Введение к работе
Актуальность исследования
Одним из ключевых факторов, влияющих на воспалительную активность макрофагов в легких, является сурфактантный белок D (SP-D) Основная функция SP-D состоит в модулировании воспалительной реакции и иммунной защиты в легких (Crouch Е and Wright JR , 2001) SP-D стимулирует хемотаксис нейтрофилов (Crouch ЕС, et al 1995) и участвует в захвате антигенов альвеолярными фагоцитами (Kuan S F, et al 1994) Удаление sp-d гена приводит к существенному изменению морфологии альвеолярных макрофагов и развитию воспаления в легких Первоначально SP-D считался исключительно легочным белком, но впоследствии он был обнаружен не только в легких, но и в кишечнике, желудке, сердце Однако, роль SP-D в активности резидентных макрофагов других тканей в титературе не описана В связи с этим, нас заинтересовал ряд важных вопросов Влияет ли SP-D на воспалительную активность перитонеальных макрофагов'' И если да, то зависит ли это влияние от фенотипа воспалительной активности макрофагов (Goldmann О, von Kockntz-Bhckwede М, Holtje С et al, 2007)
Ответы на эти вопросы помогут выяснить возможную роль SP-D в регуляции иммунитета на уровне всего организма, что, в свою очередь, даст возможность создания новых методик лечения хронических воспалительных заболеваний
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования состояла в изучении возможности влияния SP-D на морфологию и функцию макрофагов, локализованных вне легких Для оценки роли SP-D были использованы две экспериментальных модели животных содержащие ген sp-d мыши дикого типа и мыши нокаутные по гену sp-d
В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:
Оценить влияние гена sp-d и его продукта не базальную продукцию цитокинов перитонеальными макрофагами
Оценить участие гена sp-d и его продукта в формировании провоспалительного (Ml) и антивоспалительного (М2) фенотипов
Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции секреции перитонеальными макрофагами при действии высоких (500 нг/мл) доз липополисахарида (Л ПС)
Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции секреции цитокинов перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов, стимулированных высокими дозами ЛПС
Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции базальной продукции NO перитонеальными макрофагами
Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции продукции монооксида азота (NO) перитонеальными макрофагами при действии низких (0,5 нг/мл и 5нг/мл) доз ЛПС
Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции продукции NO перитонеальными макрофагами при действии высоких (500 нг/мл) доз ЛПС
Оценить участие гена sp-d и его продукта в регуляции продукции NO перитонеальными макрофагами разных воспалительных фенотипов при действии высоких доз ЛПС
Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами
Впервые было показано, чго в отсутствии гена sp-d базальная продукция про- и антивоспалительных цитокинов была полностью заблокирована Это позволяет нам предполагать, что SP-D влияет на базальную продукцию цитокинов перитонеальными макрофагами
Впервые было показано, что уровень секреции цитокинов перитонеальными макрофагами мышей нокаутных по гену sp-d отличается от макрофагов диких мышей Продукция как про- так и антивоспалительных цитокинов уменьшается в отсутствии гена sp-d Это свидетельствует о роли SP-D в продукции цитокинов при формировании Ml и М2 фенотипов (т е при действии низких доз ЛПС) перитонеальных макрофагов
Впервые было показано, что продукция исследованных цитокинов, стимулированная высокими (500 нг/мл) дозами ЛПС, отличалась у перитонеальных макрофагов мышей дикого типа и нокаутных по гену sp-d Это означает, что SP-D специфически влияет на стимулированную ЛПС (500 нг/мл) продукцию про- и антивоспалительных цитокинов При этом регуляторные эффекты SP-D зависят от фенотипа перитонеальных макрофагов
Впервые было показано, что в отсутствие гена sp-d происходит снижение продукции TNF-a в провоспалительном Ml фенотипе и усиление - в антивоспалительном М2 фенотипе Таким образом, наблюдается SP-D-зависимая инверсия феномена репрограммирования в отношении продукции фактора некроза опухолей-a (TNF-a) перитонеальными макрофагами при действии высоких доз ЛПС Таким образом, SP-D может менять направленность процесса репрограммирования
Впервые было показано, что в отсутствии гена sp-d, ЛПС-индуцированная продукция iNOS снижается во всех фенотипах перитонеальных макрофагов Однако, в М2 фенотипе это снижение было выражено существенно больше, чем в Ml и наивном фенотипах Таким образом, впервые показано, что SP-D контролирует активность iNOS фенотип-зависимым образом
Впервые показано, что у макрофагов, полученных от мышей, нокаутных по гену sp-d, продукция конечного метаболита NO - NO2 - не различалась между наивным и Ml фенотипами У макрофагов наивного фенотипа, взятых от мышей дикой линии, продукция N02 была выше, чем у Ml фенотипа Таким образом, по параметру продукции N02- отсутствие гена sp-d привело к нарушению репрограммирования наивного фенотипа в Ml, но не повлияло на репрограммирование наивного фенотипа в М2 фенотип
Теоретическое значение работы определяется следующим
Во-первых, в работе доказана важная роль SP-D в регуляции базального и индуцированного синтеза как про-, так и антивоспалительных цитокинов перитонеальными макрофагами
Во-вторых, результаты работы дают основание предположить, что SP-D является не только локальным фактором легочного иммунитета, но, вероятно, также играет роль в генерализованном развитии иммунного ответа всего организма Вместе с тем, обнаружилась определенная специфика в регуляторных эффектах SP-D на макрофаги разного происхождения
В-третьих, в работе доказано, что регуляторная роль SP-D зависит от фенотипа секреторной активности макрофагов
В-четвертых, результаты работы о критической значимости SP-D в репрограммировании макрофагов и индуцированном секреторном ответе этих клеток позволяют сделать важное предположение о новом регуляторном механизме влияния SP-D на врожденный и адаптивный иммунные ответы
В целом, наши данные дают теоретические предпосылки для развития новой концепции о том, что роль SP-D в регулировании врожденных и адаптивных иммунных ответов организма определяется
1) влиянием на баланс про- и антивоспалительных цитокинов макрофагов разного происхождения, 2) влиянием на репрограммирование макрофагов малыми дозами патогена и 3) тем, что регуляторная роль SP-D зависит от фенотипа секреторной активности макрофага
Практическое значение работы состоит в том, что данные о влиянии SP-D на воспалительную активность перитонеальных макрофагов могут быть использованы для разработки новых методов лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушением регуляторной секреторной активности макрофагов
Положения, выносимые на защиту:
Удаление ієна sp-d приводит к полному прекращению базальной продукции цитокинов макрофагами Это означает, что SP-D необходим для обеспечения базальной продукции некоторых провоспалительных (INF-y) и антивоспалительных (IL-13) цитокинов перитонеальными макрофагами
Отсутствие гена sp-d оказывает влияние формирование Ml и М2 фенотипов перитонеальных макрофагов, что позволяет говорить от том, что SP-D участвует в регуляции ЛПС-зависимого репрограммирования нативных перитонеальных макрофагов в Ml или М2 фенотип
Отсутствие гена sp-d оказывает влияние на ЛПС-индуцированную продукцию перитонеальными макрофагами ПВ (Ml) и АВ (М2) цитокинов и экспрессию iNOS Это означает, что SP-D специфически контролирует ЛПС-индуцированную продукцию про- и антивоспалительных цитокинов и экспрессию iNOS в перитонеальных макрофагах
Секреция цитокинов макрофагами разных воспалительных фенотипов зависит от наличия гена sp-d Это означает, что участие SP-D в регуляции воспалительной активности макрофагов является фенотипзависимым
Апробация работы Основные результаты проведенных исследований были доложены на конкурсе «Перспективные научные работы молодых
ученых» на втором конгрессе Российского Медицинского Форума (Москва, 2007), где была удостоена диплома за актуальность научного исследования, на межлабораторном семинаре Университета Пенсильвании (Филадельфия, 2007), на совместном семинаре кафедры патофизиологии лечебного факультета и лаборатории клеточных биотехнологий Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета (Москва, 2008)
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 112 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов Список литературы содержит 190 источников Диссертация иллюстрирована четырьмя таблицами и 28 рисунками
