Введение к работе
Актуальность темы. Множественная лекарственная устойчивость
(МЛУ) - это устойчивость клеток опухоли к целому ряду
химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с
разным механизмом действия (Roninson LB. et al, 1986 Ставровская A.A.,
2002). Феномен лекарственной устойчивости достаточно хорошо
продемонстрирован и изучен на опухолевых клеточных линиях (Riordan J.R. et al, 1985; Shen D.W. et al, 1986), однако клинические исследования лекарственной устойчивости опухоли выявили ряд проблем, одной из которых является большое количество механизмов, лежащих в ее основе (Chan H.S. etal, 1991; Finnegan М.С. etal, 1995; Ribrag V., etal, 1996; Zhan Z. et al, 1997; Webb M. et al, 1998; Filipits M. et al, 2000; Concoli U. et al, 2002).
В последние годы выявляется все больше новых белков, которые могут способствовать устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии. Транспортные белки семейства ABC насчитывают в настоящее время 49 членов, и для десяти из них уже показано участие в формировании устойчивости клеток к химиопрепаратам (Dean, М. et al., 2001). Наиболее изученными представителями этого семейства являются Р-гликопротеин (Р-gp) и MRP1. Исследования экспрессии разных транспортных белков семейства ABC в различных опухолях продемонстрировали, что в одной и той же опухоли могут экспрессироваться одновременно несколько ABC транспортеров, а также возможна экспрессия одного из них. Нередко гиперэкспрессию генов, связанных с лекарственной устойчивостью, обнаруживают в нелеченных опухолях; это чаще всего связано с типом клеток, из которых происходят данные новообразования. Однако обычно число случаев с гиперэкспрессией генов, связанных с лекарственной устойчивостью, возрастает после проведения курсов лечения. Множественная миелома является одним из примеров заболевания, при котором лекарственная устойчивость, связанная с Р-гликопротеином, возникает в результате лечения (Marie J.P. et al, 1996).
Помимо функционирования транспортеров семейства ABC, множественная лекарственная устойчивость может возникать и в результате работы детоксикационных систем, метаболизирующих лекарственные препараты в клетке.
льнля]
КА I
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА СПстер OS МО'
Показано участие в лекарственной устойчивости глутатион S-трансфераз (GST), ферментов II фазы биотрансформации ксенобиотиков. Многие противоопухолевые препараты, такие как алкилирующие агенты и антрациклины (Black S.M. et al, 1990, Harbottle A et al, 2001), препараты платины (Goto S. et al, 1999) являются субстратами для GST и влияют на лекарственную устойчивость при лечении онкологических заболеваний цитостатическими п р е п (Tew Y Т),, 10Q1) R чпт»"т» т и о н
S-трансферазы могут участвовать в формировании множественной лекарственной устойчивости у больных острым и хроническим миелолейкозом (Beck J. et al, 1996). О роли ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков цитохромов Р450 в формировании лекарственной устойчивости у онкологических больных сведений пока нет. Между тем, такие противоопухолевые препараты, как винка алкалоиды, циклофосфамид, таксол являются субстратами одной из форм Р450 -CYP3A4 (Yu L. et al, 1996).
Помимо множественности механизмов, статус лекарственной устойчивости опухоли может варьировать в зависимости от генотипа индивидуума. Полиморфизм генов имеет прямое отношение к различной чувствительности разных индивидуумов к широкому кругу лекарственных препаратов. В последнее время активно обсуждается необходимость индивидуального подбора дозировок и комбинаций противоопухолевых лекарств. Поэтому выявление полиморфизма и его влияние на функцию генов, связанных с лекарственной устойчивостью, также является необходимым для определения статуса лекарственной устойчивости опухоли.
Выбор оптимального метода, применимого для адекватной
диагностики статуса лекарственной устойчивости опухоли, является еще
одной проблемой для клинической онкологии. Разнообразие методов
дегекции генов/белков лекарственной устойчивости: иммуногистохимия,
функциональные тесты, проточная цитофлюориметрия, методы
определения мРНК, а также отсутствие стандартизации в рамках каждого
метода затрудняют интерпретацию результатов, полученных в различных
лабораториях. Кроме того, для некоторых онкологических заболеваний нет
четких клинических критериев лекарственной устойчивости, что
затрудняет сравнение результатов, полученных разными исследователями.
Помимо этого, в клинических образцах не выявляется увеличения уровня
экспрессии генов, связанных с множественной лекарственной
устойчивостью, сравнимого с уровнем, продемонстрированным in vitro. Поэтому, несмотря на многочисленные исследования, ответ на вопрос о выборе метода, применимого для диагностической процедуры определения статуса лекарственной устойчивости опухоли, остается неоднозначным.
Множественность механизмов лекарственной устойчивости и разнообразие способов детекции значительно затрудняют как диагностику причин устойчивости больных к терапии, так и выработку подходов по преодолению множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Это определяет необходимость дальнейшего исследования роли различных механизмов в возникновении лекарственной устойчивости опухолей, в том числе, при различных онкогематологических заболеваниях. Больные лимфопролиферативными заболеваниями, в частности, хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами
обычно достигают ремиссии после одного-двух курсов терапии, но с очень высокой степенью рецидивов. Несмотря на многочисленные исследования в этой области, статус множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток при лимфопролиферативных заболеваниях оценен недостаточно для выработки правильной стратегии терапии.
Целью настоящей работы является исследование взаимосвязи
уровня экспрессии, функциональной активности и полиморфизма
транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков с
формированием лекарственной устойчивости у больных
лимфопролиферативными заболеваниями.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Определить уровень мРНК генов транспортных белков: MDR1 и MRP1 в лимфатических узлах, костном мозге и лимфоцитах периферической крови и функциональной активности P-gp (продукта гена MDR1) в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатом химиотерапии.
Определить уровень мРНК генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTPI и CYP3A4 в лимфатических узлах, костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатом химиотерапии.
Исследовать взаимосвязь полиморфизма гена GSTPI A/G3'J с результатом химиотерапии у больных лимфопролифератавными заболеваниями.
Определить уровень мРНК Торо II в лимфатических узлах, костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями.
Научная новизна. Проведенные исследования уровня мРНК CYP3A4 впервые показали, что СУРЗА4 участвует в формировании лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями: лекарственная устойчивость формируется у тех больных, у которых наблюдается высокий уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге.
Впервые проведенное исследование полиморфизма GSTPI A/G3b у больных продемонстрировало, что полиморфные варианты GSTPI A/G3'3 гена не являются предрасполагающим фактором к развитию лимфопролиферативных заболеваний, но полиморфизм GSTPI A/G313 гена влияет на результат химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями: лекарственная устойчивость чаще возникает у больных, имеющих замену A/G313 в гене GSTPI
Выявлено увеличение уровня мРНК MRP1 в лимфатических узлах больных неходжкинскими лимфомами с рецидивами этого заболевания.
Среди больных лимфопролиферативными заболеваниями, исследованных до химиотерапии, высокая функциональная активность Р-gp является прогностическим фактором формирования лекарственной устойчивости к последующей химиотерапии.
Практическая значимость работы. По своему содержанию
работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование роли ферментов транспорта и метаболизма ксенобиотиков у больных лимфопролиферативными заболеваниями в формировании лекарственной устойчивости.
Выявление статуса лекарственной устойчивости опухоли может помочь оптимизировать химиотерапию и снизить токсическое воздействие цитостатиков на нормальные ткани больного, а также дает возможность использовать в терапии опухоли специфические ингибиторы к белкам лекарственной устойчивости.
Основные положения выносимые на защиту:
Прогрессия опухоли у больных лимфопролиферативными заболеваниями сопровождается увеличением уровня мРНК генов TopoIL MRP1, GSTP1.
Полиморфные варианты гена GSTP1 A/G3n не являются предрасполагающим фактором к развитию лимфопролиферативных заболеваний. Полиморфизм гена GSTP1 A/G313 влияет на терапевтический ответ у больных лимфопролиферативными заболеваниями.
Уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге повышен у больных, устойчивых к химиотерапии, исследованных на фоне лечения.
Высокая функциональная активность P-gp, исследованная до начала химиотерапии в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями, является прогностическим фактором возникновения лекарственной устойчивости к последующей химиотерапии.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на
конференции молодых ученых «Терапия и фундаментальные науки —
перспективы содружества в новом тысячелетии», Новосибирск, 2001; на
сателлитном международном симпозиуме "Новые технологии в медицине и
биологии третьего тысячелетия" 1-го международного
мультидисциплинарного симпозиума "Стресс и экстремальные состояния", Кара-Даг (Феодосия, Крым, Украина), 2002; на Ш Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004.
Публикации. По материалам диссертации имеется 20 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа изложена на 117
страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 19 таблиц и 15 рисунков и состоит из 6-ти разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 231 ссылку.
