Введение к работе
Актуальность проблемы. Сахароза - один из основных природных продуктов. Являясь ключевым углеводом растений и цианобактерий, сахароза может синтезироваться двумя путями: с помощью последовательного действия сахарозофосфатсинтазы (SPS) и сахарозофосфатфосфатазы (SPP) с образованием интермедиата сахарозо-6-фосфата или напрямую, под действием сахарозосинтазы (SuS), которая также участвует в деградации этого дисахарида. В настоящее время выделены и охарактеризованы ферменты, участвующие в синтезе сахарозы у высших растений и цианобактерий – сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза и сахарозосинтаза [Lunn, MacRae, 2003; Hagemann, 2011].
Биосинтез сахарозы - довольно редкое явление у протеобактерий, реализуется у галофильных аэробных метилотрофов с рибулозомонофосфатным (РМФ) путем С1-ассимиляции [Khmelenina et al., 1999; Троценко, Хмеленина, 2008], а гомологи генов биосинтеза сахарозы найдены также в геномах хемоавтотрофов Nitrosomonas europaea, Magnetococcus sp. MC-1, Acidithiobacillus ferrooxidans [Norton et al., 2008]. Однако распространение пути биосинтеза сахарозы и функциональная роль дисахарида в клетках метилотрофов и других протеобактерий не исследованы.
Априорно сахарозе отводится роль запасного соединения, накопление которого при различных стрессовых воздействиях указывает на защитную функцию, аналогичную таковой, показанной для трегалозы [Lunn, 2002]. Так, выживаемость клеток Escherichia coli, несущих ген сахарозофосфатсинтазы, возрастала в 104 раз [Billi et al., 2000]. Недавно показано, что сахароза выполняет функцию термопротектора у умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12 [Медведкова и др., 2007]. Однако до сих пор гены и ферменты биосинтеза сахарозы не охарактеризованы ни у одного представителя протеобактерий. Пути метаболизма сахарозы изучены лишь у не синтезирующих сахарозу гетеротрофов, но использующих ее в качестве ростового субстрата - Zymomonas mobilis [Zembrzuski et al., 1992], Lactococcus lactis [Thompson et al., 1991] и E. сoli [Sigrell et al., 1998]. У этих бактерий гены, кодирующие ферменты метаболизма сахарозы, локализованы в кластерах, включающих также гены транспортных белков [Reid, Abratt, 2005]. В связи с вышеизложенным, представлялось актуальным исследовать гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобактерий на примере галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы – определение путей метаболизма сахарозы у модельного галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:
-
Идентификация генов, участвующих в метаболизме сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z.
-
Очистка и характеристика рекомбинантных сахарозофосфатфосфатазы, амилосахаразы и фруктокиназы из Mm. alcaliphilum 20Z.
-
Получение и фенотипическая характеристика мутантов по генам sps и ectBC.
-
Изучение распространенности и филогенетический анализ генов метаболизма сахарозы у прокариот.
Научная новизна. Гены метаболизма сахарозы, организованные в трех- и четерыхгенные кластеры, обнаружены у различных групп микроорганизмов – протеобактерий (хемоавтотрофов и метилотрофных бактерий) и цианобактерий. Филогенетический анализ показал, что данные кластеры были приобретены путем горизонтального переноса генов. Установлено, что сахароза выполняет роль осмопротектора у Mm. alcaliphilum 20Z. Получен мутантный штамм, дефектный по генам биосинтеза эктоина ectB и ectC, который накапливает в 8 раз больше сахарозы по сравнению с исходным штаммом. Также получен мутант по гену sps, не способный синтезировать сахарозу, что подтверждает ключевую роль сахарозофосфатсинтазы в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. Впервые у протеобактерий очищены до электрофоретической гомогенности и охарактеризованы рекомбинантные сахарозофосфатфосфатаза, амилосахараза и фруктокиназа. Доказана котранскрипция генов ams и fruK, что подтверждает участие фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образующейся при деградации эндогенной сахарозы.
Научно-практическое значение.
Благодаря высокой активности, стабильности и строгой специфичности к фруктозе препарат очищенной рекомбинантной фруктокиназы может использоваться в биохимических исследованиях в качестве сопрягающего фермента, а также для аналитического определения фруктозы. Мутант с инактивированным геном sps при выращивании на среде с высоким содержанием NaCl имеет больший, по сравнению с родительским штаммом, выход мультифункционального биопротектора эктоина, что может найти практическое применение.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2010-2012гг), на XV и XVI Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011-2012 гг), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» (Тула, 2011 гг), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011-2012 гг).
Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398). Работа была поддержана грантами РФФИ №10-04-01224-а, 11-04-97544-р_центр_а.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисов.
Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к.б.н., с.н.с. Решетникову А.С., к.б.н. Розовой О.Н., к.б.н., н.с. Мустахимову И.И., к.б.н., н.с. Федорову Д.Н., к.т.н., с.н.с. Ежову В.А. Особую признательность автор выражает своим научным руководителям д.б.н., в.н.с. Хмелениной В.Н. и д.б.н., проф. Троценко Ю.А.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 212 ссылок, из них 8 на русском и 204 на английском языках, содержит 9 таблиц и 44 рисунка.
