Введение к работе
Актуальность проблемы. В группу малых белков теплового шока объединяют белки с небольшой молекулярной массой от 12 до 43 кДа, обнаруженные во всех организмах от архей до млекопитающих [1, 2]. Общим свойством белков этой группы является наличие в их структуре так называемого а-кристаллинового домена, расположенного в С-концевой части молекулы белка [3]. Этот домен имеет преимущественно Р-складчатую структуру и принимает участие в образовании димеров, которые являются строительными блоками при образовании крупных олигомерных комплексов, характерных для большинства малых белков теплового шока [4].
Основной функцией малых белков теплового шока является предотвращение агрегации частично денатурированных белков [1, 2, 4]. Связывая такие белки-субстраты, малые белки теплового шока способны передавать их либо на АТР-зависимые шапероны для последующего рефолдинга, либо ускорять процесс их протеолитической деградации в протеасомах или аутофагосомах [2, 5]. В настоящее время обнаружено 10 генов, кодирующих различные малые белки теплового шока человека [2, 4]. Одним из этих белков является малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа, получивший обозначение HspB6 или Hsp20. Этот белок экспрессируется практически во всех тканях, особенно большие количества этого белка обнаружены в различных типах мышц [2, 6]. Как и все малые белки теплового шока, HspB6 обладает шапероноподобной активностью и связывает частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации [7]. Помимо этого, HspB6 играет важную роль в регуляции расслабления гладкой мускулатуры, обладает кардиопротекторными свойствами, а также, вероятно, принимает участие в процессах агрегации тромбоцитов и регуляции инсулин-зависимого транспорта глюкозы в мышечных клетках [2, 8]. По крайней мере отчасти такая полифункциональность может быть обусловлена тем, что HspB6 является партнером универсального белка-адаптера 14-3-3, вовлеченного в регуляцию многочисленных и разнообразных внутриклеточных процессов [9, 10].
Белки семейства 14-3-3 найдены практически во всех эукариотических организмах, в организме человека экспрессируется 7 изоформ этого белка [11]. Эти белки представляют собой стабильные гомо- и гетеродимеры; считается, что димерная структура необходима для их эффективного функционирования [12]. Белки 14-3-3 преимущественно связывают
Список сокращений: БСА - бычий сывороточный альбумин, МЭ - Р-меркаптоэтанол, ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид, ЭДТА - этилендиаминтетраацетат, АТР - аденозинтрифосфат, сАМР -циклический аденозинмонофосфат, IgG - иммуноглобулины класса G, pHspB6 - фосфорилированный HspB6, SDS - додецилсульфат натрия, WT - белок дикого типа.
фосфорилированные белки-мишени и, таким образом, оказывают влияние на их активность, внутриклеточную локализацию и взаимодействие с другими партнерами. К настоящему времени описано более 300 потенциальных белков-мишеней 14-3-3 [13]. Взаимодействуя с таким большим количеством партнеров, 14-3-3 принимает участие во множестве различных процессов, таких как регуляция апоптоза, клеточного цикла, транскрипции, функционирования ионных каналов и переносчиков, организации цитоскелета [14]. 14-3-3 не только преимущественно взаимодействует с фосфорилированными белками-партнерами, но и сам может подвергаться фосфорилированию in vivo. Фосфорилирование Ser58, Serl84 и Thr232 может влиять на структуру и свойства 14-3-3, а также на его взаимодействие с белками-мишенями [15].
Запуск различных сигнальных каскадов в клетке приводит к активации циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ, которые фосфорилируют HspB6 по остатку Serl6, окружение которого соответствует мотиву RXX(pS/pT)XP, узнаваемому 14-3-3 [16]. Фосфор илированный HspB6 приобретает способность взаимодействовать с 14-3-3. Высказывается предположение, что взаимодействие HspB6 с 14-3-3 может лежать в основе механизма регуляции расслабления гладких мышц. Согласно гипотезе Брофи и соавт. [9, 17], фосфорилированный HspB6 способен вытеснять фосфорилированный кофилин из комплекса с 14-3-3. Освободившийся кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, активируется и способствует деполимеризации актина, что приводит к расслаблению гладких мышц. Учитывая тот факт, что концентрация HspB6 в мышцах достаточно высока, можно предположить, что фосфорилированный HspB6 может эффективно конкурировать со многими белками-партнерами 14-3-3 и тем самым опосредованно участвовать в регуляции многочисленных внутриклеточных процессов. В этой связи представлялось целесообразным провести подробное исследование взаимодействия HspB6 с 14-3-3, изучить влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его способность связывать HspB6, а также проанализировать влияние HspB6 на взаимодействие 14-3-3^ с фосфорилированным кофилином.
Цель и задачи работы. Целью данной работы был подробный анализ взаимодействия HspB6 с 14-3-3^ дикого типа, его мутантами, имитирующими фосфорилирование, а также мутантами, препятствующими димеризации. Помимо этого целью работы была проверка гипотезы о том, что HspB6 регулирует расслабление гладких мышц, вытесняя фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
1. Используя различные методы, исследовать взаимодействие HspB6 с 14-3-3^ дикого типа in vitro.
-
Проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3(^, на его способность связывать HspB6.
-
Исследовать взаимодействие HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры.
-
Изучить влияние фосфорилированного HspB6 на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным кофилином.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Фосфорилирование протеинкиназой А резко увеличивает прочность взаимодействия HspB6 с 14-3-3^ дикого типа, при этом образуется комплекс HspB6/14-3-3 со стехиометрией 1:2 или 2:2.
-
Мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на взаимодействие 14-3-3 с HspB6. При этом мутация S184E немного увеличивает, а мутация S58E значительно ослабляет взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным HspB6.
-
Мутации, предотвращающие димеризацию, не ослабляют взаимодействия 14-3-3 с HspB6. Образующийся комплекс НзрВб/мономерный 14-3-3 имеет стехиометрию 1:1.
-
14-3-3^ не способен образовывать прочных комплексов с кофилином, фосфорилированным ЫМ-киназой.
Научная новизна и практическая ценность работы. Методами нативного электрофореза, химического «сшивания», иммунопреципитации и гель-фильтрации исследовано взаимодействие фосфорилированного HspB6 с 14-3-3^ дикого типа и его мутантными формами, имитирующими фосфорилирование по остаткам Ser58 (S58E), Serl84 (S184E), Thr232 (Т232Е). Изучено взаимодействие фосфорилированного HspB6 с мутантными формами 14-3-3 12LAE14^12QQR14 (WMW) и Е5^К5, 12LAE14^12QQR14 (MMW), не способными к димеризации.
Установлено, что фосфорилированный HspB6 образует прочные комплексы с димером 14-3-3 дикого типа, стехиометрия которых составляет 1:2 или 2:2. Обнаружено, что мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, влияют на его взаимодействие с HspB6. Мутация S184E немного увеличивает прочность комплекса 14-3-3 с HspB6, что является редким примером того, что фосфорилирование усиливает взаимодействие 14-3-3 с белком-партнером. Мутация Т232Е немного ослабляет прочность взаимодействия 14-3-3 с HspB6, что согласуется с данными литературы, свидетельствующими о том, что фосфорилированный С-конец может конкурировать с белками-мишенями за связывание с субстрат-связывающим участком 14-3-3. Мутация S58E, приводящая к частичной диссоциации димеров и влияющая на структуру 14-3-3, ухудшает его взаимодействие с
HspB6. Таким образом, регуляция взаимодействия HspB6 с 14-3-3^ может осуществляться путем фосфорилирования 14-3-3.
Проанализировано связывание HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры. Установлено, что мономерные мутанты (так же как и белок дикого типа) избирательно взаимодействуют только с фосфорилированным HspB6, образуя прочные комплексы со стехиометрией 1:1.
Методами вестерн-блоттинга, нативного электрофореза, химического «сшивания» и
гель-фильтрации установлено, что вне зависимости от фосфорилирования кофилин не
способен взаимодействовать с 14-3-3. Установлено, что 14-3-3 не влияет на связывание
кофилина с F- и G-актином. Таким образом, полученные данные опровергают высказанную в
литературе гипотезу о том, что кофилин и 14-3-3 прочно взаимодействуют друг с другом и
что фосфорилированный HspB6 может вытеснять кофилин из комплекса с 14-3-3 и, таким
образом, регулировать расслабление гладких мышц. Тем не менее, представленные данные
не исключают возможности опосредованного участия 14-3-3 и HspB6 в регуляции
цитоскелета. Индуцированное действием гормонов увеличение концентрации
фосфорилированного HspB6 в клетке может приводить к вытеснению из комплексов с 14-3-3
различных протеинкиназ (ЫМ-, TES-киназы) или протеинфосфатаз (Slingshot), участвующих
в фосфорилировании/дефосфорилировании кофилина. Освободившиеся
протеинкиназы/протеинфосфатазы могут влиять на степень фосфорилирования кофилина, следствием чего может стать реорганизация цитоскелета и последующее расслабление. Исследования механизма действия фосфорилированного HspB6 на гладкую мускулатуру могут иметь важное практическое значение в сердечно-сосудистой хирургии и при разработке препаратов для лечения бронхиальной астмы.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной конференции «Biological motility: fundamental and applied science» (Пущино 2012), на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород 2012).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 печатные работы в рецензируемых журналах и 2 тезиса сообщений.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах и включает 39 рисунков и 3 таблицы.
![Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена](/i/i/4712/570538.png "Экспрессия генов-мишеней гормонального канцерогенеза под воздействием ДДТ, бензо[а]пирена и 3-метилхолантрена Чанышев Михаил Дамирович")