Введение к работе
Актуальность темы. Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высококонсервативного участка, который впервые был обнаружен в а-кристаллинах хрусталика глаза и получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. In vivo sHsp вовлечены в большое количество разнообразных процессов, таких как усиление устойчивости к стрессам, регуляция динамики актиновых и промежуточных филаментов, ингибирование апоптоза, изменение текучести мембран и др.
В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них подробно изучены только аА- и аВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl).
Сравнительно недавно появились первые сведения о малом белке теплового шока человека с кажущейся молекулярной массой 22 кДа (Hsp22, также обозначаемом как HspB8 или НИ киназа). Точечные мутации К141Е или K141N в Hsp22 коррелируют с развитием тяжелых нейропатий. Мутация Hsp22 по данному остатку гомологична мутации Hsp27 по 140 остатку, и в случае Hsp27 также приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний. В структуре Hsp27 есть еще несколько аминокислотных остатков, подверженных мутациям, и в их числе - остаток 136, гомологичный остатку 137 в Hsp22. Мутация этого остатка также сопровождается развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний. Высказывается предположение о том, что в структуре малых белков теплового шока есть своеобразные «горячие точки», мутации которых приводят к развитию врожденных заболеваний. Структура и свойства Hsp22 изучены недостаточно полно и поэтому до последнего времени не было сведений о том, как влияют мутации вблизи так называемых «горячих точек» на структуру и свойства Hsp22. Тем не менее, имеющиеся в литературе сведения позволяют предположить, что Hsp22 отличается по своей структуре от других малых белков теплового шока; было даже высказано предположение о том, что Hsp22 принадлежит к быстро растущему семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (т.н. «intrinsically disordered proteins», IDP). Все эти предположения требовали подтверждений. Вследствие этого, одной из главных целей данной работы стало подробное исследование физико-химических свойств Hsp22 (в частности, проверка предположения о его принадлежности к семейству IDP). Другой не менее важной целью настоящей работы было исследование свойств Hsp22 с точечными заменами остатков лизина 137 и 141 (К137Е, К141Е и К137/141Е), расположенных в
области, наиболее подверженной мутациям в других малых белках теплового шока.
Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы было подробное исследование физико-химических свойств Hsp22, а также влияния точечных замен К137Е, КЫШ и К137/141Е на структуру и свойства Hsp22. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
Различными методами исследовать особенности вторичной, третичной и четвертичной структуры Hsp22, включая подробное изучение процесса его тепловой денатурации.
Изучить влияние точечных замен К137Е, К141ЕиК137/141Ена структурные свойства и шапероноподобную активность Hsp22.
Основные положения, выносимые на защиту.
Получены доказательства того, что Hsp22 относится к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (ШР). Тепловая денатурация Hsp22 протекает в виде непрерывного теплового перехода (т.н. "downhill unfolding").
В отличие от других малых белков теплового шока человека, исследованных к настоящему времени, Hsp22 не образует крупных олигомеров даже в условиях, близких к условиям теплового шока.
Точечные замены К137Е, К141Е и К137/141Е оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22, что заметно отражается на его шапероноподобной активности.
Научная новизна. Впервые проведен детальный анализ структуры и свойств малого белка теплового шока Hsp22 человека. Получены убедительные доказательства наших предположений о том, что Hsp22, в отличие от всех исследованных к настоящему времени малых белков теплового шока, относится к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (ШР). В работе был применен практически весь набор методов, позволяющих изучать изменения во вторичной и третичной структуре белка в процессе его тепловой денатурации. Оказалось, что разные методы, использованные для исследования тепловой денатурации Hsp22, дают разные результаты: они либо вообще не выявляют выраженных тепловых переходов, либо выявляют их, но при этом температура полуперехода может существенно варьировать в зависимости от используемого метода. Именно такой тип поведения был ранее предсказан при математическом моделировании процесса тепловой денатурации белков, демонстрирующих непрерывный переход ("downhill unfolding"), и наши данные являются одним из первых экспериментальных подтверждений этого предсказания. При исследованиях олигомерного состояния Hsp22 установлено, что он, в отличие от других малых белков теплового шока человека, не образует крупных олигомеров даже в условиях, близких к условиям теплового шока. Показано, что точечные замены К137Е, К141Е и К137/141Е оказывают
дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22 и снижают его шапероноподобную активность; именно этим, по-видимому, можно объяснить тот факт, что подобные мутации в малых белках теплового шока ассоциированы с развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний.
Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств малых белков теплового шока, а также представляют несомненную важность для исследования тех функций, которые Hsp22 осуществляет в клетке. Разработанные в процессе работы экспериментальные подходы -такие, например, как параллельное исследование температурных зависимостей различных параметров, измеряемых разными методами, могут использоваться (и уже успешно используются) для структурно-функциональных исследований других белков
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XIII и XVI Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (г. Москва, 2006) и «Ломоносов 2009» (г. Москва, 2009), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Казань, 2009) и на 7-м Европейском Конгрессе Биофизического общества EBSA2009 (Италия, г. Генуя, 2009, симпозиальный доклад).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 4 тезисов).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов (5 глав), их обсуждения (2 главы), выводов и списка цитируемой литературы (183 источника). Диссертация изложена на 145 страницах, содержит 57 рисунков и 7 таблиц.
Список использованных сокращений приведен на странице 25 автореферата.
