Содержание к диссертации
Введение
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ТРАНСГИДРОГЕНАЗ 10
1. Физико-химические свойства трансгидрогеназы 10
2. Стереохимия трансгидрогеназной реакции 12
3. Субстратная специфичность пиридиннуклеотидтрансгидрогеназы 14
4. Обратимые ингибиторы трансгидрогеназной реакции 15
5. Кинетика трансгидрогеназной реакции 17
6. Механизм сопряжения трансгидрогеназной реакции с процессом преобразования энергии 24
7. Стехиометрия транслокации протонов трансгидрогеназойїЗЗ
8. Регуляция трансгидрогеназной реакции электрохимическим потенциалом ионов водорода 38
9. Функциональные группы пиридиннуклеотидтрансгидро-геназы 39
10. Парциальные реакции 50
11. Физиологическая роль пиридиннуклеотидтрансгид-рогеназы 57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 60
1. Выделение митохондрий из сердца быка 60
2. Получение субмитохондриальных частиц 50
3. Выделение митохондрий из мечени крысы 51
4. Получение субмитохондриальных частиц из митохондрий печени крысы 52
5. Определение трансгкдрогеназной активности в субмитохон-дриальных частицах 63
6. Модификация митохондриальной трансгидрогеназы
-хлормеркурибензоатом (ІШБ) 64
7. Обработка митохондрий цистеином 64
8. Обработка субмитохондриальных частиц цистеином 64
9. Синтез арильных производных кофермента А (КоА) и дефосфо-кофермента А (дфКоА) 65
а) Синтез s -7-нитробензофуразан~4ильного произ
водного КоА (НБФ-КоА) 65
б) Синтез s -7-нитробензофуразан~4ильного произ
водного дфКоА 66
в) Синтез s -2,4-динитрофенильного производного КоА.. 66
г) Синтез s-2,4-динитрофенильного производ
ного дфКоА 67
10. Модификация митохондриальной трансгидрогеназы пири-
доксаль-5 -фосфатом 67
11. Определение концентрации белка 67
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Выяснение роли сульфгидрильных групп трансгидрогеназы, расположенных на внешней стороне внутреней мембраны митохондрий в активности фермента 69
2. Взаимодействие трансгидрогеназы с арильными производными КоА и дфКоА 76
а) Синтез и свойства арильных производных КоА и дфКоА. 76
б) Ингибирование арильными производными КоА мито
хондриальной трансгидрогеназы 79
3. Взаимодействие трансгидрогеназы с пиридоксаль-фосфатом 95
ЗШЮЧЕНЙЕ ИЗ
ВЫВОДЫ II?
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 118
- Физико-химические свойства трансгидрогеназы
- Выделение митохондрий из сердца быка
- Выяснение роли сульфгидрильных групп трансгидрогеназы, расположенных на внешней стороне внутреней мембраны митохондрий в активности фермента
Введение к работе
Важным этапом в развитии современной биоэнергетики явилось подтверждение хемиосмотической концепции энергетического сопряжения, выдвинутой Митчеллом / I /. Согласно хемиосмотическому механизму, перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий сопряжен с возникновением трансмембранной разности электрохимических потенциалов ионов водорода-д|Н+ на сопрягающей мембране. Энергия, запасенная в виде аіЇі Н+, используется протонной аденозинтрифосфата-зой для синтеза АТФ, а также трансгидрогеназой для накопления НАДФН.
Трансгидрогеназа, локализованная во внутренней мембране митохондрий, может катализировать и обратную реакцию.
При окислении НДЦФН с помощью НДЦ+, катализируемом трансгидрогеназой в субмитохондриальных частицах, наболюдается защелачива-ние внешней среды, поглощение субмитохондриальными частицами липо-фильных анионов и синтез АТФ. Полученные данные указывают на то, что трансгидрогеназа может функционировать как генератор дju Н+.
Таким образом, митохондриальная трансгидрогеназа может осуществлять генерацию Дум Н+ с одновременным образованием НДЦН за счет НАДФН. В результате этой реакции в дыхательную цепь митохондрий поступают восстановительные эквиваленты от проникающих или образующихся в митохондриях НАДФ-зависимых субстратов. Эти процессы могут иметь большое значение для энергетики митохондрий в условиях ограниченной доступности субстратов, поставляющих восстановительные эквиваленты для первого и второго пунктов сопряжения. С другой стороны, осуществляемое трансгидрогеназой в условиях больших значений л Б Н+ поддержание высокой степени восстановленнос-ти НДЦФН имеет большое значение для протекающих в митохондриях реакций восстановительного биосинтеза. Учитывая, что восстанови- -ь- тельные эквиваленты с внутримитохондриального пула ЕАДФН в результате функционирования переносчиков передаются на внемитохондри-альный пул НДЦФН, трансгидрогеназа может играть значительную роль и во внемитохондриальных реакциях биосинтеза.
Из : вышеизложенного следует, что в настоящее время изучение механизма функционирования трансгидрогеназы является актуальным направлением исследований современной биохимии и биоэнергетики. Одним из подходов к изучению принципов работы трансгидрогеназы и ее роли в метаболизме . клетки в целом является исследование структуры фермента и поиск эффективных специфических ингибиторов. Имеющиеся в настоящее время данные о свойствах трансгидрогеназы в целом и о структуре ее активного центра являются далеко неполными и недостаточными для понимания механизма ее функционирования. С целью расширить представление о свойствах трансгидрогеназы мы исследовали роль различных функциональных групп в работе фермента. Нами были получены новые эффективные ингибиторы трансгидрогеназы и исследовано их взаимодействие с ферментом.
В нашей работе было показано наличие сульфгидрильной группы (групп),расположенной на внешней поверхности внутреней мембраны митохондрий; эта группа контролирует трансгидрогеназную реакцию и, по-видимому, принимает участие в трансмембранной транслокации ионов Н+, сопряженной с трансгидрогеназной реакцией. Кроме того, обнаружение такой поверхностно расположенной сульфгидрильной группы доказывает трансмембранное расположение фермента.
С помощью пиридоксаль-5 '-фосфата нами впервые также было показано, что в трансгидрогеназе имеется & -аминогруппа с рК~7.^, существенная для функционирования фермента. Тот факт, что субстраты (НДЦФ+ и КАДФН) трансгидрогеназы, но не ингибиторы, способные связываться в НДЦФ(Н)-связывающем центре, защищают фермент от ин-гибирования пиридоксальфосфатом, не позволяет с уверенностью ска- зать находится ли остаток лизина в активном центре или вне его. Однако,необычно низкое значение рК аминогруппы позволяет предположить, что эта группа может принимать участие в формировании протонного канала.
С целью изучения кинетических особенностей трансгидрогеназной реакции нами были синтезированы производные кофермента А и дефосфо-кофермента А, снабженные репортерными группами - хромофорными и флуорофорными. Эти производные,как и сами КоА и дфКоА являются специфическими конкурентными ингибиторами трансгидроге-назы. В качестве репортерных групп были использованы динитрофе-нильный остаток (ДНФ-остаток) и нитробензофуразан~4-ильный остаток (НБФ-оетаток). Специфичность взаимодействия арильных производных КоА и дфКоА определялась не только отсутствием или присутствием 3 -фосфатного остатка в молекуле КоА, но также структурой арильного остатка. Полученные с помощью этих ингибиторов данные позволяют уточнить кинетические особенности трансгидрогеназной реакции. Тот факт, что НШ-дфКоА является конкурентным ингибитором в отношении обоих субстратов одновременно свидетельствует о случайном порядке связывания субстратов в ходе трансгидрогеназной реакции. Кроме того,нам удалось с помощью этих ингибиторов оценить расстояние между субстрат-связывающими центрами в транегид-рогеназе. Из полученных результатов следует, что НШ-дфКоА способен связываться в обоих нуклеотидсвязывающих центрах фермента одновременно, что означает, что расстояние между ними в трансгидро- о геназе не превышает длины молекулы НБФ-дфКоА, т.е. ~ 30 А. Этот факт означает, что никотинамидные остатки НДД(Н) и НДЦФ(Н) могут находиться в непосредственной близости друг от друга при образовании тройного комплекса с ферментом. Такая ситуация хорошо согласуется с высказьгоаемым в литературе предположением /2,3 / о пря- мом переносе ІГ-иона и Н+-иона между никотинамидными кольцами субстратов в ходе трансгидрогеназной реакции.
Таким образом, полученные в работе результаты проливают свет на такие важные особенности строения трансгидрогеназы как расположение молекулы фермента в мембране, природа групп, участвующих в реакции, свойства нуклеотид-связьшающих центров. Разработанные в диссертации подходы по модификации трансгидрогеназы в митохондриях не проникающими через мембрану агентами с последующим получением вывернутых фрагментов мембраны (субмитохондриальнык частиц) могут быть использованы для изучения других мембранных ферментов. Синтезированные в работе новые производные кофермента А могут найти применение для изучения структуры и функции широкого класса НДЦ(Н)- и НДЩБ(Н)-зависимых ферментов.
Физико-химические свойства трансгидрогеназы
В настоящее время трансгидрогеназа выделена из большого числа объектов: из митохондрий млекопитающих /12-17/, из хроматофо-ров фотосинтезирующей бактерии Rhodospirillum rubrum /18-21/, из бактерии Azotobacter vine land ij/22-24/, бактерий рода Pseudo-monas /25-28/, из Escherichia coli /29-34/ и др.
В некоторых лабораториях получен гомогенный препарат трансгидрогеназы из митохондрий сердца быка /13,14,16,17/. Каплан /12/ показал, что молекулярная масса частично очищенной трансгидрогеназы из сердца быка составляет 250000-300000. По независимым данным Ридстрема и Фишера,очищенная трансгидрогеназа из митохондрий сердца быка состоит из одного типа субъединиц с молекулярным весом 97 000 /14/ или 120 000 /13/.
Большое различие в данных о величине молекулярной массы фермента, полученных Капланом /12/, а также Фишером /13/ и Ридстремом /14/ объясняется, по-видимому, недостаточной очисткой препарата трансгидрогеназы, полученного Капланом, а также возможной ассоциацией мономеров трансгидрогеназы вследствие отсутствия детергентов в среде выделения.
По данным SDS -электрофореза обработка гомогенного препарата трансгидрогеназы, встроенного в липосомы, бифункциональными сшивающими агентами димитилсуберимидатом, диметиладипимидатом, диметил-пимелимидатом и дитио-бис-(сукцинимидилпропионатом) приводит к образованию димеров /35/. Имеются также данные о том, что модификация трансгидрогеназы в липосомах дициклогексилкарбодиимидом (ДЦЦЦ) вызывает образование димеров, наблюдаемых при SDS-электрофорезе /36/. Эти данные указывают на то, что митохондриальная трансгидрогеназа, по-видимому, обладает димерной структурой.
По данным аминокислотного анализа /17/ митохондриальная трансгидрогеназа содержит меньше полярных остатков, чем типичный растворимый глобулярный белок.
В системе, состоящей из водной фазы и фазы, содержащей тритон X—114, большая часть белка трансгидрогеназы (76%) концентрировалась в гидрофобной фазе /17/. Эти данные хорошо согласуются с представлением о трансгидрогеназе, как об интегральном белке митохондриальной мембраны.
Физико-химические свойства трансгидрогеназы из других источников изучены в меньшей степени. В очищенном препарате из E.coli преимущественно обнаружены пептиды с молекулярной массой 94 000 и 50 000 /34/.
Трансгидрогеназа из хроматофоров R. rubrum состоит из двух факторов - мембранного и растворимого /18/, причем молекулярная масса растворимого фактора составляет 70 000 /18/.
Препарат трансгидрогеназы из Р# aeruginosa обладает молекулярной массой в несколько миллионов и состоит из агрегатов разме о , ром 500-5000 А /37/. 2 -АМФ или НДЩГ вызывают диссоциацию агрегатов на фрагменты с молекулярной массой 900 000, состоящих из 20 субъединиц с молекулярной массой 40 000-45 000 дальтон /37/.
Препарат трансгидрогеназы из A. vinelandii также диссоциирует в присутствии НДЦФ+ на субъединицы с молекулярной массой 58 000 /38/. 2. Стереохимия трансгидрогеназной реакции.
В 1965 г. Ли с соавт. /39/ показали, что в ходе трансгидрогеназной реакции в митохондриях сердца быка происходит стерео-специфический перенос гидрид-иона из 4А-положения НАДН в 4В-поло-жение НАДФН. Аналогичной стереоспецифичностью обладают трансгид -13 рогеназы из хроматофоров R. rubrum /40,41/ и мембран E.coli /42/. Перенос гидрид-иона между пиридиннуклеотидами, осуществляемый АВ-специфичными трансгидрогеназами протекает без обмена атомов водорода нуклеотидов с протонами среды и без включения трития из Н0 среды в фермент /39,43,44/.
Выделение митохондрий из сердца быка
Митохондрии из сердца быка выделяли по методу Крейна и др. /118/ с некоторыми изменениями. Сердце только что убитого животного быстро извлекали из туши, разрезали на несколько частей, помещали в лед и доставляли в лабораторию. Все последующе операции проводили при 2С.
Мышечную ткань освобождали от жира и соединительнотканных волокон, измельчали на куски по 2-3 г и гомогенизировали в трехкратном объеме раствора 0,25 М сахарозы, 10 мМ фосфата калия, рН 8,0 в течение 1,5 мин. В процессе гомогенизации рН гомогената поддерживали в пределах 7,0-7,5 добавлением подобранного количества 5 М КОН. После окончания гомогенизации рН гомогената доводили до 7,5 и гомогенат центрифугировали 15 мин при 2 000 g . Осадок отбрасывали, а профильтрованный через четыре слоя марли супернатант центрифугировали при 23 000 g15 мин. Осадок митохондрий промывали раствором 0,25 М сахарозы. Верхний, легко сползающий слой ("легкие" митохондрии), отделяли от нижнего.плотного слоя ("тяжелые" митохондрии). Полученные митохондрии суспендировали в небольшом объеме 0,25 М сахарозы и хранили при -20С.
2. Получение субмитохондриальных частиц.
Субмитохондриальные частицы выделяли по методу Лоу и Валли-на /119/ в модификации, предложенной Таланте и др. /100/. Все операции проводили при 2С. "Тяжелые" митохондрии гомогенизировали тефлоновым пестиком в стеклянном гомогенизаторе в четырех-пяти-кратном объеме буфера, содержащего 0,25 М сахарозу, 10 мМ ТРИС-HCI, рН 7,5, 1,5 мМ АТФ и 10 мМ MgS04 и осаждали в течение -61 мин при 10 000 g . Митохондрии суспендировали в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 10 мМ ТРИС-НСІ, рН 8,0, 1,5 м М ATE, 10 мМ MgSOA до концентрзции белка 20-30 мг/мл. Предварительно буфер освобождали от кислорода, пропуская через него аргон. Полученную суспензию (по 50 мл), через которую также пропускали аргон, подвергали обработке ультразвуком три раза по I мин на дезинтеграторе УЗДН-І (при частоте осцилляции 22 кГц, силе тока 0,4 А). Во время озвучивания суспензию митохондрий охлаждали в хлоркальцие-вой бане с температурой -18С. Температура суспензии митохондрий при обработке ультразвуком поднималась не выше 4-6С. В процессе озвучивания рН суспензии поддерживали в пределах 7,5-7,7, добавлением 5 М ЫаОН Обработанную таким образом суспензию центрифугировали 10 мин при 25 000 g . Осадок отбрасывали, а надосадоч-ную жидкость центрифугировали при 105 000 g 50 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок субмитохондриальных частиц суспендировали в буфере, содержащем 10 мМ ТРИС-НСІ, рН 7,5, 0,25 М сахарозу и повторно центрифугировали 60 мин при 105 000g . Полученные субмитохондриальные частицы суспендировали в том же буфере. Концентрация белка составляла 40-50 мг/мл. Частицы хранили при -20С.
Выяснение роли сульфгидрильных групп трансгидрогеназы, расположенных на внешней стороне внутреней мембраны митохондрий в активности фермента
Как отмечалось в литературном обзоре, митохондриальная транс-гидрогеназа обладает высокой чувствительностью к сульфгидрильныи реагентам /76,90,93,94/. Было показано, что в субмитохондриальных частицах 5,5-дитиобис-(нитробензойная кислота) (ДТНБ) инактиви-рует трансгидрогеназу, блокируя одну сульфгидрильную группу с рК 7,4 в области НДЦФ(Н)-связывающего центра /76/ и другую сульфгидрильную группу с рК 9,1, расположенную периферически по отношению к каталитическому центру /94/. Однако, ни одна из этих сульфгидрильных групп не является существенной ни для самой трансгидроге-назной реакции, ни для трансмембранной транслокации протонов, осуществляемой ферментом /94/.
Следует напомнить, что субмитохондриальные частицы представляют собой фрагменты митохондриальной мембраны, замкнутые в пузырьки. Мембрана в субмитохондриальных частицах ориентирована та-ким образом, что наружной у них является та поверхность, которая в митохондриях обращена во внутрь, в матрикс. Таким образом, при изучении влияния ДТНБ на активность трансгидрогеназы в субмитохондриальных частицах были выявлены лишь те остатки цистеина, которые доступны со стороны матрикса. В условиях денатурации трансгидрогеназы додецилсульфатом натрия выявляются еще два остатка цистеина, титруемых ДТНБ, и еще три пары остатков уистеина, образующих дисульфидные мостики /90/. Роль сульфгидрильных групп, недоступных для ДТНБ со стороны матрикса в механизме функционирова -70 ния трансгидрогеназы неизвестна.
Робиллард и Конингс /126/ высказали гипотезу о важной роли дитиол-дисульфидного перехода для мембрано-зависимых процессов транспорта, гормон-рецепторного взаимодействия и преобразования энергии. Авторы предполагают, что обратимый дитиол-дисульфидный переход является механизмом, осуществляющим регуляцию лїіН -зависимых изменений константы Михаэлиса субстратов. В случае трансгидрогеназы предполагается, что фермент имеет сульфгидрильные группы, расположенные как на внутренней, так и на внешней поверхности митохондриальной мембраны. Б зависимости от редокс-состоя-ния наружных и внутренних сульфгидрильных групп сродство субстат-евязывающих центров к субстратам либо увеличивается, что приводит к образованию прочного тройного фермент-субстратного комплекса, либо уменьшается, что приводит к освобождению продуктов из активного центра. В свете этой гипотезы было важно выяснить значение недоступных со стороны матрикса для ДТНБ сульфгидрильных групп. Мы попытались установить, имеются ли на внешней поверхности митохондриальной мембраны сульфгидрильные группы, существенные для трансгидрогеназной активности. Поэтому модификацию трансгидрогеназы сульфгидрильным реагентом Пг-хлормеркурибензоатом (ПХМБ) проводили не в субмитохондриальных частицах, а в митохондриях, что позволяет выявить именно те сульфгидрильные группы, которые расположены на внешней поверхности мембраны митохондрий. Выбор п-хлормеркурибензоата в качестве модифицирующего агента объясняется его специфичностью в отношении сульфгидрильных групп /127/ и низкой проницаемостью митохондриальной мембраны для этого агента при нейтральных значениях рН и 0С /128/. Кроме того ШМБ удобен тем, что вызванную им модификацию можно обратить. Для обращения модификации мы использовали цистеин, который не прони -71 кает через митохондриальную мембрану. Ввиду того, что необходимо было модифицировать только те сульфгидрильные группы, которые расположены на внешней стороне мембраны митохондрий, в опытах использовались митохондрии с хорошим дыхательным контролем, что является показателем их замкнутости
