл. Ключевая роль в этих процессах Рис. 1. Общая схема взаимодействия между различными компартментами клетки высших растений.
На схеме жирные стрелки показывают направление действия антероградных (идущих от ядра к пластидам и митохондриям) и ретроградных (идущих от пластид и митохондрий к ядру) сигналов. Тонкие стрелки показывают возможные пути ретроградных пластидных сигналов, индуцируемых продуктами синтеза белка, активными формами кислорода ( Ог и Н2О2), изменением редокс-статуса компонентов ЭТЦ, а также молекулами Mg-Proto и Mg-ProtoMe (модель 1) и/или комплексом других интермедиатов и ферментов биосинтеза тетрапирролов (модель 2). Н, I, D - субъединицы Mg-хелатазы; Хл - хлорофилл (Beck, 2005). принадлежит клеточному ядру. В ядре локализована большая часть генов, продукты которых участвуют в регуляции экспрессии хлоропластных генов (Goldschmidt-Clermont, 1998; Leon et al., 1998; Odintsova and Yurina, 2003; 2006; Одинцова и Юрина, 2007).
Сохранение функциональной активности клеточных органелл в процессе роста и развития клеток зависит, таким образом, преимущественно от ядерного генома, кодирующего подавляющее большинство белков органелл, а также от их собственных геномов, кодирующих ограниченное, но существенное число белков. Отсюда рибосомы органелл, фотосистемы, комплексы митохондриальной дыхательной цепи мозаичны: они представляют собой мультибелковые комплексы, состоящие из кодируемых ядром и органеллами субъединиц (Одинцова и Юрина, 2007). Поэтому растительной клетке необходимы механизмы, координирующие экспрессию генов в разных компартментах клетки. Поскольку ядерный геном играет главную роль в биогенезе и функционировании клеточных органелл, основное внимание в последние годы уделялось анализу антероградной регуляции, контролирующей поток информации, идущей от ядра и цитоплазмы к органеллам.
Известны различные уровни контроля ядром функций органелл. Это, во-первых, регуляция содержания транскриптов ядерных генов хлоропластных белков. Такой механизм касается контроля содержания многих белков хлоропластов (Kleffman et al., 2004); во-вторых, регуляция посттрансляционного поступления белков в хлоропласты и митохондрии с участием комплексов Tic/Toe и Tim/Tom, соответственно. Существуют различные изоформы этих транслоконов с разной субстратной специфичностью, которые создают тканеспецифичные протеомы пластид и митохондрий (Leister 2003; 2005). Кроме того, импорт белков в хлоропласты, по-видимому, зависит от редокс-состояния органелл (Leister, 2005); в третьих, регуляция транскрипции, редактирования транскриптов, созревания мРНК и процессинга, а также трансляции кодируемых органеллами белков. В этих процессах участвуют ядерные факторы, обеспечивая ядерный контроль экспрессии органелльных генов; в четвертых, пост-трансляционные процессы (сборка белковых комплексов тилакоидных мембран или внутренней оболочки митохондрий). Эти процессы осуществляются при участии кодируемых ядром факторов сборки; в пятых, образование органелл (деление) строго контролируется белками, кодируемыми ядром.
Кроме такого ядерного, или антероградного, контроля в эволюции развился механизм ретроградного контроля, с помощью которого хлоропласты и митохондрии в зависимости от своего функционального состояния и стадии развития могут регулировать экспрессию ядерных генов, кодирующих белки, локализованные в пластидах или митохондриях (Odintsova and Yurina, 2003; Одинцова и Юрина, 2007). Таким образом, путем внутриклеточных взаимодействий между органеллами, устанавливается надлежащий баланс в экспрессии генов. Сигналы, посылаемые ядром в хлоропласты и митохондрии, изучены значительно лучше, чем ретроградные сигналы, генерируемые пластидами и митохондриями (см. выше рис. 1). Митохондриальный ретроградный контроль
То, что метаболизм и генетическая система митохондрий растений контролируются не только ядром, но и поступающими в ядро сигналами, влияющими на экспрессию ядерных генов, было, в основном, неизвестно до 1989 г (Pesaresi et al., 2007).Митохондрии растений имеют наибольший геном, размеры которого у покрытосеменных колеблются от 200 до 2400 пар нуклеотидов (п.н.) по сравнению с митохондриями других организмов (животных, протистов и грибов) (Носов, 2005). Установлено, что увеличение размера генома произошло после того, как растения заселили сушу, и в этот же эволюционный период митохондриальные геномы растений потеряли ряд генов, передав их ядру. В составе митохондриальной ДНК (мтДНК) содержится 25-104 генов (Носов, 2005). У высших растений мтДНК содержит 50-60 генов (не учитывая числа копий). Различия в числе генов связаны с разным числом генов субъединиц дыхательного комплекса 2, белков рибосом и транспортной РНК (тРНК) (Kubo and Newton, 2008). Большинство генов были, вероятно, перенесены от эндосимбиотического предка митохондрий в геном ядра (Юрина и Одинцова, 2000).
Совокупность имеющихся данных указывает на то, что ретроградная регуляция является важным регуляторным (ответным) механизмом у растений, животных и грибов (Юрина и Одинцова, 2007). Наиболее хорошо изученной моделью с точки зрения ретроградной регуляции являются митохондрии дрожжей Saccharomyces cerevisiae, ретроградные пути которых являются хорошо изученным механизмом митохондриальной ретроградной регуляции (МРР) (Liu and Butow, 2008; Юрина и Одинцова, 2008). В ретроградной регуляции у дрожжей участвуют гены транскрипционных факторов Rtglp и Rtg3p, а также АТФ-связывающий белок Rtg2p, который передает митохондриальные сигналы на Rtglp и Rtg3p (Butow and Avadhani, 2004). Клетки дрожжей S. cerevisiae отвечают на нарушение функций митохондрий изменением азотного и углеродного обменов (Юрина и Одинцова, 2008). В дефицитных по дыханию клетках обмен сдвигается таким образом, чтобы сохранить уровень глутамата, который является источником всего азота, используемого клетками S. cerevisiae в биосинтетических реакциях (Юрина и Одинцова, 2008). Показано, что в митохондриях дрожжей существует несколько ретроградных сигнальных путей (Guaragnella and Butow 2003).
Несколько ретроградных путей обнаружено также в митохондриях клеток млекопитающих (Butow and Avadhani, 2004). В этих клетках экспрессия ядерных генов изменяется в ответ на увеличение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме, вызванное недостаточностью дыхания или отсутствием мтДНК. Показано, что дисфункция митохондрий у млекопитающих, которая сопровождается, по всей видимости, активацией ретроградной регуляции, является причиной многих болезней человека.
В клетках растений функционирует несколько ретроградных митохондриальных сигнальных путей (Kuzmin et al., 2004; Zarkovic et al., 2005). Так, показано, что цитрат, который, как предполагают, влияет на функцию митохондрий, индуцирует экспрессию гена альтернативной оксидазы (АО) в суспензионных культурах клеток табака и сои, но не вызывает заметного увеличения содержания АФК. В клетках сои эта индукция блокируется ингибитором протеинкиназы и не блокируется антимицином, который вызывает образование АФК (Rhoads and Subbaiah, 2004). Гены-мишени МРР у мутантов atp9 и starik Arabidopsis отличаются от генов-мишеней МРР, связанной с антимицином или монофторацетатом. МРР может функционировать при тепловом стрессе, индуцируя гены, кодирующие белки теплового шока (БТШ), в то время как антимицин и монофторацетат не индуцируют эти гены. В совокупности, эти и другие данные позволяют предполагать наличие у растений множества путей МРР, способных инициировать специфические изменения экспрессии ядерных генов в ответ на специфические нарушения функций митохондрий.
Редокс-состояние фотосинтетической электрон-транспортной цепи в регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков
Изменения редокс-состояния компонентов фотосинтетической ЭТЦ, индуцированные окружающими условиями, действуют как сигналы, регулирующие экспрессию генов в хлоропластах и ряда генов в ядре (Pfannschmidt and Liere, 2005; Юрина и Одинцова, 2007) (см выше рис. 6). Это означает, что фотосинтез служит источником информации, необходимой для регуляции экспрессии ядерных генов, которая не воспринимается цитоплазматическими фоторецепторами, а сам хлоропласт является сенсором изменений качества и количества света (Beck, 2005; Юрина и Одинцова, 2007).
Участие редокс-состояния компонентов ЭТЦ в экспрессии ядерных генов было доказано разными путями. Растения, выращенные при низкой интенсивности освещения, периодически переносили на интенсивный свет и наоборот, чтобы изменить редокс-состояние компонентов ЭТЦ. Для этой же цели использовали световые условия, возбуждающие преимущественно ФС2 или ФС1, изменения температуры роста, сахарное голодание и/или пониженный уровень акцепторов электронов, таких как 02 и СОг, а также гербициды диурон и DBMIB (2,5-дибром-3-метил-6-изопропилбензохинон), которые специфически блокируют электронный транспорт от ФС2 к комплексу цитохромов h(/f до (диурон) или после (DBMIB) пула пластохинонов. У растений, обработанных диуроном, PQ находится, в основном, в окисленном состоянии. У растений, обработанных DBMIB,- в восстановленном. Гены, экспрессия которых индуцируется интенсивным светом, индуцируются также обработкой растений DBMIB в отсутствие света высокой интенсивности, напротив, обработка диуроном ингибирует экспрессию генов, индуцированную интенсивным светом. Впервые на клетках зеленой водоросли Dunaliella, росших в условиях интенсивного освещения, и помещенных в условия низкой освещенности, было показано, что уровень транскриптов генов Lhcb и С АО (ген кодирует фермент биосинтеза тетрапирролов САО) регулируется редокс-состоянием ЭТЦ хлоропластов (Chen et al., 2004; Юрина и Одинцова, 2007). Обработка клеток диуроном приводила к повышенной транскрипции генов Lhcb и САО даже в условиях высокой освещенности. Напротив, частичное ингибирование окисления пластохинонов DBMIB вызывало снижение транскрипции изученных генов при низкой интенсивности света. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что редокс-состояние пула пластохинонов является начальным сигналом при регуляции экспрессии этих генов (Chen et al., 2004; Nott et al., 2006).
Роль редокс-состояния ЭТЦ как источника хлоропластного сигнала, поступающего в ядро, была недавно подтверждена анализом экспрессии большого числа (3292) ядерных генов Arabidopsis, из которых 2661 ген кодировал белки хлоропластов и 631 ген - нехлоропластные белки (Richly et al., 2003). В тех случаях, когда растения, росшие на свету, возбуждающему преимущественно ФС1, переносили на свет ФС2, изменения в содержании мРНК были обнаружены у 2133 генов. При этом наблюдалась позитивная регуляция (увеличение экспрессии) 1121 гена и негативная регуляция (снижение экспрессии) 1012 генов. Более детальные исследования показали, что 286 из общего числа генов непосредственно регулируются редокс-сигналами фотосинтетических ЭТЦ: экспрессия 86 генов увеличивается и 200 генов уменьшается (Fey et al., 2005). Хотя изменения в уровнях экспрессии большинства генов были довольно незначительными, эти данные можно рассматривать как доказательство регуляторной роли редокс-состояния компонентов ЭТЦ в экспрессии большого числа ядерных генов.
Первоначально редокс-систему рассматривали в качестве общего механизма адаптации фотосинтетического аппарата к изменениям интенсивности освещения и различным формам стресса, вызванным условиями окружающей среды. В настоящее время экспериментально доказано только влияние редокс-состояния PQ на экспрессию ядерных генов. Однако, показано, что у растений функционируют разные редокс-системы, причем у высших растений редокс-состояние PQ играет, по-видимому, меньшую регуляторную роль при экспрессии ядерных генов, чем у зеленых водорослей.
Так, например, экспрессия PetE (генов пластоцианина) и сАРХ табака, а также гена ЕЫР2 Arabidopsis зависит от редокс-состояния пула пластохинонов (Kimura et al., 2003; Chang et al., 2004; Beck, 2005; Юрина и Одинцова, 2007), в то время как транскрипция других ядерных генов (например, генов, кодирующих компоненты ФС1: PsaD и PsaF или нитратредуктазу), также связанных с фотосинтетическим транспортом электронов, контролируется редокс-состоянием не пула пластохинонов, а других компонентов ЭТЦ (Beck, 2005; Юрина и Одинцова, 2007). Аналогичный вывод следует из опытов по изучению экспрессии гена Lhcb у озимой ржи, росшей при разных световых и температурных режимах. В этом случае за редокс-изменениями в хлоропластах следили по фосфорилированию белка LHCB. При этом наблюдали корреляцию между фосфорилированием LHCB и уровнем мРНК гена Lhcb, но никакой корреляции с редокс-состоянием PQ обнаружено не было (Юрина и Одинцова, 2007). Исследования с диуроном и DBMIB, также как анализ мутантов с измененным цитохромным комплексом, показали, что редокс-сигналы, участвующие в регуляции экспрессии ряда ядерных генов, возникают в ЭТЦ после комплекса b /f (рис. 1) (Beck, 2005). Показано, что редокс-сигналы хлоропластов могут влиять на экспрессию ядерных генов, как на уровне транскрипции, так и на посттранскрипционном уровне (Fed-1, PetE), регулируя стабильность мРНК и связывание мРНК с полирибосомами (Sullivan and Gray, 2002).
Механизм, с помощью которого редокс-состояние тилакоидной мембраны передает сигнал ядру, мало понятен. Если сенсором служит PQ, в передаче сигнала может участвовать каскад реакций фосфорилирования. В опытах на зеленой водоросли Dunaliella показано, что ингибиторы протеинфосфатаз блокируют процесс акклиматизации к условиям низкой освещенности, контролируемый редокс-состоянием пула пластохинонов (Richly et al., 2003). Кроме того, ингибиторы протеинкиназ препятствуют индукции генов Lhcb и С АО у Dunaliella при смене условий освещения культур (Rapp and Mullet, 1991). На растениях табака обнаружено, что ингибиторы цитоплазматических киназы и фосфатазы влияют на экспрессию репортерного гена GUS под промотором PsaF шпината, регулируемую редокс-состоянием ЭТЦ пластид (Rapp and Mullet, 1991; Юрина и Одинцова, 2007).
Интересно, что в передаче сигналов от хлоропластов к ядру, опосредованной АФК, также, по-видимому, участвует фосфорилирование белков (Юрина и Одинцова, 2007). Недавно обнаружены две стадии в индукции гена сАРХ у табака. Ранняя стадия индуцируется восстановленным PQ, поздняя - клеточным уровнем Н202 (Yabuta et al., 2004). Эти данные означают, что два сигнала могут быть разделены во времени. Экспрессия генов АРХ2 и Е1ір2 у Arabidopsis также индуцируется восстановленным пулом пластохинонов и Н202, хотя неизвестно, существуют ли две стадии при индукции этих генов (Kimura et al., 2003; Chang et al., 2004; Nott et al., 2006; Юрина и Одинцова,
Обработка растений ингибиторами
Норфлуразон (4-хлор-5-метиламино-2-(3-трифторметил-фенил) пиридазинон-3(2/7), НФ) («ChemService», США) - гербицид, биосинтеза каротиноидов использовали в экспериментах с gun мутантами Arabidopsis. Концентрация НФ была подобрана экспериментальным путем для достижения максимального снижения количества каротиноидов. Перед приготовлением раствора НФ указанной концентрации готовили запасной раствор, для чего НФ растворяли в 100% этиловом спирте. В опытах с 10- дневными проростками Arabidopsis, НФ добавляли в среду для выращивания растений в концентрации 5 (J.M. Концентрация этилового спирта в среде для выращивания контрольных растений была равна концентрации спирта в НФ-среде. В экспериментах с 30-дневными растениями, каждое растение Arabidopsis опрыскивали ежедневно в начале светового периода 5 мл раствора НФ той же концентрации, начиняя с 23 дня роста в течение одной недели. Длительность обработки растений НФ путем опрыскивания подбиралась экспериментально. Контрольные растения опрыскивали тем же буфером без добавления НФ.
Гербицид 2,2 -дипиридил (2,2 -бипиридил, а,а -дипиридил, ДП) («Sigma-Aldrich», США) использовали в качестве ингибитора биосинтеза тетрапирролов на стадии превращения Mg-ProtoMe в Pchlide. Концентрация ДП для экспериментов была подобрана экспериментально и составляла 5 мМ. ДП растворяли в 100% этиловом спирте. Было установлено оптимальное время действия ингибитора, которое составляло 8 часов. gun5 мутанты и растения дикого типа Arabidopsis, выращенные в течение 10 дней на НФ-среде в присутствии 2%-ной сахарозы, инкубировали с 5 мМ ДП в течение 8 часов, при этом 6 часов растения находились при комнатной температуре (20-23 С) и 2 последних часа - в условиях холодового стресса (10 С) и низкой освещенности (40 цмоль м"2 с"1). Растения опрыскивали водным раствором ДП указанной концентрации, контрольные растения опрыскивали буфером без добавления
Магний протопорфирин IX (Mg-Proto) - интермедиат биосинтеза тетрапирролов, использовали для экзогенной обработки растений Arabidopsis. Верхние листья gun5-l мутантов и дикого типа Arabidopsis отделяли от 4-недельных растений и инкубировали в водном растворе 50 JIM Mg-Proto. Инкубацию проводили при низкой интенсивности света (40 цмоль м с" ) в течение 5 часов, причем первые 3 часа растения находились при комнатной температуре (20-23 С), а последние 2 часа - в условиях холодового стресса (10 С). Контрольные образцы листьев инкубировали в воде при идентичных условиях.
Ацифлуорфен (5-(2-хлор-а,а,а-трифтор-п-окситолуол)-2-нитробензойная кислота; АФ) («Riedel-deHajon», Германия) - ингибитор дифинил-эфирного типа протопорфириноген оксидазы (К.Ф.1.3.3.4), растворяли в ацетоне и разводили с буфером (10 мМ Трис-HCl, рН 7.7, 0.05% Tween-80) до нужной концентрации. Каждое опытное растение дикого типа, выращенное в течение 30 дней на SL, перед темновым периодом роста опрыскивали в течение 3 дней 10 мл АФ-раствора в следующих концентрациях: 1, 5, 10, 20, 30 и 50 дМ. Одну часть растений, подвергнутых АФ-обработке, оставляли при стандартном освещении, а другую - выставляли на интенсивный свет (200 JJ-МОЛЬ М" С" ). Контрольные растения опрыскивали буфером, не содержащим АФ. Для экспериментов с 10-дневными gun5-l, hyl, hy2 мутантами и растениями дикого типа Arabidopsis, раствор АФ в концентрации 0.05 цМ добавляли в 2хМС среду для выращивания растений, содержащую 2%-ную сахарозу. В опытах с контрольными растениями среда для выращивания содержала буфер без АФ. Контрольные и опытные 10-дневные проростки выращивали на LL.
Для обработки листьев Arabidopsis использовали 5-аминолевулиновую кислоту (АЛК) («BioChemika», Германия) - предшественник всех тетрапирролов. Концентрацию АЛК подбирали экспериментально. Для приготовления рабочего раствора использовали водный раствор АЛК. От 30-дневных gim5-J, gun4 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis отделяли верхние листья (примерно одного размера), которые помещали по одному в лунки планшета для культивирования. Лунки содержали по 5 мл 1 мМ или 5 мМ раствора АЛК (или воду). Опытные образцы листьев инкубировали в растворе АЛК в течение 2 часов в условиях светового стресса (HL) (350 цмоль м" с"). Контрольные образцы листьев инкубировали в воде при тех же световых условиях. Температуру раствора АЛК, в котором находились исследуемые образцы, поддерживали на уровне комнатной (20-23 С) с помощью циркуляции холодной воды в поддоне, в котором находились планшеты с листьями растений. После инкубации из подсушенных листьев вырезали диски диаметром 0.9 мм, которые замораживали в жидком азоте для выделения РНК. 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина (Диурон) - ингибитор транспорта электронов от ФС2 к пулу пластохинонов, использовали для экспериментов с растениями Arabidopsis и ячменя. Концентрацию рабочего водного раствора диурона подбирали экспериментально. От 30-дневных gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis отделяли листья, примерно равные по размеру, которые помещали в чашки (диаметр 6 см) с 120 цМ раствором диурона. От 7-дневных растений ячменя (Hordeum vulgare L.), выращенных в темноте в водной культуре, отделяли верхнюю треть листа, и помещали в чашки по 1 г, содержащие 120 цМ раствор диурона. Контрольные образцы листьев Arabidopsis и ячменя инкубировали в воде. Листья инфильтрировали в вакууме с 120 дМ раствором диурона в течение 20 минут.
Глюкозу (ОАО «ДальХимФарм», Россия) использовали для опытов с gun5 мутантами и растениями дикого типа Arabidopsis. Проростки выращивали на однослойных стерильных бумажных фильтрах («Медтехника», Россия), погруженных в 2хМС среду, содержащую 2%-ную глюкозу. После 4 дней роста проростки переносили на среду, содержащую 7%-ную глюкозу и выращивали еще в течение 6 дней.
Абсцизовую кислоту (АБК; (8)-(2,Е)-3-метил-5-(1-гидрокси-4-оксо-2,6,6-триметил-2-циклогексенил)-2,4-пенталиеновая кислота, дормин) («Fluka», США) - природный регулятор роста растений, ускоряющий созревание и старение растений, опадение листьев и плодов и обеспечивающий переход растений в состояние покоя использовали для экспериментов с растениями gun5 мутантов Arabidopsis. АБК предварительно растворяли в 70%-ном спирте и затем разводили водой до концентрации 5 }iM. Проростки gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis выращивали на стерильных бумажных фильтрах («Медтехника», Россия) на 2хМС среде, содержащей 2%-ную сахарозу в течение 4 дней в присутствии или в отсутствие НФ. Затем фильтры с проростками переносили на чашки Петри, в которых находились 5 \хМ АБК и 2%-ная сахароза. На среде, содержавшей ингибитор, растения выращивали в течение 6 дней на LL. Среда для выращивания контрольных образцов содержала буфер без дополнительной АБК.
Мелафен (меламиновая соль бис(оксиметил)-фосфиновой кислоты) -регулятор роста растений, который был синтезирован в ИОФХ им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН (Патент РФ №236897), использовали для опытов с проростками ячменя. Обработку семян проводили в течение 2 часов, замачивая их в водном растворе мелафена различной концентрации (0.5x10"10 М; 0.5x10 8 М; 0.5x10"5 М; 0.5x10"3 М). Растения проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной раствором мелафена, в течение 7 дней при 25 С в темноте и световом режиме 12 часов свет/ 12 часов темнота. Во время роста растения поливали растворами мелафена указанных концентраций. Контролем служили растения, выращенные на воде.
Экспрессия генов ЕЫР и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений
Для того чтобы выяснить, участвуют ли интермедиаты биосинтеза тетрапирролов в экспрессии ядерных генов белков фотосинтеза, мы исследовали экспрессию генов ЕЫР1 и ЕЫР2 у четырех мутантов с нарушениями в ферментах биосинтеза тетрапирролов (см. выше рис. 2): hy мутанты (аллельные gun) с нарушениями в биосинтезе гема (где HY1 гены кодируют гемоксигеназу; HY2 — фитохромобилинсинтазу) и gun мутанты с нарушениями в биосинтезе хлорофилла (где GUN4 гены кодируют белок, участвующий в регуляции активности Mg-хелатазы; GUN5 ген - Н-субъединицу этого фермента).
Растения мутантов (gun5, gun5-l, gun4, hyl, hyl) и дикого типа (ДТ) экотипов «Landsberg erecta» (Ler) и «Columbia-0» (Col-0) Arabidopsis выращивали в течение 10 дней на среде, содержащей 2%-ную сахарозу, на LL (рис. 10А). Важной характеристикой gun мутантов является содержание хлорофилла. Анализ накопления хлорофилла у 10-дневных растений Arabidopsis показал, что у gun4, hyl и hy2 мутантов с бледнозеленым фенотипом накопление хлорофилла составляет 50% от накопления хлорофилла у растений дикого типа (рис. 10Б). Известно, что hyl и hy2 мутанты не способны синтезировать тетрапиррольные хромофоры фитохромов, что является причиной их светлозеленого фенотипа (Muramoto, 1999). GUN4 мутация, связанная с белком, влияющим на активность Mg-хелатазы, приводит к снижению содержания предшественников хлорофилла, что и определяет бледнозеленый фенотип этих мутантов (Vinti et al., 2000; Sobotka et al, 2008).
У gun5-l мутантов, несмотря на точковую мутацию в Н-субъединице Mg-хелатазы, наблюдался фенотип растений дикого типа, и содержание хлорофилла было снижено только на 10-20% по сравнению с растениями дикого типа. Содержание хлорофилла у gun5 мутантов было сходным с содержанием у gun5-l мутантов (полиморфизм в экзоне 3) и у растений диких типов Ler и Col-0, поэтому на рис. 10Б представлены средние значения этих вариантов.
При очень низкой освещенности (10 ц.моль м" с") различия между фенотипами всех изученных мутантов и растений дикого типа были мало заметными. Содержание хлорофилла у 10- и 30-дневных gun мутантов Arabidopsis.(А) Растения gun5-l, gun4, hyl, hy2 мутантов и дикого типа (ДТ) Arabidopsis, выращенные в течение 10 дней на 2хМС среде, содержащей 2%-ную сахарозу, при световом режиме 8 часов день/ 16 часов ночь на LL и 30-дневные растения, выращенные в почве на SL. (Б) Содержание хлорофилла у gun5-l, gun4, hyl, hy2 мутантов и ДТ растений. Поскольку содержание хлорофилла у растений дикого типа Ler и Со1-0, а также у gun5 и gun5-l мутантов было сходным на рис. 1Б представлены среднее значения этих вариантов. Белые столбцы - содержание хлорофилла у 10-дневных растений, серые столбцы - содержание хлорофилла у 30-дневных растений. СВ - сырой вес. Приведенные значения содержания хлорофилла являются средними, как минимум, трех независимых экспериментов с указанием стандартного отклонения.
Таким образом, исследование содержания хлорофилла в хлоропластах 10-дневных gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis показало, что растения с gun мутацией, у которых, как было показано ранее (Nott et al., 2006), повреждены пластидные ферменты биосинтеза порфиринов, характеризуются пониженным содержанием хлорофилла.
Чтобы выбрать оптимальное время инкубации растений в условиях светового стресса для максимальной индукции экспрессии генов ЕЫР, была изучена кинетика накопления транскриптов ЕЫР1 с помощью обратной транскрипции, сопряженной со стандартной (полуколичественной) ПЦР при разной продолжительности стресса (от 0 до 24 часов) у gun5-l мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.
На рис. 11 показано накопление транскриптов ELIP1 в течение первых 24 часов освещения постоянным светом gun5-l мутантов и растений дикого типа. Уровень транскрипции генов ЕЫР1 был очень низким в начале светового периода, как у растений дикого типа, так и у мутантов, и достигал максимального значения между 2 и 4 часами освещения, уменьшаясь при увеличении световой экспозиции. У gun5-l мутантов уровень экспрессии генов ELIP1 оставался довольно высоким вплоть до 10 часов освещения и составлял 50% от уровня экспрессии этого гена после двухчасового освещения, в то время как у растений дикого типа за этот же период световой экспозиции накопление транскриптов ELIP1 значительно снижалось. После 24 часов освещения постоянным светом экспрессия гена EL1P1 почти не наблюдалась как у мутантов, так и у растений дикого типа.
Таким образом, у gun5-l мутантов и у растений дикого типа максимальное накопление транскриптов генов ЕЫР наблюдалось после двухчасовой световой экспозиции. Эти оптимальные условия для накопления максимального количества транскриптов генов ЕЫР были использованы в дальнейшей работе. Повышенный уровень накопления транскриптов ЕЫР1 у gun5-l мутантов в течение продолжительного светового стресса по сравнению с растениями дикого типа, по-видимому, был связан с нарушением биосинтеза
Кинетика накопления транскриптов ELIP1 при постоянном 24 часовом световом стрессе у gun5-l мутантов и ДТ растений Arabidopsis. Проростки выращивали в течение 10 дней на LL, как описано на рис. 1 А. Затем растения помещали на сутки в темноту и выставляли на HL на 24 часа. Через двухчасовые промежутки времени (0 - 24 часов) из проростков выделяли РНК, и уровень транскриптов ЕЫР1 анализировали с помощью ОТ-ПЦР. UBQ10 использовали как контроль для стандартизации ОТ-ПЦР. Приведенные значения содержания транскриптов являются средними, как минимум, трех независимых экспериментов с указанием области стандартного отклонения.
Похожие диссертации на Роль ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis thaliana
