Введение к работе
Актуальность темы. По данным ВОЗ ежегодно в мире заболевают туберкулёзом 9,4 миллиона и умирают 1,3 миллиона человек (http://www.who.int/tb/publications/global_report/2010/en/index.html). Заболеваемость туберкулёзом органов дыхания в России в 2010 году составила 67,31 на 100 тысяч населения (http://12.rospotrebnadzor.ru/diretions/profilaktika/48877/). Одной из основных проблем, связанных с лечением больных туберкулёзом, является рост распространенности лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулёза (МБТ), достигающей в России 30% у больных с впервые выявленным туберкулёзом легких и 60% у больных с рецидивами (Стрелис и соавт., 2009). Распространение устойчивых штаммов МБТ требует усиления режимов терапии, что приводит к росту числа побочных реакций на противотуберкулезные препараты (ПТП). Наиболее частыми побочными реакциями является гепатотоксические (ГТР), их частота развития достигает 47% (Huang, 2007). Проявления ГТР варьируют от повышения уровня трансаминаз до развития тяжелого гепатита, заканчивающегося смертельным исходом (Полунина, 2005). Поражения печени c функциональной недостаточностью часто развиваются на фоне дозозависимого повышения уровня трансаминаз (Russmann et al., 2009). При исследовании причин возникновения ГТР большое внимание придаётся метаболизму ПТП. Биологические эффекты химических соединений в значительной мере зависят от их структурных изменений, возникающих в результате метаболизма. Последний, осуществляемый ферментами биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), характеризуется большой межиндивидуальной вариабельностью, достигающей 103-104 (Guengerich, 2003), которая главным образом обусловлена генетическим полиморфизмом ФБК. Поэтому прилагаются активные усилия по поиску полиморфных вариантов генов ФБК, обусловливающих риск побочных эффектов лекарств.
Изониазид является основным препаратом при лечении туберкулеза. В его метаболизме важную роль играет N-ацетилтрансфераза 2 (NAT2). Большинство исследователей сходятся во мнении, что пациенты с генотипом медленного ацетилирования более предрасположены к ГТР, по сравнению с быстрыми ацетиляторами (Ohno et al., 2000; Huang et al., 2002; Higuchi et al., 2007; Lee et al., 2010). Тем не менее, существуют работы, обозначившие фенотипически быстрых ацетиляторов как группу риска развития ГТР при лечении туберкулеза (Mitchell et al., 1976), либо не обнаружившие ассоциаций с генотипом NAT2 (Roy et al., 2001; Yamada et al., 2009). Противоречия могут быть следствием популяционных различий и внешних условий, поэтому необходимо анализировать эти ассоциации в каждой конкретной популяции. Кроме того, показано неполное соответствие генотипа NAT2 фенотипу ацетилирования (Cascorbi et al., 1995, Le Marchand et al., 1996). Поэтому существует проблема выбора между генетическими и фенотипическими маркерами в прогнозировании ГТР.
Кроме NAT2 важную роль в метаболизме изониазида играет цитохром P450 2E1 (CYP2E1). CYP2E1 окисляет метаболит изониазида – ацетилгидразин – с образованием токсических метаболитов (Roy, 2008). Показана связь отдельных полиморфизмов CYP2E1 с ГТР. Однако имеющиеся в литературе данные противоречивы (Huang et al., 2003; Bose et al., 2010), а в популяциях России эта связь остается неизученной.
Поскольку образование реактивных метаболитов и вызываемый ими окислительный стресс в клетках печени является конечным результатом взаимодействия противотуберкулёзных препаратов с ФБК, большую роль в защите от гепатотоксичности могут играть ферменты антиоксидантной защиты, в частности, глутатион S-трансферазы (GST). Из экспрессируемых в печени изоферментов GST потенциально важными могут быть GSTM1 и GSTT1, для которых описан нуль-полиморфизм, проявляющийся полным отсутствием белков (Seidegrd et al., 1988; Pemble et al., 1994). Также важна GSTA2 как представитель наиболее экспрессируемого в печени подсемейства (более 3 % цитозольного белка), для которой установлен полиморфизм, проявляющийся изменением экспрессии (Ning, 2004), и GSTP1, представленная в печени в небольшом количестве (Nishimura et al., 2006), но играющая важную роль в регуляции ответа организма на окислительный стресс и апоптоза через пути сигнальной трансдукции. (Adler et al., 1999; Bernardini et al., 2000). В литературе мы не обнаружили исследований связи полиморфизма GSTA2 и GSTP1 с токсичностью ПТП, а полиморфизм GSTA2 в популяциях России не определялся вообще. В немногочисленных работах по изучению связи с гепатотоксичностью ПТП нуль-полиморфизма GSTM1 и GSTT1 авторы выявляют ассоциации либо для делеции GSTM1 (Roy et al., 2001; Huang. et al., 2007), либо GSTT1 (Leiro et al., 2008).
Таким образом, развитие ГТР зависит от функционального взаимодействия ферментов, участвующих в наработке токсических метаболитов и детоксификации их и/или устранении последствий вызванного ими окислительного стресса. Изучение роли фармакогенетических и фенотипических особенностей пациента расширит возможности прогнозирования и профилактики лекарственных осложнений при терапии туберкулеза.
Цель исследования - выявление полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в биотрансформации противотуберкулёзных препаратов и антиоксидантной защите, а также особенностей фармакокинетики, ассоциированных с гепатотоксическими реакциями при лечении больных туберкулёзом.
Задачи:
-
Охарактеризовать активность N-ацетилтрансферазы 2 и амидазы по фармакокинетике изониазида и пиразинамида у больных туберкулёзом легких.
-
Определить частоты полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1, GSTP1 в исследуемой выборке больных.
-
Определить соотношение генотипов NAT2 и фенотипов ацетилирования.
-
Проанализировать связь сывороточных активностей аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы с фармакокинетическими параметрами изониазида и пиразинамида.
-
Проанализировать связь полиморфных вариантов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTM1, GSTT1 и GSTP1 с повышением уровней аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы.
Научная новизна исследования. Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов 63G>C 5 экзона, 83A>C 7 экзона гена GSTA2 и -71G>T, C>T (F421F) гена CYP2E1.
Предложен новый метод определения полиморфизмов 313A>G и 341C>T гена GSTP1 с использованием аллель-специфичной ПЦР с последующим ПДРФ-анализом. Данный метод позволяет определить сцепление локусов 313 и 341. Разработаны новые способы определения полиморфизмов 63G>C 5 экзона, 83A>C 7 экзона гена GSTA2 и -71G>T, 7632T>A , C>T (F421F) гена CYP2E1 c помощью ПДРФ-анализа. Предложен новый способ определения полиморфизма 341T>C гена NAT2 с использованием аллель-специфичной ПЦР.
Впервые путем анализа связи полиморфных вариантов генов ферментов, участвующих в метаболизме противотуберкулезных препаратов и антиоксидантной защите с гепатотоксическими реакциями в условиях интермиттирующего и ежедневного приема ПТП показано, что эта связь меняется в зависимости от режима терапии. Впервые в мире показано, что генотип 63СС 5 экзона GSTA2 предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций при интермиттирующем приеме противотуберкулезных препаратов, при ежедневном приеме этот генотип напротив связан с устойчивостью к развитию гепатотоксических реакций. Впервые в мире показано, что генотип GSTP1*A/B предрасполагает к развитию гепатотоксических реакций у больных с интермиттирующим режимом терапии, при ежедневном режиме терапии этот генотип не проявляет себя. Впервые в России показано, что генотип СYP2E1*7632TA связан с усилением гепатотоксических реакций. Также впервые в России показано, что гомозиготная делеция GSTT1 предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов при их ежедневном приеме.
Практическая значимость работы. Предложены новые способы определения полиморфизмов генов NAT2, CYP2E1, GSTA2, GSTP1, которые могут применяться в исследованиях, связанных с изучением функциональных проявлений полиморфизмов, а также в популяционно-генетических и генетико-эпидемиологических исследованиях.
Найденные достоверные ассоциации генетических и фенотипических маркеров с гепатотоксическими реакциями при лечении туберкулёза могут быть использованы для прогнозирования и профилактики лекарственного поражения печени у пациентов с интермиттирующим и ежедневным режимом терапии. Результаты работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Медленный метаболизм пиразинамида и изониазида предрасполагает к гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов при ежедневном режиме терапии.
-
Носители генотипов NAT2, кодирующих фенотип медленного ацетилирования, и генотипа -7632TA CYP2E1 более подвержены гепатотоксическому действию противотуберкулёзных препаратов.
-
Наличие полиморфных вариантов генов глутатион S-трансфераз, уменьшающих их экспрессию и активность, усиливает гепатотоксическое действие противотуберкулёзных препаратов. Их значение более выражено при интермиттирующем приеме и уменьшается при увеличении дозовой нагрузки при ежедневном приеме.
-
Сочетание полиморфных вариантов N-ацетилтрансферазы 2 и цитохрома Р450 2Е1, усиливающих генерацию токсичных метаболитов противотуберкулёзных препаратов и вариантов глутатион S-трансфераз A2 и P1, ослабляющих антиоксидантную защиту, способствует развитию гепатотоксических реакций.
Апробация работы. Материалы исследования были представлены на 3-й международной конференции «Basic Science for Medicine», (Новосибирск, 2007); на XII Международной Экологической Студенческой Конференции «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2007); на XLVI Международной Научной Студенческой Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); на конференции «Ehrlich II - 2nd World Conference on Magic Bullets» (Nurnberg, 2008); на научно-практической конференции с международным участием, посвященной 25-летию кафедры клинической фармакологии ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава (2 тезиса, Москва, 2009); на межрегиональной научно-практической конференции «Молекулярные основы персонификации лекарственной терапии» (Новосибирск, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 в рекомендованных ВАК журналах и 1 статья в сборнике.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы и список литературы, включающий 28 отечественных и 206 иностранных источников. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 рисунками, содержит 27 таблиц.
