Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Современные подходы к идентификации нейроспецифических антигенов 9
Идентификация нейроспецифических белков по их специфичности для нервной ткани
Направленный поиск белков, обеспечивающих уникальную структуру и организацию нервной ткани . 22
Поиск нейроспецифических изоформ известных ферментов 32
Поиск нейроспецифических белков с использованием генно-инженерных методов 37
III. Материалы и методы 40
ІV.РЕЗУЛЬТАТН ИССЛЕДОВАНИЯ 56
I. Выделение нейроспецифического антигена 10-40-4 56
2. Получение моноспецифических антисывороток к нейроспецифическому антигену 10-40-4; метод иммуноферментного определения антигена 10-40-4 70
3. Специфичность антигена 10-40-4 для ткани мозга 73
4. Видовая специфичность антигена 10-40-4 74
5. Сравнительная характеристика физико-химических свойств антигена 10-40-4 из мозга
человека и крысы 76
б. Клеточная и региональная локализация антигена 10-40-4 в мозге человека 81
V. ОБСУВДНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 87
ВЫВОДЫ 100
VІ .УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 101
на русском языке 101
на английском языке 107
- Современные подходы к идентификации нейроспецифических антигенов
- Направленный поиск белков, обеспечивающих уникальную структуру и организацию нервной ткани
- Выделение нейроспецифического антигена
Введение к работе
Актуальность исследования. В настоящее время изучение нейроспецифических белков представляет значительный интерес, так как позволяет приблизиться к пониманию фундаментальных механизмов функционирования мозга. Становится все более очевидным, что нейроспецифические белки принимают участие в таких специфических процессах, протекающих в нервной ткани, как генерация и проведение нервного импульса, установление контактов между клетками, регуляция проницаемости ионных каналов, а также обучение и память. Однако, четко определить роль нейроспецифических белков в этих процессах пока невозможно.
В настоящее время идентифицировано около 60 нейроспецифических белков, однако, информация о многих из них исчерпывается лишь сообщением об их выявлении. Далеко не для всех нейроспецифических белков достаточно подробно изучены их физико-химические свойства, клеточная и субклеточная локализация, а также их специфичность для тех или иных областей мозга, что также может иметь значение для понимания их роли в функционировании нервной системы.
Существуют также многочисленные данные о роли нейроспецифических белков при различных патологических состояниях. Так, появление некоторых из них с спинномозговой жидкости при ряде нервных и психических заболеваний рассматривается как индекс повреждения нервной ткани. Рядом авторов в сыворотке крови больных психическими заболеваниями обнаружены антитела и сенсибилизированные лимфоциты к мозговым, в том числе и нейро-спепифическим белкам.
Ранее в нашей лаборатории из экстракта водорастворимых белков мозга человека была выделена фракция, условно обозначенная фракция 10, обогащенная нейроспецифическими белками. К белкам этой фракции в сыворотке крови больных шизофренией с большой частотой (до 70 %) выявлялись антитела.
Сказанное выше определяет актуальность работы, посвященной выделению из фракции 10 нейроспецифического антигена, получившего название 10-40-4 по номерам хроматографических фракций, а также изучению его физико-химических характеристик, клеточной и региональной локализации в нервной ткани.
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования ' " " —М —! 1.1— !< является выделение и изучение свойств нейроспецифического антигена из фракции, к которой с большой частотой выявляются антитела в сыворотке крови больных шизофренией. Получение индивидуального препарата нейроспецифического белка, моноспеци- фической сыворотки к нему, а также разработка высокочувствительного иммуноферментного метода его определения позволят в дальнейшем подойти к изучению его функциональной роли, а также оценить его участие в индукции патологических иммунных реакций при психических заболеваниях. В задачи исследования входит:
Разработка схемы выделения нейроспецифического антигена 10-40-4, выявленного иммунохимическими методами.
Получение моноспецифической антисыворотки к нейро-специфическому белку 10-40-4.
Изучение физико-химических свойств выделенного белка, а также изучение эволюционной стабильности его антигенной де- терминанты.
4, Разработка метода количественного определения нейро- специфического антигена 10-40-4.
5. Изучение клеточной и региональной локализации выделен ного антигена.
Научная новизна. Выделен новый нейроспецифический антиген из ткани мозга человека и крысы. К этим антигенам получены моноспецифические антисыворотки. По своим физико-химическим свойствам, а также по специфичности антигенных детерминант для отдельных видов млекопитающих, выделенный антиген отличается от других описанных в литературе нейроспецифических белков.
Разработан высокочувствительный метод иммуноферментного определения выделенного антигена в белковых экстрактах, с использованием которого проведено измерение его количества в различных органах человека, а также в отдельных структурных образованиях мозга.
Практическая ценность. Выделен и охарактеризован новый нейроспецифический антиген из фракции 10, к которой в сыворотке крови больных шизофренией с высокой частотой (до 70 %) выявляются антитела. Получена также моноспецифическая антисыворотка к нему и разработан иммуноферментный метод определения выделенного антигена с чувствительностью 1-2 нг/мл, который в данной работе был использован для подтверждения нейроспецифи-чности выделенного антигена и для изучения его региональной локализации в мозге. В дальнейшем метод предполагается использовать для измерения содержания антигена в биологических жидкостях больных нервно-психическими заболеваниями.
8 Описанный нейроспецифический белок и полученные к нему моноспецифические антисыворотки используются при осуществлении совместных исследований, проводимых ШЦПЗ АМН СССР и Белградским центром иммунологических исследований (СИ)), а также используется в исследованиях, входящих в Государственную программу, направленных на изучение роли нейроспецифи-ческих белков в процессах, протекающих в мозге в нормальных и патологических условиях.
Автор выражает глубокую благодарность коллективу лаборатории нейрохимии и химии физиологически активных веществ за содействие в осуществлении этой работы.
9 П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ современные подхода К ВДЕНТИШШЩ
НЕ0РОСПЕЦЙШИЧЕСКЙХ АНТИГЕНОВ.
Настоящий литературный обзор посвящен анализу возможных подходов к идентификации нейроспецифических антигенов, среди которых можно выделить следующие направления:
Современные подходы к идентификации нейроспецифических антигенов
Настоящий литературный обзор посвящен анализу возможных подходов к идентификации нейроспецифических антигенов, среди которых можно выделить следующие направления:
1. Ццентификация нейроспецифических белков по их специ
фичности для нервной ткани:
а) при сравнении белкового спектра мозга и других органов;
б) с использованием иммунохимических методов, позволяю
щих определить нейроспецифическуго детерминанту.
2. Направленный поиск белков, обеспечивающих уникальную структуру и организацию нервной ткани.
3. Поиск нейроспецифических изоформ известных ферментов.
4. Поиск нейроспецифических белков с использованием генно-инженерных методов.
При описании нейроспецифических белков, идентифицированных тем или иным способом, мы подробно остановимся на тех из них, которые представляют интерес в плане их сравнения с ней-роспецифическим антигеном, выделенным нами.
а) Выявление нейроспецифических белков при сравнении белкового спектра мозга и других органов.
Впервые Иооге и Нс&ге ог в 1965 году при сравнении белковых карт, полученных при хроматографическом и электрофоре 10 тическом фракционировании экстрактов водорастворимых белков мозга и печени, идентифицировали два специфических для мозга белка, которые позднее получили названия /S -100 и антиген 14-3-2 (160). Этими авторами был разработан метод выделения белка /о -100, который включал фракционирование экстракта мозга сульфатом аммония и ряд последовательных этапов ионообменной хроматографии и гельфильтрации. Таким образом им удалось получить сравнительно чистый препарат белка /о -100, что позволило изучить некоторые его физико-химические свойства и получить антисыворотку к нему. В дальнейшем метод ІІооге и Пс Grregor был в значительной степени модифицирован (2,29,130,48,201), были также предложены принципиально новые схемы его выделения, например, с использованием жидкостной хроматографии на Hitachi-Gre?30B (123).
В настоящее время iS -100 является одним из наиболее изученных нейроспецифических белков, хотя функция его до сих пор остается неизвестной. Однако, существуют многочисленные факты, свидетельствующие об участии белка S -100 в механизмах синап-тической передачи (НО), регуляции транскрипционной активности генома нейронов (157,41), модуляции СА -зависимого фосфорилиро-вания отдельных мозговых белков (168,14), направленного роста отростков нейронов (III), интегративных процессах, протекающих на уровне одного нейрона (I).
3 -100 является кислым, СА -связываюшим белком, широко распространенным в нервной системе позвоночных (151,8,36,37, 45). 5 -100 включает в себя два компонента: $ -І00А и S -Ю0В, субъединичный состав которых сАЬ и Ь& соответственно (121,
II
122,145). р -субъединица имеет молекулярную массу 10,5 кД, определена ее аминокислотная последовательность, которая оказалась аналогичной с аминокислотной последовательностью других СА++-связывающих протеинов (кальмодулин, тропонин С) (121). сК -субъединица имеет примерно такую же молекулярную массу, но несколько отличается от р -субъединицы по аминокислотному составу.
Направленный поиск белков, обеспечивающих уникальную структуру и организацию нервной ткани
Этот подход имеет в своей основе исследование белков, входящих в состав определенных клеточных структур, присутствующих только в нервной системе. В этом направлении достигнуты значительные успехи в изучении миелина, нейрофиламентных белков, белка глиальных филаментов, белков синаптических структур.
а) Миелин.
Миелин по своему происхождению представляет собой определенный тип клеточных мембран, однако по своему составу он существенно отличается от плазматических мембран клеток. Для выделения миелина из ткани мозга используют методы центрифугирования в градиентах плотности (153,206).
Химическая природа миелина периферических нервных волокон и миелина центральной нервной системы различна. Это, возможно, связано с тем, что в центральной нервной системе (ЩС) миелин образуется клетками олигодендроглии, а в периферической нервной системе (ПНС) - шванновскими клетками (44). На электрофореграм-ме миелина ЦНС можно обнаружить следующие белковые фракции (76):
1) протеолипид (22-24 кД)
2) основной миелиновый белок (18,5 кД)
3) белок Зульфграма (50-55 кД).
Их соотношение в миелине составляет примерно 50 %, 30 %, 20 % соответственно.
В состав миелина ЩС входят также в небольших количествах и другие белки, такие как промежуточный белок ДМ 20 (156) и миелин-ассоциированный белок И(\Сг (190).
В состав миелина периферической нервной системы входит протеин, обозначенный Pj, который по своему составу очень близок, но не идентичен основному миелиновому белку (165). В количественном отношении в миелине периферической нервной системы доминирующим является гликопротеин, обозначенный PQ. ОН составляет примерно 30-50 % от количества общего миелинового белка. Кроме того, в состав миелина ПНС входит протеин Pg (12 000 дальтон) (119).
В настоящее время все компоненты миелина интенсивно изучаются. Однако, наибольшее внимание уделяется основному миелиновому белку и протеину периферической нервной системы , Интерес к этим белкам объясняется тем, что основной миелиновый белок является энцефалитогенным фактором, вовлеченным в ряд неврологических заболеваний, включая рассеянный склероз (44, 98,206), а протеин Pg является невритогенным фактором, вызывающим аутоиммунные заболевания периферической нервной системы (119).
Антитела к основному миелиновому белку обладают широким спектром стимулирующего протеолиз действия как при кислых, так и при нейтральных значениях рН, что является ключевым моментом аллергической демиелинизации (38). Основной миелиновый белок может вызывать также другие биологические эффекты, такие как деполяризация различных нейрональных мембран (100,120), проли 24 ферации фибробластов (206).
У большинства млекопитающих основной миелиновый белок представлен мономером с молекулярной массой 18,500 кД (25). Рядом авторов была продемонстрирована микрогетерогенность основного миелинового белка (25,153,206,98). Было показано, что такая гетерогенность является результатом посттрансляционной модификации (метилирование, дезаминирование, фосфорилирование) (98). Основной миелиновый белок грызунов имеет дополнительно малый основной протеин, полипептидная цепь которого короче на 40 аминокислотных остатков, молекулярная масса его 15 кД (98,156). Изо-электрическая точка основного миелинового белка pi 9,5 (25).
Основной миелиновый белок играет важную роль в поддержании структуры миелина: входящие в его состав основные аминокислоты определяют взаимодействие с отрицательно заряженными группами липидов миелина (104,189).
Выделение нейроспецифического антигена
Антиген 10-40-4 был идентифицирован нами по свойству его специфичности для нервной ткани с помощью антиеыворотки к экстракту мозга человека, абсорбированной экстрактами печени, почки, сердца, скелетной мышцы, легкого, кожи, а также сывороткой крови человека (абсорбированная антисыворотка).
В настоящей работе разработана схема выделения нейроспецифического белка (НСБ) 10-40-4 из ткани мозга, в основе которой лежит метод иммуноаффинной хроматографии на сефарозе 4В, связанной с icj Gr кроличьих антисывороток к фракции мозга, содержащей данный нейроспецифический антиген.
Выделение антигена 10-40-4 из экстракта мозга проводится в два этапа: иммуноаффинная хроматография и последующая очистка белка до гомогенного состояния путем элюции соответствующей белковой зоны из полиакриламидного геля (С). На рис.2 приведена схема выделения нейроспецифического антигена 10-40-4, которая включает, кроме иммуноаффинной хроматографии, два подготовительных этапа для приготовления иммуносорбента: А - Получение фракции мозга, содержащей данный нейроспецифический антиген, путем ионообменной хроматографии и фракционирования сульфатом аммония и В - Получение кроличьих антисывороток к этой фракции мозга, их абсорбция экстрактами органов и сывороткой крови с целью истощения антител к детерминантам, общим для мозга и других органов и иммобилизация этих антисывороток на сефарозе 4В.
