Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ВЛИЯНИЕ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 9
1.1. Воздействие углеводородов нефти на почву 14
1.2. Влияние нефтяного загрязнения на растения 21
1.3. Использование растительных тест-систем в оценке токсичности химических загрязнений 27
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
2.1. Объекты исследования , 33
2.2. Методы исследования 41
2.2.1, Методика работы с Tradescantia (clon 02) 41
2.2.2. Условия выращивания растений Arabidopsis thaliana 46
ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 53
3.1. Частота нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02), выращиваемой на почве с различных участков Верхневозейского нефтяного месторождения Усинского района 54
3.2, Частота нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02), выращиваемой на почве пермокарбоновой залежи Усинского нефтяного месторождения 66
ГЛАВА 4. ВОЗДЕЙСТВИЕ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ, НА РАСТЕНИЯ TRADESCANTIA (CLON 02) Я ARABIDOPSIS THALIANA 78
4.1. Влияние нефтяного загрязнения почвы на частоту нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02) 78
4.2. Влияние нефтяного загрязнения на рост и развитие растений Arabidopsis thaliana 91
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ БЕНЗИНА НА РАСТЕНИЯ 96
5.1. Влияние бензина на Tradescantia (clon 02) 97
5.2. Влияние бензина на Arabidopsis thaliana 112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117
ВЫВОДЫ U9
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 120
- Воздействие углеводородов нефти на почву
- Частота нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02), выращиваемой на почве с различных участков Верхневозейского нефтяного месторождения Усинского района
- Влияние нефтяного загрязнения почвы на частоту нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02)
Введение к работе
Актуальность темы. Среди современных проблем человечества в последние десятилетия все чаще особое внимание уделяется состоянию окружающей природной среды. Происходит повсеместное загрязнение среды обитания различными мутагенными веществами, истощение природных ресурсов и преобразование ландшафтов, использование новых технологий и химических соединений инициирует процессы разрушения природы. Большой вклад в загрязнение среды в Республике Коми вносит нефть и продукты ее переработки. Загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами вызывает нарушение динамического равновесия в экосистеме вследствие изменения структуры почвенного покрова, геохимических свойств почв, а также токсического действия на растения. В районах добычи и транспортировки нефти возникают зоны перестройки исходных экосистем (Андресон, 1980). В связи с этим возникает необходимость оценки состояния биоты в этих зонах.
В последнее время все чаще для индикации загрязняющих веществ в окружающей среде применяют биологические системы. Реакция организма позволяет оценить воздействие на среду обитания в показателях, имеющих биологический смысл, а нередко и таких, которые можно перенести на человека. Физические факторы или химические соединения, воздействуя на среду, иногда очень сильно модифицируются факторами живой и неживой природы; их окончательное влияние не всегда легко предвидеть. А биоиндикаторы дают точную, интегральную картину, учитывающую и те загрязнения, которые могла пропустить контрольная служба, время от времени производящая замеры параметров среды (Биоиндикация загрязнений наземных экосистем, 1988).
Широкое применение нашли такие растительные тест-объекты, как табак, виноград, фасоль, шпинат, петуния, ячмень, кукуруза, некоторые хвойные и т.д. Каждая растительная тест-система имеет как свои преимущества, так и недостатки. Важно знать их и уметь наиболее правильно применять разнообразные растения для выполнения поставленных целей. Tradescantia (clon 02) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. отличаются высокой чувствительностью к стрессовым воздействиям физической и химической природы. Они широко применяются во всем мире для
тестирования мутагенных веществ, но при оценке нефтяных загрязнений используются впервые.
Целью исследования было изучение последствий нефтяного загрязнения почвы для растений {Tradescantia (don 02) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.)
В связи с этим были поставлены следующие задачи;
Исследование частоты нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02), выращиваемой на нефтезагрязненной почве (Верхневозейского нефтяного месторождения, пермокарбоновой залежи Усинского нефтяного месторождения);
Изучение влияния нефтяного и бензинового загрязнения на частоту нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02);
Анализ всхожести, роста и развития растений Arabidopsis thaliana, выращиваемых в почве с различной концентрацией нефтяного и бензинового загрязнения;
Научная новизна.
Впервые изучено влияние нефтяного и бензинового загрязнения почвы на высокочувствительные растительные тест-объекты Tradescantia (clon 02) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Показано, что нефтяное и бензиновое загрязнение почвы в концентрации до I % оказывает стимулирующее действие на всхожесть семян Arabidopsis thaliana, которая увеличивается на 9-27 %. При дальнейшем увеличении концентрации нефти и бензина всхожесть семян снижается.
Установлено генотоксическое действие нефти и бензина для растений Tradescantia (clon 02). Оно выражается в достоверном увеличении нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02): соматических мутаций, белых мутантных событий, угнетения клеточного деления и морфологических аномалий. Обнаружена нелинейная зависимость выхода этих нарушений от степени воздействия нефти и бензина. Показано достоверное увеличение всех нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02) в диапазоне относительно низких концентраций нефти (от 0,25 до 1,9 %) и бензина (от 0,1 до 1,5 %).
Теоретическое и практическое значение.
Результаты исследования могут быть использованы при разработке рекомендаций по снижению уровня загрязнения нефтью в принимаемых после очистки и рекультивации землях. Результаты работы используются в лекционных курсах по специальности «экология» СыктГУ.
Положение, выносимое на защиту
Уровень генетических и морфологических изменений у растений, индуцированный нефтью и ее производными, нелинейно зависит от концентрации действующего агента.
Апробация работы. Результаты исследований неоднократно докладывались на молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2000, 2002, 2003, 2005); на студенческой научной конференции «Человек и окружающая среда» (Сыктывкар, 2000, 2002); на научно-практической конференции «Молодые исследователи - Республике Коми» (Сыктывкар, 2001); на XI международном симпозиуме по биоиндикаторам (Сыктывкар, 2001); на II и Ш научно-практической конференции «Экологические работы на месторождениях нефти Тимано-Печорской провинции. Состояние и перспективы» (Усинск, 2002; Ухта, 2004); на всероссийской научной школе «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: научный и образовательный аспекты» (Киров, 2003); на всероссийском популяционном семинаре «Методы популяциошюй биологии» (Сыктывкар, 2004).
Публикации. Автором опубликовано 12 работ по материалам диссертации.
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за помощь и консультации при выполнении и написании данной работы своему научному руководителю д.б.н., проф. В.Г. Зайнуллину, а также старшему научному сотруднику Института биологии КНЦ УрО РАН к.б.н. М.Ю. Маркаровой и начальнику отдела Центра Госсанэпиднадзора РК А.И. Рымарю за предоставление природных почвенных образцов для исследования.
Воздействие углеводородов нефти на почву
Почвы вместе с организмами образуют сложные экологические системы, которые выполняют в биосфере планеты важнейшие функции, обеспечивающие само существование жизни. Эти функции заключаются, во-первых, в непрерывно текущем процессе биогенного накопления, трансформации и перераспределения энергии, поступающей от Солнца на Землю; во-вторых, в поддержании на Земле общемирового круговорота химических элементов (Ковда, 1975; Мониторинг..., 1995).
При характеристике почв очень трудно использовать широко применяемые при оценке воды, воздуха, продуктов питания и кормов, понятия, например, предельно допустимые концентрации тех или иных загрязняющих веществ. В числе главных причин - многообразие форм соединений любых элементов и веществ в почвах, от которых зависит доступность этих компонентов растениям и, следовательно, их возможный токсический эффект (Временные методические рекомендации..., 1983).
Основными загрязнителями почвы в районе проведения буровых работ являются нефтяные углеводороды, минерализованные пластовые воды, химреагенты, буровые растворы (Карток, Лысенин, 1995; Экологический..., 1995). Химическое загрязнение почвы негативно влияет на её физические, химические, ионообменные свойства и биологическую активность. Загрязнение почв оказывает неблагоприятное воздействие на здоровье населения, так как вредные вещества по трофическим цепям могут попадать в организм человека (Экологическое состояние территории России, 2001).
Для определения степени загрязненности почв нефтепродуктами существует градация, разработанная Ю.И. Пиковским. Согласно данной шкале нормирования, концентрации от 100 до 500 мг/кг можно считать повышенным фоном. Нефтепродукты в таких количествах активно утилизируются микроорганизмами или вымываются дождевыми потоками без вмешательства человека. Загрязненными можно считать почвы, содержащие более 500 мг/кг нефтепродуктов. При этом содержания от 500 до 1000 мг/кг относятся к умеренному загрязнению, от 1000 до 2000 - к умеренно опасному загрязнению, от 2000 до 5000 мг/кг - к сильному, опасному загрязнению и свыше 5000 мг/кг - к очень сильному загрязнению, подлежащему санации (Пиковский, 1993).
Попав в почву, нефть и нефтепродукты опускаются вниз под действием капиллярных и поверхностных сил. При вертикальном продвижении вдоль почвенного профиля создается хроматографический эффект, приводящий к дифференциации состава нефти и нефтепродуктов. В верхнем, гумусовом горизонте собираются высокомолекулярные компоненты, содержащие смолисто-асфалътеновые вещества и полициклические соединения. В нижние горизонты проникают, а основном, низкомолекулярные соединения, характеризующиеся более высокой растворимостью в воде и диффузной способностью. В кислой фракции высоковязких нефтей вместе с карбоновыми кислотами содержаться также фенолы, крезолы и их производные (Гончаров, 1987; Елин, 2000). Важнейшей биосферной функцией фенолов является связывание ими токсичных веществ - тяжелых металлов, пестицидов, радиоактивных элементов, в результате чего происходит снижение токсичности связанных веществ и в той или иной мере изменяется характер их поведения (Елин, 1997).
При проливах нефти и нефтепродуктов на поверхности земли одновременно начинают протекать два процесса; испарение углеводородов в атмосферу и фильтрация топлива вглубь почвы. Скорость процесса испарения определяется физико-химическими свойствами нефти и нефтепродуктов и температурой окружающей среды. Интенсивность проникновения нефтяного топлива вглубь почвы будет зависеть от структуры почвы и свойств нефти и нефтепродуктов, в первую очередь от вязкости и от содержания высокомолекулярных смолисто-асфальтеновых соединений (Фильченкова, 1982; Демурджан, 1985).
Нефть, попадая в почву, существенным образом изменяет ее физические и агрохимические свойства. Она обладает ярко выраженными гидрофобными свойствами, которые передаются почвенным частицам. С ростом нефтяного загрязнения влажность почвы закономерно возрастает. Причиной этого является снижение транспирации влаги через вышележащий слой загрязненной нефтью почвы (Солнцева, 1982; Звягинцев, 1987).
Уже через три дня после разлива нефти активность окислительно-восстановительных ферментов в почве достоверно снижается. Эти изменения сохраняются и через год после загрязнения.
К снижению дегидрогеназной активности приводит значительное увеличение отношения C:N. Низкая активность ферментов объясняется также токсичностью нефти для микроорганизмов, являющихся основным источником продуцирования ферментов (Квасников, Клюшникова, 1981). Загрязнение почвы нефтью ведет к исчезновению нитрата азота и подвижного фосфора. Обусловлено это как подавлением жизнедеятельности нитрифицирующих бактерий, развитие которых угнетается избытком углеродсодержащих соединений и продуктов их распада, так и сдвигом соотношения C:N, приводящим к иммобилизации неорганического фосфора в почве и уменьшению количества экстрагируемого фосфора (Влияние..., 1988). Процесс нитрификации ингибируется любой концентрацией углеводородов; нитрификация является наиболее чувствительным процессом на "нефтяное" загрязнение почвы (Биологическая активность..., 1998).
В то же время нефть, как сложное органическое вещество, попадая в окружающую среду, сама не остается без изменений, а под действием многочисленных факторов постепенно претерпевает существенные преобразования. Попадая на земную поверхность, нефть оказывается в качественно новых условиях существования: из сугубо анаэробной обстановки с очень замедленными темпами процессов она попадает в аэрируемую среду. В первое время после разлива нефти происходит интенсивное испарение легких фракций. Нефть быстро теряет низкомолекулярные алканы и легколетучие ароматические вещества. При этом содержание высокомолекулярных алканов (с числом атомов углерода более 20) и алкизамещенных нафтелинов фенантренов очень медленно приближается к фоновому содержанию.
В самоочищении почвы от нефтяного загрязнения, помимо абиотических геохимических факторов огромную роль играют биогеохимические факторы и, прежде всего, деятельность микроорганизмов (Глазовская, Пиковский, 1980).
Главным окисляющим агентом в условиях земной поверхности является молекулярный кислород. Окисление углеводородов молекулярным кислородом как в химических, так и в биохимических реакциях происходит по одному и тому же механизму и приводит к одинаковым результатам. В первую очередь разрушаются связи с наименьшей энергией разрыва, наиболее доступные для окисления.
В первые недели и месяцы после загрязнения происходят в основном абиотические изменения нефти в почве. Идет стабилизация потока, частичное рассеяние, понижение концентрации, что дает возможность микроорпшизмам адаптироваться, перестроить свою функциональную структуру и начать активную деятельность по окислению углеводородов. Содержание нефти в почве резко снижается в первые месяцы после загрязнения на 40-50 %. В дальнейшем это снижение идет очень медленно. Из абиотических факторов процесса на поверхности земли главная роль принадлежит ультрафиолетовому излучению. Фотохимические процессы могут разлагать даже наиболее стойкие полициклические углеводороды за несколько часов. Внутри почвенного профиля фотохимические процессы практически не идут, главная роль в окислении углеводородов здесь принадлежит биологическому окислению. Самоочищение почвы от нефти сводится к двум процессам: минерализация и гумификация. В обоих процессах ведущим является биологический фактор. При поступлении нефти в почву возникают две разнонаправленные группы процессов:
а) микробиологическая деструкция нефти и её физико-химическое выветривание, в результате чего происходит трансформация исходного состава загрязнителя, частичная утилизация входящих в него органических веществ и их разложение до конечных продуктов, что способствует постепенной потере привнесенного органического углерода;
б) взаимодействие нефти с почвенными органическими соединениями, что приводит к изменению группового состава гумуса и закреплению в почвах привнесенного органического углерода.
Специфика превращений нефти в почве в значительной мере связана с судьбой почвенного гумуса. Эта связь проявляется не только в известной способности гумусовых веществ сорбировать в своем комплексе отдельные чужеродные молекулы, но и в химических реакциях прочного связывания, сополимеризации окисленных нефтяных компонентов. Будучи вовлеченными в структуру почвенного гумуса, эти компоненты становятся недоступными для общепринятых методов нефтяного мониторинга, основанных на определении подвижных соединений методами молекулярного и группового анализа.
Частота нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02), выращиваемой на почве с различных участков Верхневозейского нефтяного месторождения Усинского района
При выращивании традесканции (клон 02) на почве, отобранной с различных участков Верхневозейского месторождения Усинского района, характеристика которых приведена в таблице 1, были получены следующие результаты. Динамика изменчивости традесканции (клон 02), растущей в почве с различной степенью загрязненности нефтью, приведена в следующих таблицах (табл. 8-13).
Количество нарушений в волосках тычиночных нитей в какой-то степени зависит от времени начала воздействия фактора. В вариантах 1 и 2 почвенные образцы не были загрязнены нефтепродуктами, и поэтому динамика изменчивости традесканции (клон 02) носит там случайный характер (табл. 8, 9). В третьем варианте (табл. 10) четко выделяются два периода всплеска всех нарушений, особенно морфологических аномалий: 9-14 дней и 25-31 день. В четвертом варианте (табл. 11) тоже есть периоды увеличении числа нарушений, но они не всегда совпадают у разных видов нарушений. Так, большой всплеск морфологических аномалий наблюдается на 7-8 день, а угнетения клеточного деления на 11-15. Заметное повышение числа соматических мутаций происходит, как и в третьем варианте, на 25-30 день. В пятом варианте (табл. 12) повышение морфологических аномалий происходит на 8-9 день, а соматических мутаций на 13-16 и 32-36 день. В шестом варианте (табл. 13) число морфологических аномалий повышается на 9-11 день, угнетения клеточного деления на 14-16 день. Число соматических мутаций довольно высокое в течение всего периода наблюдения, это может быть связано с высокой концентрацией загрязнения в этом варианте. В целом, можно выделить следующие периоды повышения нарушений: для морфологических аномалий - 7-14 дней, для угнетения клеточного деления - 10-15 дней, для соматических мутаций - 10-15 дней и 25-32 дня.
Влияние нефтяного загрязнения почвы на частоту нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (clon 02)
В таблицах 24-31 приведены данные по динамике изменчивости традесканции (клон 02), растущей в почве в лабораторных условиях загрязненной нефтью. Анализируя эти данные можно заметить, что в определенные периоды происходит повышение уровня нарушений. Увеличение числа соматических мутаций наблюдается в два периода: 18-22 дня и 34-38 дней, которые особенно заметны в вариантах 2, 4 и 5. В других вариантах их трудно заметить из-за небольшой выборки.
Уровень морфологических аномалий наибольший в первые две недели исследований, примерно в период с 6-го по 18-й день. Другие нарушения, такие как белые мутантные события и угнетение клеточного деления не имеют явно выраженных повторяющихся периодов повышения их выхода, возможно, это связано с небольшой выборкой.
Частота соматических мутаций изменялась нелинейно в пределах от 0,07 до 0,32 % (рис. 15). И только в двух вариантах (1 и 1,9 %) она была достоверно выше контроля в 3,5-4 раза (р 0,05).
Показатель белые мутантные события (рис. 16) также сильно варьирует от 0,18 до 0,58 %. Достоверное повышение частоты БМС наблюдается при концентрации нефти 0,25 и 7,5 % (р 0,05). Как уже упоминалось выше, появление белых и розовых клеток связано с ингибированием выработки одного (доминантного голубого) или двух (голубого и розового) пигментов. Поэтому концентрации нефти (в среднем от 0,25 до 1,9%), при которых повышается уровень этих нарушений, являются более мутагенными для растений. В последнее время широко изучается нелинейная зависимость воздействия малых доз радиации. Показано, что облучение в малых дозах радиации может обладать более сильным мутагенным эффектом, чем облучение в некоторых высоких дозах (Зайнуллин, 1998).
