Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Структура и свойства малых Hsp 9
1.1. Общие сведения о малых Hsp 9
1.2. Структура малых Hsp 12
1.3. Образование гетероолигомериых комплексов 18
1.4. Фосфорилирование малых Hsp 22
1.5. Шапероішая активность 25
2. Возможная функциональная роль Hsp20 29
2.1. Участие Hsp20 в предотвращении агрегации тромбоцитов 29
2.2. Возможное участие Hsp20 в регуляции метаболизма глюкозы под действием инсулина 30
2.3. Регуляция сократительной активности гладких мышц и возможное участие Hsp20 в этом процессе 31
2.4. Возможное участие Hsp20 в регуляции сократительной активности и апоптозе кардиомиоцитов 36
Материалы и методы 39
1. Препаративные методы 39
1.1. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантных Hsp20 и Hsp27 человека и их точечных мутантов с заменами, имитирующими фосфорилирование (Hsp20D и Hsp27 3D) 39
1.1.1 Получение препарата рекомбинантного Hsp20 дикого типа (Hsp20WT) 39
1.1.2. Получение высокоочищешюго препарата рекомбинантного Hsp20 с заменой остатка Serl6 на остаток аспарагиновой кислоты (Hsp20D) 42
1.1.3. Получение высокоочищенных препаратов рекомбинантного Hsp27 дикого типа (Hsp27WT) и его мутанта с заменами остатков SerlS, Ser78, Ser82 на остатки аспарагиновой кислоты (Hsp27 3D) 43
1.2. Выделение актина из ацетонового порошка скелетных мышц кролика... 44
1.3. Выделение миофибрилл из скелетной и сердечной мышц человека или гладких мышц птиц 45
2. Методы, использованные для изучения свойств Hsp20 45
2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом гель-фильтрации. 45
2.2. Определение молекулярной массы Hsp20 методом нативного электрофореза в градиенте пористости геля 46
2.3. Определение олигомерного состояния Hsp20 методом неравновесного аналитического ультрацентрифугирования 48
2.4. Изучение влияния рН на вторичную структуру Hsp20 методом кругового дихроизма (КД) 48
2.5. Изучение олигомерного состояния Hsp20 методом химического «сшивания» 49
3. Определение шаперонной активности малых Hsp 50
3.1. Влияние малых Hsp на агрегацию инсулина 51
3.2. Влияние малых Hsp на агрегацию алкогольдегидрогеназы 51
3.3. Влияние малых Hsp на агрегацию термически денатурированного актина 52
4. Методы, использованные для изучения взаимодействия Hsp20 с другими белками 52
4.1. Изучение взаимодействия Hsp20 и Hsp27 методом гель-фильтрации 52
4.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина 53
4.2.1 Метод ультрацентрифугирования 53
4.2.2 Метод флуоресцентной спектроскопии 53
4.3. Изучение взаимодействия Hsp20 с комплексами актин-связывающих белков с F-актином 54
4.3.1 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-тропомиозин 54
4.3.2 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-ос-актинин 55
4.3.3 Взаимодействие Hsp20 с комплексом F-актин-кальпонин 55
4.3.4 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл 56
5. Некоторые аналитические методы 56
5.1. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS 56
5.2. Изоэлектрофокусирование в денатурирующих условиях 57
5.3. Вестерн-блоттинг 58
5.4. Определение концентрации белка 59
5.4.1 Спектрофотометрический метод 59
5.4.2 Метод Брэдфорд 59
6. Состав и обозначение буферных растворов/ использованных в работе 60
Результаты исследования 61
1. Выделение Hsp20 и его S16D мутанта и определение их шаперонной активности 61
1.1. Выделение Hsp20 61
1.2. Определение шаперонной активности Hsp20 66
2. Изучение свойств Hsp20 70
2.1. Определение олигомерного состояния Hsp20 70
2.1.1 Влияние концентрации на олигомерное состояние Hsp20WT 70
2.1.2 Влияние мутации, имитирующей фосфорилирование Serl6, на олигомерное состояние Hsp20 79
2.2. Влияние рН на структуру и свойства Hsp20 84
2.2.1 Влияние рН на шаперонную активность Hsp20 84
2.2.2 Влияние рН на олигомерное состояние Hsp20 90
2.2.3 Влияние рН на вторичную структуру Hsp20 92
2.3. Влияние Hsp20 на агрегацию термически денатурированного актина,... 94
3. Взаимодействие Hsp20 с другими белками 97
3.1. Образование гетероолигомерных комплексов cHsp27 97
3.2. Взаимодействие Hsp20 и актина 103
3.2.1 Влияние Hsp20 на скорость и степень полимеризации G-актина... 104
3.2.2 Анализ взаимодействия Hsp20 с F-актином и комплексами F-актин-актин-связывающий белок , 106
3.2.3 Взаимодействие Hsp20 и миофибрилл 109
Обсуждение результатов 113
1. Некоторые физико-химические свойства Hsp20 113
1.1. Олигомерное состояние и шаперонная активность Hsp20 113
1.2. Влияние рН на олигомерное состояние и шаперонную активность Hsp20. 120
2. Образование гетероолигомерных комплексов Hsp20 и Hsp27 124
3. Взаимодействие Hsp20 и актина 126
Выводы 130
Список литературы 131
- Структура малых Hsp
- Регуляция сократительной активности гладких мышц и возможное участие Hsp20 в этом процессе
- Выделение Hsp20
- Образование гетероолигомерных комплексов cHsp27
Введение к работе
Белки теплового шока (heat shock proteins, Hsp) - общее название для нескольких семейств белков-шаперонов. Это название возникло вследствие того, что повышение температуры и другие типы клеточного стресса приводят к значительному усилению синтеза этих белков. Однако и в нормальных, не стрессовых условиях содержание Hsp в клетке достаточно высоко, поскольку белки теплового шока выполняют в клетке чрезвычайно важные функции, такие как котрансляционное сворачивание новообразованных полипептидных цепей, рефолдинг частично денатурированных или элиминация неправильно свернутых белков. Б зависимости от функций Hsp делятся на несколько основных семейств, названия которых основаны на молекулярных массах их основных представителей. Наиболее хорошо изученными являются Hsp60 и Hsp70, основной функцией которых является АТФ-зависимый фолдинг (или рефолдинг) белков-субстратов. Малые белки теплового шока (малые Hsp) не способны осуществлять АТФ-зависимый рефолдинг белков-субстратов, но, несмотря на это, играют важную роль в защите клетки от неблагоприятных условий. Связывая частично денатурированные белки-субстраты, малые Hsp предотвращают накопление агрегатов поврежденных белков, облегчая тем самым их последующую ренатурацию шаперонами других семейств.
В последнее время появилось большое количество данных, свидетельствующих о том, что, помимо шаперонной активности, малые Hsp обладают и другими, не менее значимыми функциями. Чрезвычайный интерес исследователей вызывают такие функции малых Hsp, как модуляция динамики актинового цитоскелета, возможная роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также возможная вовлеченность мутантов малых Hsp в развитие различных наследственных заболеваний.
В настоящее время в геноме человека обнаружено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока. При этом только а-кристаллины и Hsp27 охарактеризованы достаточно подробно, а структура и функции остальных представителей этого семейства остаются практически неизученными. Hsp20, являющийся объектом нашего исследования, был открыт сравнительно недавно,, однако привлекает большой интерес разнообразием своих функций. Считается, что Hsp20 способен регулировать расслабление гладкой мускулатуры, предотвращать апоптоз кардиомиоцитов, участвовать в инсулин-зависимом транспорте глюкозы в скелетные мышцы и в регуляции агрегации тромбоцитов. К сожалению, при всем богатстве фактического материала, механизмы лежащие в основе большинства функций Hsp20, остаются не до конца понятными.
Целью данной работы был анализ структуры и свойств Hsp20 и изучение его взаимодействия с актином и актин-связывающими белками. Для чего были поставлены следующие задачи:
1. Разработать метод выделения немодифицированного рекомбинантного Hsp20 без применения денатурирующих реагентов.
2. Определить шаперонную активность и олигомерное состояние Hsp20 и исследовать факторы, влияющие на эти свойства.
3. Проанализировать возможность образования гегероолигомерных комплексов между Hsp20 и Hsp27.
4. Проанализировать способность Hsp20 к взаимодействию с актином и некоторыми актин-связывающими белками.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Разработан метод выделения в нативных условиях рекомбинантного Hsp20 человека, а также мутанта этого белка, с заменой S16D, имитирующей фосфорилирование Hsp20 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ. Установлено, что в отличие от большинства других малых белков теплового шока, Hsp20 и его S16D мутант преимущественно представлены малыми олигомерами с кажущимися молекулярными массами 54-58 кДа и коэффициентами седиментации 2-2,9 S.
Hsp20 дикого типа эффективно препятствует агрегации инсулина, вызванной восстановлением дисульфидных связей, и агрегации алкогольдегидрогеназы, вызванной повышением температуры. Мутация, имитирующая фосфорилирование Hsp20, приводит к значительному снижению шаперонной активности этого белка. Понижение рН от 7,0 до 6,0 сопровождается значительным уменьшением шаперонной активности Hsp20, что может быть связано с частичной диссоциацией и денатурацией Hsp20.
Hsp20 и Hsp27 дикого типа образуют гетероолигомерные комплексы с кажущимися молекулярными массами 300 и 100 кДа. Стехиометрия Hsp20/Hsp27 в составе таких комплексов близка к единице. Мутант Hsp27 с заменами SerlS, 78 и 82 на остатки Asp, имитирующими фосфорилирование Hsp27 под действием МАРКАР2/3 киназы, образует с Hsp20 единственный тип гетероолигомерных комплексов с кажущейся молекулярной массой 100 кДа, в котором стехиометрия Hsp20/Hsp27 близка к единице.
Установлено, что Hsp20 не влияет на скорость и степень полимеризации актина и не способен взаимодействовать с полимерным актином или актином, содержащим тропомиозин, кальпонин или а-актинин, а также F-актином, входящим в состав миофибрилл скелетной, сердечной и гладкой мускулатуры. Фосфорилирование Serl6 Hsp20 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или мутация, имитирующая фосфорилирование, не влияют на способность Hsp20 взаимодействовать с изолированным F-актином или с F-актином в комплексе с некоторыми актин-связывающими белками или актином в составе миофибрилл.
Структура малых Hsp
Как уже упоминалось, в клетках некоторых организмов может синтезироваться несколько типов различных Hsp. Например, у Е. coli обнаружено, по меньшей мере, два гена, кодирующих малые Hsp. Они носят название Гор -inclusion body associated protein, поскольку встречаются в «тельцах включения» {inclusion bodies) - нерастворимых агрегатах белков, образующихся при повышенной экспрессии белка в клетках (Allen, et al., 1992). В геноме нематоды Caenorhabditis elegans обнаружено 16 генов малых Hsp (Ding and Candido, 2000), а у растения Arabidopsis thaliana (Sun, et al., 2002) и плодовой мушки Drosophila melanogaster (Michaud, et ah, 1997) их количество доходит до 19.
В настоящее время в организме человека обнаружено 10 типов малых Hsp (Карре, et al., 2003). Некоторые малые Hsp человека, такие как аА-кристаллин, HspB9 (Карре, et al., 2001) и HspBlO (Fontaine, et al., 2003) синтезируются только в одной ткани. Так, аА-кристаллин синтезируется только в хрусталике глаза, а HspB9 и HspBlO - в семенниках. Для большинства остальных малых Hsp характерна экспрессия практически во всех органах и тканях, при этом особо высокий уровень содержания обнаруживается в мышцах различных типов. Совместная локализация нескольких малых Hsp в одной клетке, сходство первичной структуры и способность к обмену субъединицами делает возможным образование гетероолигомерных комплексов. Наиболее ярким примером является ос-кристаллин хрусталика глаза млекопитающих, на долю которого приходится до 40% общего белка (Horwitz, et al., 1998). а-Кристаллин представлен гетероолигомерами, состоящими из аА и осВ цепей в молярном соотношении 3:1 (Horwitz, et al., 1999). Гетероолигомеры а-кристаллинов именно с такой стехиометрией обладают наибольшей температурной стабильностью (Sun and Liang, 1998). Интересно отметить, что аА-кристаллин специфически синтезируется только в хрусталике глаза, в то время как для аВ-кристаллина характерно повсеместное тканевое распределение. Помимо взаимодействия с аА-кристаллином, аВ-кристаллин способен образовывать гетероолигомерные комплексы и с другими малыми Hsp человека - Hsp27 (Merck, et al., 1992; Zantema, et al., 1992) и, по всей видимости, с Hsp20 (Kato, et al., 1994). Судя по всему, образование гетероолигомерных комплексов возможно только при достаточном сходстве первичных структур. В цитоплазме бактерии Bradyrhizobium japonicum обнаружено 10 типов малых Hsp. Сопоставление первичных структур позволяет разделить эти белки на два класса, так называемые класс А и класс В. Гетероолигомерные комплексы образуются только между малыми Hsp, принадлежащими к одному и тому же классу, в то время как белки, относящиеся к разным классам, не способны образовывать гетероолигомерные комплексы (Studer and Narberhaus, 2000). Предполагается, что сходная ситуация характерна и для малых Hsp человека. Так, на основании сравнения первичных структур малых Hsp человека, их разделили на две группы (см. глава 1.1., рис. 1.1) К первой группе относятся Hsp20, сс-кристаллины, Hsp27 и Hsp22, а ко второй группе -HspB2(MKBP) и HspB3 (Sugiyama, et al., 2000). Действительно, была продемонстрирована возможность образования гетероолигомерных комплексов следующего состава: Нзр27/Нзр20/аВ-кристаллин (Sugiyama, et al., 2000; Zantema, et al., 1992), Hsp20/Hsp27 (Kato, et al., 1994), Нзр27/аВ-кристаллин (Bova, et al., 2000), MKBP/HspB3 (Sugiyama, et al., 2000) и Hsp27/Hsp22 (Sun, et al., 2004). Исключение составляет Hsp22, который, хотя и относится к первой группе, однако взаимодействует с cvHsp и МКВР (Sun, et al., 2004). Любопытно отметить, что в некоторых случаях наблюдалось образование гетероолигомерных комплексов между малыми Hsp, выделенными из разных видов бактерий или растений. Так малые Hsp Е, coli - IbpA и IbpB способны образовывать гетероолигомерные комплексы с малыми Hsp класса А В. japonicum (Studer and Narberhaus, 2000). Аналогичная ситуация наблюдалась и при смешивании Hspl8,l гороха и Hspl6,9 пшеницы (Sobott, et al., 2002).
Проанализируем более подробно способность Hsp20 к образованию гетероолигомерных комплексов с другими малыми белками теплового шока. Б литературе есть ряд фактов, позволяющих предположить, что Hsp20 и Hsp27 способны образовывать смешанные олигомеры в условиях in vivo. Установлено, что и Hsp20, и Hsp27 в больших количествах синтезируются в мышечных тканях, при этом в некоторых случаях внутриклеточная локализация этих белков совпадает (Sugiyama, et al., 2000). При центрифугировании экстрактов диафрагмы крысы в градиенте плотности сахарозы и Hsp20, и Hsp27 обнаруживаются во фракциях с молекулярными массами около 540 и 67 кДа (следует заметить, что во фракции с молекулярной массой 540 кДа помимо указанных белков удается выявить и ссВ-кристаллин). При этом изолированный Hsp20 образовывал два типа олигомеров с молекулярными массами около 67 и 200-300 кДа. Тепловой шок приводил к перераспределению малых белков теплового шока, при этом и Hsp20, и Hsp27 переходили во фракцию с молекулярной массой 67 кДа. (Kato, et al., 1994). Эти экспериментальные данные можно объяснить следующим образом. В отсутствие стресса Hsp20 и Hsp27 образуют высокомолекулярные гетероолигомеры. Тепловой стресс сопровождается фосфорилированием Hsp27, что приводит к диссоциации крупных гетероолигомеров и одновременному перемещению Hsp20 и Hsp27 в область белков с меньшей молекулярной массой.
К сожалению, в литературе представлены и иные экспериментальные данные. Например, при гель-фильтрации грубого гомогената сердечной мышцы Hsp20 был обнаружен только в одном пике с молекулярной массой 200 кДа. Б этом же пике был обнаружен и аВ-кристаллин (но не Hsp27) {Pipkin, et al., 2003). При гель-фильтрации гомогената сонной артерии быка Hsp20 также элюировался во фракциях с кажущейся молекулярной массой 230 кДа, при этом указанные фракции практически не содержали Hsp27, который обнаруживался во фракциях с кажущейся молекулярной массой 150 кДа. Фосфорилирование Hsp20 цАМФ-зависимой протеинкиназой приводило к перемещению этого белка во фракции с кажущейся молекулярной массой 160 кДа. При этом именно в этих фракциях элюировался и Hsp27 (Brophy, et al., 1999). Эти экспериментальные данные как будто свидетельствуют о том, что в нормальных условиях Hsp20 в основном взаимодействует с ссВ-кристаллином, а после фосфорилирования Hsp20 гетероолигомерные комплексы диссоциируют и фосфор ил ированный Hsp20 становится способным взаимодействовать с Hsp27.
Регуляция сократительной активности гладких мышц и возможное участие Hsp20 в этом процессе
Начиная с ранних работ Мирон и соавт. (Miron, et al., 1988) и Бенндорфа и соавт. (Benndorf, et ah, 1994), считается, что один из малых белков теплового шока - Hsp25/27 - является ингибитором полимеризации актина. Несмотря на то, что в более поздних работах эти данные не были подтверждены (Butt, et ah, 2001; Fanasenko, et ah, 2003), считается общепринятым, что Hsp25/27 является актин связывающим белком и играет важную роль в регуляции сократительной активности мышц, а также немышечной подвижности клеток. Сходная ситуация наблюдается и в случае Hsp20. В 1997 году Беллом и соавт. (Beall, et ah, 1997) было установлено, что расслабление аорты быка, вызванное активаторами адеиилатциклазы (форсколин) или гуанилатциклазы (нитропруссид), сопровождается фосфорилированием Hsp20. В дальнейшем эти исследования были расширены и дополнены, и, несмотря на то, что данные, полученные в различных лабораториях, зачастую противоречили друг другу, в литературе установилась точка зрения, согласно которой Hsp20 является актин-связывающим белком и его фосфорилирование под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ играет важную роль в расслаблении гладкой мускулатуры. Рассмотрим более подробно данные литературы, касающиеся роли Hsp20 в расслаблении гладких мышц. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что обработка гладких мышц различными соединениями (форсколин (Beall, et al., 1997; Brophy, et al., 1999; Fuchs, et al., 2000; Tessier, et al., 2003), нитропруссид (Beall, et al., 1997; Fuchs, et al., 2000; McLemore, et al., 2005), нитроглицерин (Frobert, et al., 2005; Rembold, et al., 2000; Rembold, et al., 2001)), приводящими к увеличению уровня циклических нуклеотидов в клетке, сопровождается расслаблением гладкой мускулатуры, без существенного изменения уровня фосфорилирования легких цепей миозина (Flynn, et al., 2005; O Connor and Rembold, 2002; Rembold, et al., 2000; Woodrum, et al., 1999). Во всех работах, процитированных выше, было установлено, что расслабление гладких мышц сопровождается увеличением степени фосфорилирования Hsp20 по остатку Serl6, т.е. по тому участку, который фосфорилируется циклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами (Beall, et al., 1997). Фосфорилирование Hsp20 может быть вызвано не только активацией циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ, но и ингибированием фосфодиэстеразы под действием силденафила (Tessier, et al, 2004). В данном случае также наблюдалось расслабление сонной артерии свиньи, предварительно сокращенной под действием серотонина. В последние годы появились интересные данные об использовании коротких пептидных фрагментов Hsp20 для расслабления гладких мышц. Был синтезирован 24-членный пептид, содержащий короткую последовательность аминокислот (13 остатков) Hsp20, включающую в свой состав фосфорилированный Serl6, и специальную 11-членную последовательность, обеспечивающую проникновение исследуемого пептида через мембраны клетки (Flynn, et al., 2003; Tessier, et al., 2004). Оказалось, что добавление такого пептида приводит к расслаблению сонной артерии свиньи, предварительно сокращенной под действием серотонина (Flynn, et al., 2003) и подкожной вены человека (Tessier, et al., 2004). При этом, если аминокислоты/ входящие в состав пептида Hsp20, были переставлены местами в хаотическом порядке, то такой пептид проникал в клетки, но не был способен вызывать расслабления гладких мышц (Tessier, et al., 2004). Представленные данные хорошо согласуются с предположением о том, что фосфорилирование Hsp20 каким-то образом влияет на расслабление гладких мышц. Дополнительные факты в пользу этой гипотезы были получены в ходе ряда физиологических экспериментов. Оказалось, что тепловой шок, которому подвергали сонную артерию свиньи, приводил к увеличению степени фосфорилирования Hsp20, при этом не наблюдалось увеличения уровня циклических нуклеотидов (O Connor and Rembold, 2002; Rembold and Kaufman, 2003). Авторы этих исследований предполагают, что это связано со снижением активности протеинфосфатаз, дефосфорилирующих Hsp20. Термическая обработка (43-46С, 4 часа) колец артерий приводила к значительному снижению сократимости под действием гистамина, при этом наблюдалось лишь незначительное снижение уровня фосфорилирования легких цепей миозина (O Connor and Rembold, 2002; Rembold and Kaufman, 2003). Различные гладкие мышцы отличаются по своей чувствительности к фармакологическим соединениям, влияющим на внутриклеточный уровень циклических нуклеотидов. Так обработка сонной артерии форсколином (активатором аденилатциклазы) в сочетании с изобутилметилксаіггином (ингибитором фосфодиэстераз) сопровождается фосфорилированием Hsp20 и расслаблением. Аналогичная обработка пупочной вены не приводит к фосфорилированию Hsp20 и при этом не происходит расслабления (Brophy, et al., 1999). В то же время, если с помощью специальной транспортирующей системы ввести в пупочную вену Hsp20, фосфорилированный по остатку Serl6, то происходит заметное ингибирование сокращения, вызванного действием серотонина (Flynn, et al., 2005). Как видно из представленных результатов, на данный момент накоплено большое количество фактов, полученных in vivo, и свидетельствующих о том, что расслабление гладкой мускулатуры, вызванное повышением уровня циклических нуклеотидов, сопровождается фосфорилированием Hsp20 по остатку Serl6 и при этом не происходит заметного изменения уровня фосфорилирования легких цепей миозина. Эти факты не вызывают сомнения, однако для объяснения обнаруженных корреляций выдвигаются зачастую диаметрально противоположные предположения.
Один из механизмов предлагается группой авторов из лаборатории К. Брофи. По данным, полученным в этой лаборатории, предварительная обработка форсколином и изометилбутилксантином сонной артерии быка приводит к ингибированию сокращения гладкой мускулатуры под действием серотонина. При этом не происходит заметного изменения степени фосфорилирования легких цепей миозина, а также потребления кислорода (Woodrum, et al., 1999). Исходя из этих данных, авторы заключили, что расслабление не связано с нарушением формирования активного актом иозинового комплекса, а вызывается тем, что сократительный аппарат престает быть связанным с плотными тельцами, обеспечивающими прикрепление сократительного аппарата к мембране. Из данных, полученных при помощи ультрацентрифугирования изолированных белков, К. Брофи и соавт. сделали вывод о том, что нефосфорилированный Hsp20 взаимодействует с F-актином, а фосфорилированный - с G-актином (Brophy, et al., 1999). Сходная ситуация была выявлена и в случае с а-актинином. Методом коиммунопреципитации было показано, что при активации сокращения сонной артерии быка происходит усиление взаимодействия Hsp20 с а-актинином. Б то же время при расслаблении, вызванном форсколином, происходит ослабление взаимодействия Hsp20 с а-актинином (Tessier, et al., 2003). Авторы из лаборатории К. Брофи предполагают, что при сокращении Hsp20 не фосфорилирован и взаимодействует с актином и (или) а-актинином. Фосфорилирование Hsp20 по остатку Serl6 приводит к диссоциации этого белка от актина/а-актинина, следствием чего является нарушение связи между сократительным аппаратом клетки и плотными тельцами, обеспечивающими его взаимодействие с мембраной, и наступает расслабление.
Выделение Hsp20
В литературе описано несколько методов выделения Hsp20, однако каждый из них обладает некоторыми недостатками. Так, метод выделения этого белка из тканей человека или крысы, описанный Като и соавт. (Kato, et al, 1994; Kato, et al., 1992), является очень трудоемким, обладает малым выходом и предполагает использование высоких концентраций мочевины. К тому же, белок, выделенный из ткани, может быть частично фосфорилирован, что затруднило бы исследования влияния фосфорилирования на свойства Hsp20. В этом отношении методы получения рекомбинантного Hsp20 казались более простыми и эффективными. Однако описанные в литературе методы выделения рекомбинантного Hsp20 также предполагали либо использование мочевины и детергентов (van de Klundert, et al., 1998), либо были основаны на включении в первичную структуру белка дополнительных полигистидиновых последовательностей, упрощающих процедуру очистки (Brophy, et al., 1999). Из данных литературы известно, что малые Hsp представляют собой олигомерные белки, поэтому использование денатурирующих условий в процессе выделения может приводить к изменению четвертичной структуры этих белков (Andley, et al., 1996; Burgio, et al., 2001). Включение дополнительных последовательностей также может приводить к изменениям структуры (Lelj-Garolla and Mauk, 2005) или артефактам при изучении взаимодействия малых Hsp с белками-мишенями. Поэтому нами был разработан метод выделения рекомбинантного Hsp20 человека (Hsp20WT), не содержащего дополнительных последовательностей (меток) в наиболее щадящих, нативных условиях. Данный метод также подходит для получения высокоочищенных препаратов мутантаНзр20 с заменой Serl6 на Asp, имитирующей фосфор ил ирование (Hsp20D). Использование подобных замен неоднократно применялось при изучении различных малых Hsp (Benndorf, et al., 2001; Ehrnsperger, et al., 1999), а в работе Фан и соавт. (Fan, et al., 2004), выполненной на кардиомиоцитах, было показано, что введение данной мутации в полной мере имитирует эффект фосфорилирования Hsp20.
В основу метода получения высокоочищенных препаратов рекомбинантных Hsp20WT человека и Hsp20D, был положен метод, разработанный ранее в нашей лаборатории для выделения рекомбинантного Hsp25 птиц (Букач, et al., 2002). Стадии экспрессии белка и разрушения клеток были оставлены без изменений. Нужно отметить, что в использованных нами условиях экспрессии, Hsp20 оставался в растворимом виде и не попадал в тельца включения, что позволило избежать использования мочевины на ранних стадиях очистки. Б отличие от Hsp25, Hsp20 осаждается при меньших концентрациях сульфата аммония, и уменьшение степени насыщения сульфата аммония с 50% до 30% позволило увеличить степень очистки на этом этапе. Следующим этапом была очистка Hsp20 при помощи хроматографических методов. На первой стадии мы использовали ионообменную хроматографию на колонке Q-Sepharose (рис. 3.1). Использование этого метода позволяет избавиться от большинства примесных белков. Фракции, содержащие наиболее очищенный Hsp20 (38-54, рис. 3.1), объединяли и подвергали дальнейшей очистке. Препарат, полученный таким образом (рис. ЗЛБ, дорожка г), содержал небольшие количества относительно высокомолекулярных примесей, а основными примесными компонентами были белки с молекулярными массами 25 и 22 кДа.
Для дальнейшей очистки Hsp20 мы испробовали несколько хроматографических методов. Оказалось, что использование гель-хроматографии, в случае Hsp20 было неэффективным, поскольку на колонках Sephacryl S 300 и Sephacryl S 100 примесные белки элюировались в том же объеме, что и шгтересующий нас белок. Като и соавт. (Kato, et al., 1994) использовали на одной из стадий очистки хроматографию на S-Sepharose в присутствии мочевины. Однако при использовании хроматографии на катионообменнике в нативных условиях при кислых значениях рН Hsp20 очень прочно сорбировался на колонке и элюировался только в присутствии 6 М мочевины. Дальнейшие исследования показали, что при кислых значениях рН Hsp20 подвергается денатурации и выпадает в осадок (см. главу 2.2. раздела «Результаты исследования»). Поэтому метод катионообменной хроматографии при кислых значениях рН в отсутствие мочевины также оказался неприемлемым для очистки Hsp20.
Более эффективным методом оказалась гидрофобная хроматография на Phenyl-Sepharose. При проведении данного типа хроматографии при рН 7,0 примесные белки с большими молекулярными массами не сорбировались на колонке, a Hsp20 элюировался в самом конце градиента, однако избавиться от основных примесей полностью не удавалось. Переход к буферу с рН 8,0 позволил увеличить степень очистки интересующего нас белка и уменьшить потери. Увеличение рН привело к ослаблению сорбции Hsp20 на колонке, в то время как примесные белки элюировались при меньшем значении ионной силы (рис. 3.2).
Таким образом, разработанный нами метод, включающий фракционирование сульфатом аммония и сочетание ионообменной хроматографии на Q-Sepharose и гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose позволяет получить в нативных условиях препарат Hsp20 с высокой степенью очистки (рис. 3.3). Этот метод также подходит и для выделения мутанта Hsp20 с заменой S16D (Hsp20D), имитирующей фосфорилирование под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ.
Первым этапом наших исследований было определение шаперонной активности полученных препаратов Hsp20WT и Hsp20D. Шапероиная активность является одной из основных функцией малых белков теплового шока и состоит в предотвращении агрегации частично денатурированных белков.
Шапероиная активность Hsp20 in vitro была определена только в одной работе Ван де Клундерта и соавт. (van de Klundert, et al., 1998). Для хорошо изученных малых Hsp, таких, как Hsp25/27 и а-кристаллинов известно, что фосфорилирование или мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на шаперонную активность (Ito, et al., 2001; Koteiche and McHaourab, 2003; Rogalla, et al., 1999) (Panasenko, et al., 2002). Однако для Hsp20 подобных исследований проведено не было. Поэтому мы определили шаперонную активность полученных препаратов Hsp20 дикого типа (Hsp20WT) и его мутанта с заменой, имитирующей фосфорилирование Hsp20 под действием циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ (Hsp20D).
В качестве модельного белка-субстрата нами был использован инсулин, поскольку он использовался в ряде работ, посвященных изучению шаперонной активности малых Hsp (Farahbakhsh, et al., 1995; Haslbeck, et al., 1999; Sun, et al., 1997) и, в том числе, в работе Ван де Клундерта и соавт., посвященной Hsp20 (van de Klundert, et al., 1998). Восстановление дисульфидных связей инсулина приводит к агрегации его В-цепи. За агрегацией следили по увеличению светорассеивания, которое сопровождается ростом оптической плотности при 360 нм.
На рис. 3.4 представлено сравнение шаперонной активности Hsp20 дикого типа (Hsp20WT) (А), его ЗІбО-мутанта (Б) и коммерческого препарата а-кристаллина (В). Внесение избытка ДТТ в пробу, содержащую инсулин, сопровождается его агрегацией, которая начинается после небольшого лаг-периода (кривые 1). Присутствие в пробах Hsp20WT (панель А, кривые 2-4) приводило к уменьшению агрегации инсулина, и при весовом отношении инсулин:Н8р20УУТ, равном 1:1 (кривая 4), практически полностью предотвращало ее.
Образование гетероолигомерных комплексов cHsp27
Так,, при соотношении АДГ:шаперон, равном 2:1 (кривая 4), при котором белок дикого типа практически полностью предотвращал агрегацию, Hsp20D уменьшал амплитуду светорассеяния лишь в два раза, а существенное (хотя и неполное) предотвращение агрегации наблюдалось лишь при весовом соотношении AflT:Hsp20D, равном 1:1 (кривая 5 на рис. 3.13Б). Шаперонная активность а-кристаллина была сопоставимой с шаперонной активностью Hsp20D (рис. 3.13В). а-Кристаллин уменьшал амплитуду светорассеяния в той же степени что и S16D мутант, но гораздо слабее способствовал удлинению лаг-фазы агрегации АДГ (рис. 3.13Г).
Для более подробного изучения шаперонной активности малых Hsp мы использовали метод низкоскоростного центрифугирования. Для этого мы инициировали агрегацию АДГ добавлением ДТТ и ЭДТА, инкубировали пробы различные промежутки времени, центрифугировали их, а затем оценивали количество белка в осадках и супернатантах при помощи SDS-электрофореза. На рисунке 3.13Д, приведены результаты такого эксперимента при весовом соотношении АДГ:шаперон, равном 2:1. Изолированная АДГ образует достаточно крупные агрегаты и после 20 минут инкубации около 75% этого белка обнаруживалось в осадке (рис. 3.13Д, кривая 1), а после 60 минут инкубации он практически полностью переходил в осадок. Б присутствии Hsp20WT после 20 минут инкубации количество АДГ, оказавшейся в осадке (рис. 3.13Д, кривая 2), было в два раза меньше чем в контрольной пробе, и даже после 60 минут инкубации было примерно на 20% меньше, чем в пробе, ire содержащей шаперонов. В присутствии ct-кристаллина (кривая 4) количество преципитировавшей АДГ в малой степени отличалось от контроля, а шаперонная активность Hsp20D (кривая 3) оказывалась промежуточной по сравнению с Hsp20WT и а-кристаллином. При сравнении результатов, полученных методом центрифугирования, с данными, полученными при помощи метода светорассеяния при одном и том же соотношении шаперон:субстрат (рис. 3.13Г и Д), можно заметить некоторое несоответствие. Так, к примеру, в присутствии Hsp20WT амплитуда светорассеяния увеличивалась незначительно, в то же время в этих же условиях большое количество АДГ переходило в осадок. Аналогичные зависимости были характерны для Hsp20D и для а-кристаллина.
Кажущееся противоречие между данными, полученными двумя методами, по всей видимости, связано с тем, что комплексы, образованные шапероном и белком-субстратом, меньше по размеру, чем агрегаты изолированной АДГ, и поэтому обладают меньшим рассеянием, но при этом способны осаждаться при центрифугировании. Анализ содержания малых Hsp в осадках подтверждает это предположение (рис. 3.13Е). Hsp20WT, обладающий наибольшей шаперонной активностью, в наименьшей степени соосаждался с агрегированной АДГ. а-кристаллин, шаперонная активность которого была ниже, чем таковая Hsp20WT, в больших количествах обнаруживается в осадке агрегированной АДГ. По всей видимости, комплексы, образованные Hsp20 и субстратом, обладают меньшей молекулярной массой и (или) большей растворимостью и в меньшей степени осаждаются при центрифугировании. Таким образом, можно заключить, что при рН 7,0 Hsp20WT обладает высокой шаперонной активностью по отношению к АДГ. Замена Serl6 на Asp, имитирующая фосфорилирование Hsp20, приводит к снижению шаперонной активности этого белка, однако способность к подавлению агрегации модельного белка-субстрата у S16D мутанта остается большей, чем у коммерческого препарата а-кристаллина.
Совершенно иная картина наблюдалась при понижении рН до 6,0 (рис. 3.14). В этих условиях увеличивается скорость и амплитуда агрегации изолированной АДГ (рис. 3.14А-Г, кривые 1). Добавление в пробы увеличивающихся количеств Hsp20WT сопровождалось не уменьшением, а увеличением светорассеяния (рис. 3.14. А, кривые 2-5). Создается впечатление, что при рН 6,0 Hsp20WT не предотвращает, а наоборот способствует агрегации АДГ. При этом важно отметить, что изолированный Hsp20WT не агрегировал даже в самой высокой из использованных в опыте концентраций (рис. 3.14А, кривая 6). При рН 6,0 Hsp20D практически не влиял на амплитуду светорассеяния (рис. 3.14Б), а присутствие в пробах высоких концентраций сс-кристаллина, заметно (хотя и в меньшей степени, чем при рН 7,0) уменьшало агрегацию АДГ (рис. 3.14В). Для того чтобы попытаться объяснить полученные результаты мы прибегли к методу низкоскоростного центрифугирования. При прогревании АДГ в присутствии Hsp20WT и Hsp20D (рис. 3.14Д, кривые 2 и 3), при соотношении АДГ:шаперон, равном 1:1, количество белка-субстрата, обнаруживаемого в осадке, практически не изменялось по сравнению с контролем (рис. 3.14Д, кривая 1), а а-кристаллин лишь незначительно препятствовал осаждению АДГ (рис. 3.14Д, кривая 4). Сравнивая результаты, полученные двумя методами при одном и том же соотношении шаперон:субстрат (рис. 3.14Г и Д), можно заметить, что хотя в случае Hsp20WT и Hsp20D и наблюдалось увеличение амплитуды светорассеяния по сравнению с контролем, количество АДГ в осадке практически не изменялось. При анализе содержания малых Hsp в осадке АДГ оказалось, что значительная часть (около 40%) Hsp20WT, внесение которого по данным светорассеяния приводило к «антишаперонпому» эффекту, уже после 20 минут инкубации переходила в осадок (рис. 3.14Е, кривая 1). Следует отметить, что изолированный Hsp20WT полностью оставался в супернатанте даже после 60 минут инкубации (рис. 3.14. Е, кривая 4). а-Кристаллин, обладавший в этих условиях небольшой шаперонной активностью, соосаждался с АДГ в гораздо меньшей степени, чем Hsp20WT (ср. кривые 1 и 3 на рис. 3.14Е). По всей видимости, при рН 6,0 Hsp20 способен связывать денатурированную АДГ, однако образовавшиеся комплексы имеют либо очень большие размеры, либо обладают ограниченной растворимостью.
Подводя итог данной главы, можно заключить, что уменьшение рН от 7,0 до 6,0 приводит к уменьшению шаперонной активности Hsp20WT, Hsp20D и а-кристаллина. При этом наиболее заметное падение активности обнаруживалось у Hsp20WT. Мы предположили, что изменение шаперонной активности Hsp20 при уменьшении рН связано с изменениями его структуры, поэтому следующим этапом нашей работы было изучение влияния рН на олигомерное состояние и спектры кругового дихроизма этого белка.
