Введение к работе
Актуальность проблемы
Воспалительные хронические патологии и особенно сепсис, как их наиболее тяжелое
последствие, являются одними из наиболее частых причин смертности и относятся к социально-значимым заболеваниям. Обычно септические состояния возникают как постоперационные или посттравматические последствия, в основе которых лежат расстройства функционирования иммунитета, гибель клеток и повреждение тканей.
Известны некоторые молекулярко-клеточные механизмы, связанные с каскадом реакций, инициированных токсинами грамотрицатсльцых или грамположительных бактерий (Прохоренко и др., 2005; Opal et al., 2003), и представляющие собой систему врожденной антимикробной резистентности организма млекопитающих. Особенно тяжелые формы сепсиса индуцируются токсинами грамотрицателышх бактерий — даже при использовании современных достижений интенсивной терапии летальность пациентов с диагностированным заболеванием достигает 30-60% для разных видов сепсиса.
Большинство исследований по выявлению механизмов взаимодействия бактериальных токсинов с живыми системами выполнены с использованием трансформированных клеток (Nishina et al., 2004), у которых чувствительность к патогенам значительно отличается от той, что свойственна нормальным животным клеткам. Кроме того, наибольшее количество работ, посвященных этим проблемам, выполнено с использованием клеточных моделей in vitro. С учетом перечисленных обстоятельств, представляется актуальным исследование новых закономерностей возникновения и развития септических состояний с использованием более адекватных животных моделей, которые максимально точно воспроизводят реальную картину сепсиса.
Принимая во внимание тот факт, что наличие иммунной недостаточности является одним из главных условий развития сепсиса, необходимо исследовать ключевые процессы и мессенджеры иммунного ответа клеток, а также провести поиск подходов для снижения риска возникновения тяжелых последствий септического процесса. В этом плане представляются актуальными исследования закономерностей функционирования защитных систем клетки, учитывая общее состояние цитокиновой сети (продукция про- и анти-воспалительаых цитокшюв), уровень экспрессии белков теплового шока БТШ70, БТШ25 и БТШ90, а также их локализацию во внутриклеточных структурах, оценку продукции оксида азота и уровня активации каскадов сигнальной трапсдукции NF-kB и SAPK/JNK в условиях острого и хронического воспалений. С учетом мнения большинства клиницистов о том, что сепсис легче предотвратить, чем лечить, целесообразно исследовать ряд подходов, направленных на превентивные меры снижения риска развития септических состояний.
Цели и основные задачи:
Целью данной работы было исследование роли ключевых защитных систем клетки при остром токсическом стрессе, а также исследование динамики изменений клеточного иммунитета при хроническом воспалении. Кроме того, в задачу работы входило изучение способов модуляции уровня резистентности животных к действию бактериальных эндотоксинов и поиск методов, снижающих чувствительность клеток к липоплисахариду (ЛПС) из стенок грамотрицательных бактерий Escherihia coli. Поскольку клетки иммунной системы очень быстро формируют ответ на эндотоксины, в качестве главного объекта исследования были использованы макрофаги и лимфоциты животных, которые являются основными продуцентами защитных молекул. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Исследовать роль белков теплового шока БТШ72 и БТШ90, некоторых про- и антивоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей (ФНО-а и ФНО-(5), интерферона-у (ИФН-у), интерлейкина-1а (ИЛ-1а), иптерлейкина-ір (ИЛ-ір) интерлейкина-2 (ИЛ-2), интерлейкина-3 (ИЛ-3), интерлейкина-6 (ИЛ-6), иптерлейкина-10 (ИЛ-10) и оксида азота в защитной реакции клеток и целого организма в условиях острого и хронического воспалений, индуцированных эндотоксином из грамотрицательных бактерий.
Учитывая развитие окислительного стресса при остром воспалении, подобрать комплекс липорастворимых природных аятиоксидантов, способных снизить продукцию активных форм кислорода in vivo в условиях острого воспаления. Исследовать анти-воспалительный потенциал антиоксидантов путем оценки уровня продукции цитокинов (ФНО-а, ИФН-у, интерлейкинов - ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10), белка теплового шока БТШ72, оксида азота, а также уровней активации двух сигнальных каскадов: фактора транскрипции NF-кВ и стресс-активируемой протешпошазы SAPK/JNK.
Изучить закономерности воздействия in vitro и in vivo ингибитора активности белка теплового шока БТШ90 - гелданамицина - на уровень провоспалительпого ответа клетки в условиях острого воспаления путем оценки продукции цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1а, ИЛ-6, ИЛ-10, ИФН-у), белков теплового шока БТШ72, БТШ25 и БТШ90, оксида азота, а также оценить уровень активации сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK.
Научная новизна. Впервые установлено, что острое воспаление, индуцированное бактериальным эндотоксином, сопровождается более высоким уровнем молекулярно-клеточного ответа на стресс, чем тот, что индуцируется при хронической интоксикации. Так, острое воспаление вызывает более значительное увеличение продукции ФНО-а, ФНО-Р, белка теплового шока БТШ72 и N0, в сравнении с теми изменениями, которые наблюдаются при хроническом воспалении у мышей. Это означает, что при развитии хронического воспаления в клетках организма снижается способность отвечать на стресс
высоким уровнем продукции белков теплового шока, цитокинов и оксида азота - основных мессенджеров иммунного ответа.
С использованием животных моделей острого и хронического воспаления впервые установлено, что не только БТШ70, но и БТШ90, субстратами которого являются сигнальные белки, экспрсссируется в клетках в условиях токсического стресса, вызванного эндотоксином. Показано, что снижение уровня окислительного стресса, индуцированного бактериальным токсином, путем превентивной защиты клеток организма комплексом антиоксидантів приводит к снижению провоспалитсльпого ответа и реализуется через уменьшение степени активации сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK. Установлено, что гелданамицип, специфически связьтающийся с БТШ90 и подавляющий активность этого белка, обладает анти-воспалительной активностью, снижая продукцию и оксида азота в условиях острого воспаления. Этот препарат предотвращает чрезмерную активацию сигнальных каскадов NF-кВ и SAPK/JNK при действии эндотоксина in vitro и in vivo, а также приводит к изменению локализации белков теплового шока БТШ72 и БТШ25 в субклеточных структурах.
Научно-практическая пенпость. В работе содержатся новые сведения об иммунопатогенезе острого и хронического воспалений, что указывает на необходимость переосмысления механизмов патогенеза сепсиса и поиск на основе этих исследований новых медикаментозных средств терапии. Результаты исследования указывают на перспективу использования антибиотика гелданамицииа и его производных при разработке новых препаратов для лечения острых и хронических воспалений. В работе получены результаты, указьгаающие на возможность применения профилактических подходов для снижения риска развития тяжелых септических состояний.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международной школе-конференции 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Moscow, 2007), на конгрессе INTERNATIONAL SOCIETY FOR ADAPTIVE MEDICTNE.-MOSCOW, 2006, па 11-й и 12-й Пущинских школах-конференциях молодых ученых БИОЛОГИЯ - НАУКА 21-го ВЕКА (Пушино, 2007,2008).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе
4 статьи в реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 листах машинописного текста и содержит 29 рисунков и четыре таблицы. Библиографический указатель содержит 273 источника литературы.
