Введение к работе
Актуальность темы. Углерод является основным элементом большинства биомолекул, и его круговорот в биохимических реакциях, протекающих в организмах, необходимое условие поддержания жизни. Наряду с превращениями органических молекул, в живых клетках животных и растений происходит постоянное взаимопревращение форм неорганического углерода, углекислого газа и бикарбоната. В клетках животных и гетеротрофных бактериях в процессах, связанных, прежде всего, с дыханием, но также и в ряде других процессов, постоянно продуцируется большое количество углекислого газа. В фотосинтезирующих клетках автотрофных бактерий и растений углекислый газ, наоборот, потребляется в процессе фотосинтеза. В обоих случаях потоки этого газа очень велики в масштабах клетки и всего организма. В клетках изменение в содержании углекислого газа неизбежно связано с превращением либо его в бикарбонат, либо бикарбоната в него. Задержка в этих превращениях может не только замедлить процессы дыхания и фотосинтеза, но и серьезно изменить гомеостаз клетки и даже вызвать ее гибель. Поэтому в процессе эволюции появился фермент карбоангидраза (КА, карбонатгидролиаза КФ 4.2.1.1.), который катализирует обратимую гидратацию углекислого газа, значительно ускоряя ее:
С02 + Н20 <-> НСОз" + н+
Важность этого фермента для организмов подчеркивается тем фактом, что в процессе эволюции он независимо возникал несколько раз. Известные к настоящему времени карбоангидразы ученые делят на шесть семейств. В высших растениях, встречаются представители трех семейств: альфа, бета и гамма (Moroney et al., 2001). В 2000 году был расшифрован геном Ага-bidopsis thaliana, и было установлено, что в нем содержится 19 генов, кодирующих карбоангидразы, часть из которых с большей или меньшей точностью были найдены как находящиеся в плазмалемме, цитоплазме, митохондриях и хлоропластах (Fabre et al., 2007). В настоящее время хорошо изучена КА стромы хлоропластов, которая является самым распространенным после Рубиско белком в клетке и одним из основных компонентов растворимого белка листьев (0,5-2% от общего количества) (Badger, Price, 1994). Данная КА является также одной из самых активных КА. Это явилось причиной того, что долгое время существование КА в тила-коидах подвергалось сомнению из-за вероятности загрязнения их при выделении этим ферментом. Первые свидетельства присутствия К А в тила-коидах были получены в работе Комаровой с соавт. (1982) при исследовании хлоропластов бобов. В последующие годы наличие тилакоидных КА
в высших растениях неоднократно подтверждали (Stemler, 1986; Пронина с соавт., 2002; Москвин с соавт., 1995). К настоящему времени имеется много данных в пользу того, что карбоангидразная активность тилакоидов гетерогенна, т.е. обусловлена присутствием нескольких носителей этой активности (Lu, Stemler, 2002; Игнатова с соавт., 2006; Rudenko et al., 2007; Шитов с соавт., 2009).
Существует достаточно много более или менее обоснованных гипотез о роли тилакоидных КА, прежде всего, об их участии в процессах, связанных с фотосинтезом (Ivanov et al., 2006). Предполагается, что эти ферменты могут участвовать как в метаболизме углерода, так и в процессе транспорта электронов. В последнем случае предполагается их участие в поставке бикарбоната как на акцепторной (Van Rensen, 1988), так и на до-норной стороне фотосистемы 2 (Allahverdiev et al., 1997; Klimov & Bara-nov, 2001). Рассматривается также участие КА в удалении протонов, образующихся при окислении воды и способных существенно понизить рН вблизи водоокисляющего комплекса (Villarejo et al., 2002). Без сведений о природе, количестве, свойствах и расположении КА в ти-лакоидах трудно обоснованно предполагать их функции. Однако эти сведения до сих пор довольно фрагментарны и сводятся к отдельным свидетельствам, полученным в ряде, хотя и важных, но изолированных работ. Наше исследование посвящено, прежде всего, выяснению местонахождения тилакоидных КА, установлению их природы и некоторых свойств. Оно выполнено на арабидопсисе, что дало возможность использовать некоторые его мутанты с нокаутированными генами карбоангидразы.
Целью работы было изучение тилакоидных карбоангидраз A. thaliana. В процессе работы решались следующие задачи:
-
Подобрать условия выделения из листьев A thaliana тилакоидов и обогащенных фотосистемой 1 или фотосистемой 2 тилакоидных мембран, сохраняющих карбоангидразную активность.
-
Исследовать характеристики карбоангидразной активности тилакоидных мембран, обогащенных фотосистемой 1 (ФС1) или фотосистемой 2 (ФС2).
-
Выделить носители карбоангидразной активности из тилакоидных мембран, обогащенных ФС1 или ФС2, и исследовать их характеристики.
-
Выделить и охарактеризовать карбоангидразу тилакоидного люмена растений дикого типа и мутантных растений с нокаутированным геном, кодирующим стромальную бета-КА1.
Научная новизна работы. Подобраны условия выделения: использование детергента додецилмальтозида, повышенной концентрации ионов
магния, соответствующих скоростей центрифугирования, - и выделены фрагменты тилакоидных мембран арабидопсиса, обладающие карбоан-гидразной активностью и обогащенные ФС1 или ФС2. Выделены и очищены мембраносвязанные носители карбоангидразной активности, расположенные в тилакоидной мембране вблизи ФС1 и ФС2, и установлено, что они различаются по своим свойствам. Доказано, что в люмене тила-коидов находится ранее неизвестный носитель карбоангидразной активности, водорастворимый белок.
Практическая значимость работы. Результаты работы дают новую информацию о карбоангидразной системе тилакоидов высших растений, позволяя приблизиться к пониманию роли этих КА в фотосинтезе. Данные, полученные при изучении тилакоидных КА арабидопсиса, могут быть использованы для идентификации генов, кодирующих КА тилакоидов других растений, что даст возможность изменять активность этих генов в культурных трансгенных растениях с целью повышения их устойчивости или урожайности. Кроме того, идентификация указанных генов позволит получать методами генной инженерии их продукты, что, учитывая имеющуюся в литературе информацию о термостабильности и устойчивости низкомолекулярной КА, расположенной вблизи ФС2, открывает возможность использования этого фермента в биотехнологических процессах, связанных с большими потоками углерода.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе», (Пущино, 2008), международной конференции «Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений» (Екатеринбург, 2008), Российской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах» (Пущино, 2009), 14-ая Международная пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), VI Съезд Российского фотобиологического общества (Шепси, 2011), VII Съезд общества физиологов растений (Нижний Новгород, 2011), 17 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2013), Международная научно-методическая конференция «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы» (Воронеж, 2013).
Личный вклад соискателя. Исследования по теме диссертации были проведены соискателем самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке полученных результатов и формулировании выводов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи: 1 в реферируемом научном российском журнале (в печати), 1 в реферируемом зарубежном журнале и 11 в материалах конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 страницах, содержит 6 таблиц, 39 рисунков. Список литературы содержит 236 источников.
