Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Структура и спектральные свойства цветных флуоресцирующих белков 8
1.1. Стабильность GFP -подобных белков 12
1.1.1. Влияние температуры 12
1.1.2. Влияние рН 12
1.1.3. Действие протеаз 13
1.2. Третичная структура GFP и его гомологов 13
1.3. Спектральное разнообразие GFP-подобных белков 15
1.4. Основные типы хромофоров GFP-нодобных белков 18
1.4.1. Зеленый хромофор GFP-типа 18
1.4.2. Структура красного хромофора DsRed типа 18
1.4.3. Структура хромофора asFP595 19
1.4.4. Структура хромофора Kaede 20
1.4.5. Структура хромофора zFP538 20
1.5. Формирование хромофора GFP, DsRed и zFP538 21
1.5.1. Формирование структуры «зеленого» хромофора 21
1.5.2. Формирование ацилимина в хромофоре DsRed-типа 24
1.5.3. Формирование желтого хромофора zFP538 27
ГЛАВА 2. Олигомеризация и агрегация цветных флуоресцирующих белков 30
2.1. Олигомеризация цветных флуоресцирующих белков 30
2.1.1. GFP из кишечнополостных Hydrozoa 30
2.1.2. Цветные белки из кораллов 30
2.1.3. Структура тетрамеров DsRed и zFP538 31
2.2. Агрегация цветных белков из кораллов 36
2.3. Биологическая функция GFP-нодобных белков 38
ГЛАВА 3. Влияние рн на флуоресценцию и поглощение цветных белков 41
3.1. Взаимодействие между хромофором и белковым окружением 41
3.2. Влияние рН на спектральные свойства GFP 43
3.3. Влияние рН на спектральные свойства хромопептидов GFP 46
3.4. Протонированные состояния хромофора GFP 49
3.4.1. Теоретические расчеты 49
3.4.2. Экспериментальные данные 54
ГЛАВА 4. Фотофизика и фотохимия gfp-подобных белков 57
4.1. Перенос протона в возбужденном состоянии 57
4.2. Поворот хромофора в возбужденном состоянии. Цис-транс изомеризация 58
4.2.1. Изучение модельных хромофоров 59
4.2.2. Модель фотоизомеризации 65
4.2.3. Изучение белков 66
4.3. Конформационная подвижность -бочонка GFP 70
ГЛАВА 5. Аппаратура, реагенты, методики экспериментов 72
5.1. Используемые реагенты и оборудование 72
5.2. Экспрессия и выделение zFP538 72
5.3. Выделение хромопентидов из zFP538 73
5.4. Спектроскопия и рН-метрия 75
5.4.1. Титрование хромопептидов 75
5.4.2. Титрование белка zFP538 75
5.5. Динамическое рассеяние света 77
5.6. Гель-фильтрация 77
5.7. Подготовка образца для сканирующей зондовой микроскопии 78
5.7.1. На поверхности стекла 78
5.7.2. Сорбция на поверхности графита 79
5.8. Кинетические измерения 79
5.9. Расчет значений рКа из рН-профилей 79
5.9.1. Одностадийная схема 1 80
5.9.2. Двустадийная схема 2 81
5.9.3. Трехстадийная схема 3 81
ГЛАВА 6. Анализ рн-зависимостей хромопептидов 83
6.1. Имино-форма хромопептнда zFP538. Поглощение 83
6.2. Имино-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция 92
6.3. Кето-форма хромопептнда zFP538. Поглощение 94
6.4. Кето-форма хромопептнда zFP538. Флуоресценция 96
ГЛАВА 7. Анализ рн-зависимостей желтого белка zFP538 98
7.1. рН-зависимости поглощения желтого белка zFP538 98
7.1.1. Поглощение концентрированного раствора 98
7.1.2. рН-зависимость поглощения разбавленного раствора zFP538 103
7.2. рН-зависимости флуоресценции zFP538 107
7.2.1. Флуоресценция растворов с высокой концентрацией белка 107
7.2.2. Флуоресценция разбавленных растворов zFP538 109
7.2.3. Эффект начального значения рН 112
7.2.4. Анализ полных рН-профилей флуоресценции разбавленных растворов zFP538. 115
7.2.5. Нелинейность зависимости интенсивности флуоресценции zFP538 от концентрации белка 117
ГЛАВА 8. Оценка размеров агрегатов zFP538 120
8.1. Светорассеяние 120
8.2. Гель-фильтрация 120
8.3. Исследование агрегации zFP538 с помощью микроскопии 123
8.3.1. На поверхности стекла 123
8.3.2. На поверхности графита 129
ГЛАВА 9. Кинетика кислотной денатурации zFP538 135
9.1. Кинетические кривые 135
9.2. Спектральные изменения, наблюдаемые при кислотной денатурации zFP538 140
9.3. Предполагаемая схема кислотной инактивации zFP538 143
ГЛАВА 10. Механизмы стабилизации структуры zfp538 за счет агрегации 144
Выводы 151
Список литературы 153
Приложения 168
- Спектральное разнообразие GFP-подобных белков
- Структура тетрамеров DsRed и zFP538
- Влияние рН на спектральные свойства хромопептидов GFP
- Изучение модельных хромофоров
Введение к работе
Многие годы GFP изучался очень небольшой группой исследователей как белок, являющийся частью биолюминесцентной системы стрекающих кишечнополостных Hydrozoa. Лишь в 1992 году была установлена его аминокислотная последовательность [1]. Решающий прорыв в практическом применении GFP произошел после того, как зеленый белок был клонирован [1], и было показано, что экспрессия гена GFP в других организмах также приводит к появлению флуоресцирующего белка [2, 3]. Следовательно, ген содержит всю информацию, необходимую для посттрансляционного синтеза хромофора.
После этого открытия интерес к GFP чрезвычайно возрос, и этот белок стали активно использовать для фундаментальных исследований в клеточной биологии, онтогенетике (биологии развития), нейробиологии и экологии. Начиная с 1999 года, разнообразные разноцветные гомологи GFP были выделены из многочисленных организмов Anthozoa (кораллы, морские актинии и др.), и даже из ракообразных. В настоящее время зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его гомологи широко используются в качестве генетически кодируемых флуоресцентных маркеров, позволяющих исследовать многообразные процессы, происходящие в живых клетках, тканях и организмах. Использование таких индикаторов позволяет изучать локализацию и транспорт различных белков внутри клетки, уровень экспрессии генов, взаимодействия между белками в клетке, определять концентрацию низкомолекулярных метаболитов, некоторых физиологически важных ионов (Са , СГ), рН и редоксипотенциал внутренней среды, изучать сигнальные пути и взаимодействия рецептор-лиганд, определять ферментативную активность в живых клетках [4, 5, 6, 7]. Флуоресцирующие белки могут быть гетерологически экспрессированы в любых клетках, и для наблюдения их флуоресценции не требуется каких-либо дополнительных ферментов или кофакторов, за исключением кислорода. Особые преимущества молекулярных сенсоров проявляются при исследовании Ферстеровского переноса энергии (FRET) - широкий выбор донорно-акцепторных пар обеспечивается хорошим перекрыванием спектров флуоресценции и поглощения в постоянно пополняющемся ряду цветных белков.
Цветные белки из Anthozoa (кораллы, актинии, зоантиды и др.) превосходят GFP по спектральному разнообразию и стабильности, однако проигрывают в том, что являются облигатными олигомерами, более медленно созревают и обладают ярко выраженной склонностью к агрегации. Агрегация является общим свойством этих белков, что можно объяснить высокой степенью гомологии между ними. Образование олигомеров не мешает
применению этих белков для наблюдения за уровнем экспрессии генов, но может быть помехой использованию белков в качестве репортерных генов для изучения белок-белковых взаимодействий (методы на основе FRET) и внутриклеточной локализации белков. Агрегация ФБ внутри клеток вообще может привести к токсическому эффекту. Если олигомеризация и агрегация цветных белков из кораллов являются нежелательными с точки зрения их применения, то нельзя исключить возможную важность этих процессов для формирования спектральных свойств и функциональности этих белков в природе. Так, например, димеризация GFP из Aequorea victoria влияет на форму спектра поглощения. Красный флуоресцирующий белок из кораллов Discosoma drFP583 (также известный как DsRed) существует в виде облигатного тетрамера, стабильного даже в растворах с очень низкой концентрацией белка. Полученный методами генной инженерии мономер этого белка характеризуется не только сдвигом спектров поглощения и флуоресценции, но и уменьшением квантового выхода флуоресценции. Однако в литературе нет прямых данных о влиянии олигомеризации DsRed на его спектральные свойства, а наблюдаемые различия могут быть следствием интенсивного мутагенеза (33 мутации), необходимого для получения мономерного флуоресцирующего белка, а не следствием олигомерного состояния.
Поглощение и флуоресценция желтого флуоресцирующего белка zFP538, выделенного из ротового диска пуговичного полипа Zoanthus (рифовые кораллы) [8], лежат в диапазоне длин волн между флуоресценцией зеленых и поглощением красных белков. Это дает возможность использовать zFP538 для индуктивно-резонансного переноса энергии, лежащего в основе многих методов анализа с использованием цветных белков. Желтый белок zFP538, как и многие другие цветные белки из кораллов, образует тетрамеры и более высокомолекулярные агрегаты, однако влияние агрегации на спектральные свойства не исследовано, и нельзя исключить важность этих процессов для функциональности цветных белков в природе. Цветные флуоресцирующие белки обычно используются для исследования живых биологических систем, рН внутри которых может сильно изменяться даже в пределах одной клетки, поэтому представляет интерес оценить влияние рН на яркость и стабильность zFP538.
Спектральное разнообразие GFP-подобных белков
Наиболее интересным свойством GFP является то, что его хромофор формируется в результате автокаталитической посттрансляционной циклизации определенного участка собственной аминокислотной последовательности белка. Предложены три механизма формирования хромофора GFP, при этом многие аспекты остаются до сих пор не выясненными. Согласно первому механизму, предложенному в [55, 56], GFP прежде всего сворачивается и принимает почти нативную конформацию, затем посредством нуклеофильной атаки амидного азота глицина 67 на карбонильный атом углерода остатка 65 и последующей дегидратации образуется имидазолидон. Наконец, под действием молекулярного кислорода происходит дегидрирование а-/7 связи остатка 66, что приводит к сопряжению между ним и имидазолидоном (рис. 12). Только на этой стадии хромофор приобретает способность поглощать видимый свет и флуоресцировать. Данная схема основана на следующих аргументах, (а) Для появления флуоресценции требуется атмосферный кислород [34]. (б) Флуоресценция GFP в анаэробных организмах возрастает по простому экспоненциальному закону после подачи воздуха и практически не зависит от концентрации самого GFP и клеточных кофакторов [34]. (в) Аналогичные имидазолидоны окисляются спонтанно [57]. (г) Предложенная циклизация аналогична известной тенденции последовательности Asn-Gly образовывать циклические имиды. Глицин несомненно является лучшим нуклеофилом в подобных циклизациях, поскольку создает минимальные стерические затруднения, кроме того, Gly67 сохраняется во всех флуоресцирующих мутантах GFP.
Анализ формирования хромофора GFP in vitro, впервые проведенный в работе [56] для 865Т-мутанта, показал, что процесс формирования зеленого хромофора состоит из трех отдельных кинетических стадий. Стадия сворачивания белка происходит довольно медленно (kf = 2,44x10"3 с 1, Ua = 284 с) и предшествует какой-либо модификации хромофора. Затем происходит циклизация трипептида хромофора (кс = 3,8x10"3 с"1, t\a = 180 с). Скорость лимитирующей стадией является окисление циклического хромофора, проходящее с константой скорости kox = l lxlO"4 с"1 (время полупревращения 76 мин). Скорость окисления значительно меняется для разных мутантов GFP. Поскольку формирование хромофора de novo из очищенного денатурированного белка происходит как процесс первого порядка, был сделан вывод об автокаталитическом характере формирования хромофора [56]. Подтверждение автокаталитического механизма созревания хромофора было получено в результате полного химического синтеза белковой молекулы-предшественника GFP A. victoria [58], из которой в условиях рефолдинга образовался GFP, идентичный по спектральным свойствам нативному белку.
Один из предполагаемых механизмов формирования хромофора в зеленом флуоресцирующем белке [55].
После синтеза белка флуоресценция GFP дикого типа появляется спустя временной промежуток от 90 минут до 4 часов [34]. Методами мутагенеза удается получать более быстро созревающие варианты цветных белков. Так, например, на основе зеленого флуоресцирующего белка, выделенного из копеподы Pontellina plumata [39], был получен мутант TurboGFP [11], созревающий в течение нескольких минут. Конформационный анализ методом молекулярной механики с использованием кристаллической структуры GFP дикого типа показал, что хромофор формирующие остатки несозревшего GFP предварительно плотно организованы так, что расстояние между карбонильным углеродом Ser65 и амидным азотом Gly67 составляет менее 2,9 А. -бочонок, образованный 11 /7-листами, не только реализует такую плотную «упаковку», которая требуется для формирования хромофора, но и существенно ограничивает конформационную подвижность хромофор формирующей области. Таким образом, остатки сохраняются на нужных для протекания автокаталитической циклизации позициях [59].
Образование структуры /?-бочонка и последующее образование хромофора в значительной степени зависит от температуры. Медуза A. victoria в природе встречается в холодных водах Тихого океана, поэтому зрелый белок наиболее эффективно образуется при температурах ниже 37С. Неправильный фолдинг приводит к агрегации белка в виде телец включения, препятствуя образованию хромофора и развитию флуоресценции [60]. Кроме неправильного фолдинга и агрегации образование хромофора GFP при 37С может быть неэффективным вследствие того, что карбонильный углерод Ser65 находится в недостаточной близости от амидного азота Gly67 для протекания автокаталитической циклизации [61]. Поскольку это ограничивает возможности использования GFP, то были предприняты попытки получить мутанты с эффективным фолдингом при более высоких температурах, и эти попытки оказались успешными [4].
В альтернативном механизме формирования хромофора, предложенном в [62], дегидрирование Тугбб предшествует циклизации. Это предположение основано на расчетах функциональной плотности, показавших, что общепринятый механизм энергетически неблагоприятен и приводит к значительной эндотермичности процесса при образовании имидазолидонового кольца и требуемого промежуточного соединения. Альтернативный механизм является более вероятным с энергетической точки зрения, так как приводит к менее нестабильному интермедиату и энергиям реакции, близким к термонейтральным.
Совсем недавно появилась работа, в которой предлагается третий вариант механизма созревания GFP [63]. Исследуя кинетику созревания GFP методами ВЭЖХ и масс-спектрометрии, отслеживая изменение концентрации образуемого в процессе созревания белка пероксида водорода, а также исследуя созревание Y66L мутанта, авторы предположили, что в высоко аэробных условиях преобладает следующий механизм. На первой стадии происходит фолдинг белка и циклизация трипептида (характеристическое время 1,5+1,1 мин), при этом циклизация является обратимым процессом и идет в обратном направлении при кислотной денатурации. Второй, скоростьлимитирующей, стадией является окисление (дегидрирование), происходящее с характеристическим временем 34±1,5 мин. На последней стадии (10,6+1,2 мин) происходит дегидратация пятичленного гетероцикла, которая ускоряется в присутствии общего основания, удаляющего протон с Ср атома Тугбб (рис. 13).
Структура тетрамеров DsRed и zFP538
Тетрамерные красный флуоресцирующий белок DsRed и eqFP611 из Enlacmaea quadricolor [74] были иммобилизованы на поверхности в пикомолярных концентрациях. Последующее изучение флуоресцентного поведения отдельных молекул и их фотообесцвечивания показало, что DsRed все еще образует олигомеры даже при таких низких концентрациях [75]. В отличие от DsRed, eqFP611 проявляет одностадийное обесцвечивание при похожих условиях, что указывает на мономерное состояние [74]. Различия в силе взаимодействия между мономерами в тетрамере также показано методом электрофореза в присутствии 1% додецилсульфата натрия без кипячения образцов перед нанесением в гель, при котором миграцию полос белка можно отслеживать по флуоресценции. В то время как DsRed мигрирует в геле как тетрамер (-100 кДа), eqFP611 движется в виде мономера (-26 кДа) [74]. Помимо eqFP611, примерами относительно слабых взаимодействий в области А-В интерфейсов являются такие белки, как HcRed из Heteractis crispa, Rtms5 из Montipora efflorescens, Azami Green из Galaxea, EosFP из Lobophyllia hemprichii и cmFP512 из Cerianthus membranaceus [30, 76, 77, 78, 79].
Важно отметить, что, по-видимому, каждый белок склонен образовывать гомотетрамеры, а не гетеротетрамеры. Методом флуоресцентной микроскопии было показано, что в живых кораллах ФБ разных цветов обычно экспрессируются в разных клетках организма [28].
Влияние олкгомеризаиии па спектральные свойства. В случае GFP из A. victoria олигомеризация проявляется в виде зависимости формы спектра поглощения от концентрации белка. При димеризации наблюдается усиление главного пика возбуждения при 395 нм за счет дополнительного пика при 475 нм [4, 55]. Наличие в спектре поглощения GFP из A. victoria двух полос поглощения (при 395 и 475 нм) обусловлено разными состояниями ионизации хромофора, равновесие между которыми поддерживается благодаря сети водородных связей, включающих Glu222, Ser205, связанную молекулу воды, а стабилизация ионизированного состояния хромофора происходит за счет перемещения боковых групп Thr203 и His 148, а также за счет взаимодействия с Arg96 и Gln94 [68]. Боковые группы аминокислотных остатков 221 и 223 выступают в область гидрофобного интерфейса димера GFP, a Glu222 - погружена внутрь уб-бочонка и связана водородной связью с боковой группой Ser65 хромофора. Таким образом, существует непрерывная сеть, соединяющая поверхностные гидрофобные остатки с хромофором через Glu222. Эта сеть «регулирует» взаиморасположение остатков внутри белка, смещая равновесие между нейтральной и ионизированной формами хромофора. При димеризации GFP происходит такое изменение в этой сети, которое уменьшает долю ионизированного хромофора. В структуре S65T мутанта GFP за счет стерических затруднений сеть водородных связей стабилизируется таким образом, что хромофор находится в ионизированном состоянии и поглощает только при 489 нм, и димеризация не влияет на спектр. В случае Renilla GFP, который всегда является димером, наличие контакта между мономерами, возможно, способствует такому расположению групп внутри белка, что хромофор всегда находится в ионизированном состоянии, в результате чего его максимум сдвинут до 498 нм и не изменяется под воздействием широкого спектра внешних возмущений [66].
Олигомеризация ФБ из кораллов не мешает их применению в качестве репортеров экспрессии генов, но она практически исключает применение ФБ как флуоресцентной метки в белках слияния, особенно если белки-мишени также являются олигомерами. Таким образом, для биологического применения олигомеризация цветных белков из кораллов является осложняющим процессом и ее подавление было бы желательно, но в отношении влияния на спектральные свойства нет однозначного ответа. Если для некоторых белков введением одиночных мутаций (например, замена Phel62His для Rtms5 [46]) можно получить мономеры или димеры без влияния на спектральные свойства, то другие белки очень чувствительны к олигомерному состоянию. По мнению некоторых авторов, образование тетрамерной структуры может играть определенную роль в процессе созревания цветных белков, в частности DsRed [80]. Для получения мономерной формы DsRed методами мутагенеза в область гидрофобных и гидрофильных интерфейсов было введено 13 мутаций. Однако эти изменения привели к полной потере флуоресценции, и только введением дополнительных 20 замен удалось получить флуоресцирующий мономер DsRed. Таким образом, мономерный мутант DsRed, названный mRFPl, содержит 33 мутации, из которых 13 находятся внутри уб-бочонка, 3 - на N-концевом участке, 13 - в области тетрамерных интерфейсов, точный эффект остальных 4 замен пока не известен. Хотя mRFPl имеет в 1,3 раза более низкий коэффициент молярного поглощения, в 3,2 раза более низкий квантовый выход и менее устойчив к фотообесцвечиванию по сравнению с DsRed дикого типа, он созревает более быстро ( 10 раз) и, поэтому, имеет аналогичную DsRed яркость в живых клетках [81], кроме того, он характеризуется сдвинутыми на 25 нм в красную область спектрами поглощения и флуоресценции. Подобные спектральные изменения, скорее всего, являются следствием интенсивного мутагенеза, а не следствием олигомерного состояния. В литературе нет прямых данных о влиянии олигомеризации DsRed на его спектральные свойства.
Замена некоторых аминокислот в области гидрофильного А-С интерфейса приводит к потере флуоресценции белка eqFP611 (разрушение гидрофобного А-В интерфейса не влияет на флуоресценцию, тетрамеры легко диссоциируют на димеры в присутствии додецилсульфата натрия или при разбавлении), что свидетельствует о ключевой роли взаимодействий в области А-С интерфейса в сворачивании белка в его функциональную форму [73]. С помощыо мутагенеза была получена димерная форма eqFP611 из морской актинии Entacmaea quadricolor [73], и мономерная форма зеленого флуоресцирующего белка из Pectiniidae sp., которую назвали Dronpa [82].
Прямым следствием олигомерного состояния является перенос энергии между несозревшими зелеными и созревшими красными хромофорами в DsRed, что приводит к практически полностью красному белку, несмотря на то, что примерно половина всех молекул DsRed находится в несозревшем зеленом состоянии [83].
Часто олигомеризация является источником стабилизации белков и служит для выполнения их функций [84, 85], кроме того, она может способствовать сворачиванию мономера. Тетрамерной структурой объясняется большая термостабилыюсть DsRed и устойчивость к действию денатурирующих агентов, таких как гуанидингидрохлорид, по сравнению с мономерным GFP [86].
Влияние рН на спектральные свойства хромопептидов GFP
Для понимания процессов, протекающих в цветных белках при изменении рН, важно знать, что происходит с самим хромофором и каково влияние белкового окружения на спектральные свойства хромофора. GFP из A. victoria и Renilla обладают разными спектральными свойствами (максимум поглощения GFP из A. victoria более чем на 100 нм сдвинут в синюю область по сравнению с главной полосой поглощения GFP из Renilla) и по-разному реагируют на изменение рН, однако их хромофоры химически идентичны [107]. Таким образом, разница в спектральных свойствах этих белков является следствием разного взаимодействия между хромофором и его окружением в белке.
Для того чтобы исследовать спектральные свойства хромофора без влияния на них белкового окружения, ряд авторов синтезировали различные модельные соединения и сравнивали их свойства со свойствами белков и выделенных из них хромопептидов (рис. 23).
Спектры поглощения модельных соединений оказались похожими, но не идентичными спектрам хромопептида, выделяемого из GFP (максимум поглощения 380 нм при рН 4 и 445 нм при рН 11, изобестическая точка в районе 405 нм). При рН 12 эти соединения имеют максимум поглощения при 430 нм, а в кислом растворе (рН 3-7,5) — при 370 нм, что достаточно сильно отличается от свойств пептида. В диапазоне рН 1-3 и нативный и синтетический хромофор имеют максимум поглощения вблизи 380 нм, однако в случае модельного соединения положение максимума рН-зависимо: он сдвигается в красную область при понижении рН. Только при рН 2 максимум поглощения модельного хромофора совпадает с нативным хромофором (380 нм), а при более высоких значениях рН он сдвинут по отношению к нему в синюю область. Таким образом, основываясь только на простом сравнении спектральных характеристик модельного соединения и нативного хромофора, нельзя сделать вывод о структуре последнего.
Спектральное поведение пептидного фрагмента GFP, содержащего хромофор (Thr63-Phe64-Ser65yr66-Gly67-Val68-GIn69) аналогично поведению самого белка в растворах с экстремальными значениями рН (0,1 М НС1 и 0,1 М NaOH), на основании чего был сделан вывод о неповрежденное ковалентной структуры хромофора при обработке белка протеазой, а также о том, что структуры хромофоров в пептиде и белке похожи [108]. Максимумы поглощения и формы спектров для пептида и модельного соединения при низких и высоких рН хорошо соответствуют друг другу: 382 и 447 нм для пептида, 376 и 443 нм для модельного хромофора (рис. 23, структура 2). Эти значения близки к полученным при таких же условиях максимумам поглощения нативного GFP (382 и 447 нм) [107].
Спектральные характеристики чувствительны к микроокружению (полярности растворителя), особенно в случае анионной формы хромофора (максимум поглощения 443 нм в 2-пропаноле и 425 нм в воде) [108]. Это может быть связано с лучшей стабилизацией в полярном растворителе основного фенолятного состояния по сравнению с возбужденным.
При охлаждении до температуры жидкого азота и хромопептид и модельное соединение сильно флуоресцируют с максимумом в районе 435- 37 нм в сильно кислом растворе и в районе 475-490 нм в сильно щелочном, при этом их спектры похожи [108]. При 77 К флуоресценция становится преобладающим процессом перехода из возбужденного состояния в основное, а процессы, приводящие к безызлучательной релаксации возбуждения, замедлены. Сравнение положения данных максимумов флуоресценции с характерным для нативного белка (509 нм) позволяет предполагать, что ответственным за излучение нативного белка является синглетное возбужденное состояние анионной формы хромофора.
Максимум полосы поглощения модельного соединения (рис. 23, структура 3) в сильно разреженном газе расположен при 479 нм, а время жизни аниона в возбужденном состоянии составило примерно 100 мке [109]. Между полосой поглощения газообразного аниона (479 нм) и второй полосой поглощения белка (477 нм) наблюдается большое сходство. Это дало основание заключить, что действительное окружение хромофора внутри белка гораздо больше напоминает вакуум, нежели растворитель, и вторая полоса в спектре белка наблюдается действительно благодаря поглощению анионной формы хромофора [109]. Другими словами, распределение электронной плотности в хромофоре GFP из A. victoria соответствует таковому в газофазном анионе (рис. 23, структура 3). Это, однако, не отрицает влияние белкового окружения на фотофизику хромофора. Основное (невозбужденное) состояние хромофора определяется его локальным окружением, а именно наличием доноров и акцепторов протона, что объясняет, почему фотофизические свойства хромофора могут значительно варьировать у разных белков и их мутантов. Для спектров поглощения данного модельного хромофора (рис. 23, структура 3) в воде свойственна сильная зависимость от рН, что свидетельствует о больших изменениях в делокализации электрона [109]. При рН 1 максимум находится при 396 нм (что практически совпадает с основным максимумом поглощения нативного GFP в нейтральном растворе), при рН 7 максимум сдвигается до 370 нм, а при рН 13 - до 426 нм. Нативный белок обеспечивает близкое к вакууму окружение хромофора, тогда как при денатурации белка хромофор экспонируется в растворитель. Модельный хромофор при перенесении из вакуума в объем растворителя претерпевает все же больший синий сдвиг, чем хромофор GFP при денатурации белка. Это может быть связано с тем, что модельный хромофор в растворе сильнее экспонирован в растворитель, тогда как хромофор в денатурированном GFP все еще ковалентно связан с белком. На основании своей работы авторы [109] сделали вывод, что точное положение полосы поглощения анионной формы хромофора GFP почти полностью объясняется химическими свойствами самого хромофора, а не взаимодействием его с боковыми группами аминокислот белка.
Изучение модельных хромофоров
В общем случае возможны три пути деформации планарного ФС, приводящие к его безызлучателыюй дезактивации: поворот относительно одинарной связи (изменение торсионной координаты ср) с образованием ПИ1, поворот относительно двойной связи (изменение торсионной координаты т) с образованием ПИ2 и одновременное изменение обеих торсионных координат (деформация «хула-твист», XT). Согласно ab initio расчетам [125], преимущественным путем распада ФС в вакууме является образование ПИ1, поскольку альтернативный переход ФС— ПИ2 проходит через энергетический барьер в 2 ккал/моль (рис. 27Б). Наличие барьера 1 ккал/моль в простейшей модели Аррениуса несовместимо с ультрамалым временем жизни флуоресцирующего состояния (субпикосекунды), экспериментально определенным по затуханию флуоресценции модельного хромофора (структура 2 на рис. 23) в спиртовых растворах [122, 123]. Область конического пересечения поверхностей потенциальной энергии Si и So, соответствующая одновременному изменению торсионных координат т и ф, лежит существенно выше по энергии (на 14 ккал/моль относительно ПИ2, на 12 ккал/моль относительно ПИ1 и на 5 ккал/моль относительно ФС), поэтому вовлечение «хула-твист» деформации в распад ФС можно исключить, особенно с учетом малого времени жизни ФС. Исследование временной зависимости восстановления основного электронного состояния модельного хромофора (структура 3 на рис. 23) в трех спиртовых растворителях [122], позволяет оценить верхнюю границу времени жизни возможного нефлуоресцирующего («темного») интермедиата - 2 пс. Экспериментально наблюдаемое отсутствие фотохимического превращения цис-изомера вещества 3 (рис. 23) в транс-изомер свидетельствует в пользу безызлучателыюго перехода Si So через ПИ1, а не через ПИ2 или «хула-твист», т.к. только в случае ПИ1 восстанавливается исходный цис-изомер и не образуется альтернативный транс-изомер.
Слабая зависимость времен затухания флуоресценции модельного хромофора от вязкости растворителя [122] указывает на малогабаритную деформацию молекулы в возбужденном состоянии и свидетельствует против цис-транс изомеризации (изменение угла т), которая, как было показано для стильбенов, чувствительна к вязкости растворителя [126]. Движение ФС- ПИ1 (деформация планарного ФС путем изменения угла ф), как показано для анионного модельного хромофора [125], не требует существенного изменения формы молекулы и сравнимо в этом плане с деформацией «хула-твист», поэтому оно согласуется с экспериментальными данными.
Стоит отметить, что предложенная схема (рис. 27) строго верна для флуорофора GFP в вакууме. Взаимодействия с растворителем и противоионом могут изменить профили энергии и преобладание процесса ФС—»ПИ1, например, для нейтральной формы модельного хромофора 1 показана значительная стабилизация растворителем ПИ2-подобного состояния. Однако данный механизм может быть справедлив и для раствора, поскольку он согласуется с экспериментально наблюдаемыми ультрабыстрыми появлением и затуханием флуоресценции модельного анионного хромофора (структура 3 на рис. 23) в растворе, а также с отсутствием фотохимического превращения и низкой чувствительностью к вязкости растворителя. Кроме того, рассчитанное значение вертикальной энергии возбуждения So- Si соответствует значению максимума поглощения 465 нм, что согласуется с пиком поглощения анионного хромофора GFP при 77 К [116] и 865Т-мутанта GFP [127], содержащего анионный хромофор.
Влияние белкового окружения на флуоресценцию хромофора в предложенном механизме может сводиться к появлению энергетического барьера между планарным флуоресцирующим состоянием и изогнутым нефлуоресцирующим интермедиатом. Этот барьер может быть обусловлен дестабилизацией отрицательного заряда на имидазолыюй части хромофора в белке, поскольку, как показано, в возбужденном состоянии при вращении фенильной группы хромофора относительно одинарной связи (изменение угла ф) происходит перераспределение отрицательного заряда с фенольного на имидазольное кольцо хромофора [125]. Другое объяснение роли белка в увеличении квантового выхода флуоресценции (или времени жизни флуоресцирующего состояния) основано на ограничениях деформации планарного флуоресцирующего состояния за счет стерических взаимодействий. Однако деформация ФС— ПИ1 представляет собой ограниченное геометрическое изменение, которое включает в себя частичное вращение фенильного кольца относительно одинарной связи между кольцами с сохранением водородной связи при фенольном кислороде и возможно в условиях фиксированной посредством двух ковалентных связей ориентации имидазольной части хромофора относительно полости белка. Что касается движения ФС ПИ2 и ФС- КП(ХТ), то для них сохранение водородной связи маловероятно.
В [124] полуэмпирическими (QM/MM) методами была смоделирована динамика возбужденного состояния протонированной формы хромофора GFP (структура 6 на рис. 23, в которой атом кислорода фенольного кольца протонирован). Согласно полученным результатам, в изолированном хромофоре (в вакууме) и в водном окружении наблюдается значительное (на 1 порядок) изменение времени жизни в возбужденном состоянии: водное окружение ускоряет возвращение в основное состояние (заселенность возбужденного S1 состояния уменьшается по экспоненциальному закону с характеристическими временами 300-500 фс в вакууме и 70 фс в воде). Это ожидаемое явление, поскольку известно, что если важную роль в фотоизомеризации играют состояния с переносом заряда (как в случае ретиналя), то ионизированные остатки аминокислот (или вода), окружающие связь С=С, будут ускорять реакцию и увеличивать квантовый выход изомеризации [124]. Согласно расчетам, при переходе из вакуума в раствор изменяется механизм депопуляции возбужденного состояния. Если в вакууме минимальное по энергии коническое пересечение (МЭКП) Si и So поверхностей потенциальной энергии (ППЭ) на -0,3 эВ лежит выше по энергии по сравнению с минимумом на ППЭ Si (хромофор в повернутом состоянии), то при сольватации состояние МЭКП (пересечение ППЭ Si и So) становится абсолютным минимумом на ППЭ Si, в результате чего внутренняя конверсия из Si в So становится преобладающим процессом [124]. Так как в вакууме энергетически более выгодным является повернутое состояние хромофора (минимум на ППЭ Si), то он не флуоресцирует, в отличие от белкового окружения, в котором геометрия хромофора планарна, и он флуоресцирует. Белковое окружение в GFP не просто выполняет роль «сосуда на молекулярном уровне», а играет главную роль в изменении реакционноспособности возбужденного состояния хромофора.
