Введение к работе
- з -
Актуальность проблемы. Одной из актуальных мёдико-биоло-гических проблей является изучение структурно-Функциональных свойств антимикробных белков и полипептидов гранулярного <ли-зосомного) аппарата нейтрофилов, которые представляют молекулярную основу реализации ряда защитных реакций организма при Фагоцитозе, воспалении и стрессе. История и-.учения клеточ-но-молекулярных механизмов естественной резистентности ор- 1-низма человека и животных к инфекции (Зильбер, 1958; Адо, 1961; Ашмарин с соавт., 1972; ПигарєЕский , 1978: Войно--Ясенецкий. 1981; Маянс.чий, А., Маянский Д.. 1983; Klebanoi'f. Clark. 1978; Spltznagel, 1984; Spltznagel, Shafer, 1985) свидетельствует о том. что уже на первых этапах развития этого направления исследований был поставлен вопрос о природе и свойствах антимикробных веществ лейкоцитов, в том числе и ло-. кализованных в нейтрофилах (Hankln, 1891: Buchner, 1894: Schattenfroh, 1897).. В значительной степени проведение этих работ было стимулировано фагоцитарной теорией иммунитета, выдвинутой в 1883 году И. И. Мечниковым (1892). в исследованиях школы которого была обоснована ключевая роль микрофагов (в современной терминологии - нейтрофилов) и макрофагов в ?орми-ровани невосприимчивости к инфекционным болезням бактериальной и грибковой этиологии. Им же была сформулирована концепция о цитазах - бактерицидных соединениях лейкоцитарного происхождения, обеспечивающих инакт'.'.зацию и переваривание фагоцитированных микроорганизмов (Мечников. 1903). Необходимо, однако, отметить, что все указанные работы носили преимущественно феноменологический характер до тех пор, пока A. Petterson в ;905 году не выделил из лейкоцитов гноя челооека антимикробные субстанции, которые по заключению автора представляли смесь щелочных протеинов,родственных по ряду свойств протаминам рыб.
Продолжение этих исследований имело место только через 50 лет и было по времени и идеологически сопряжено с открытием и доказательством функциональной роли лизосом в клетках (De Duve et al. 1955). в том числе и лейкоцитах гранулоцитарного ряда (Roblneaux, Frederic, 1955; Conn, Hirsch. 1960). Антимикробные свойства фагоцитов пытались связать с активностью кислых гид-ролаз лизосом этих клеток. Однако уже в первых работах отсго направления было продемонстрировано, что бактерицидная активность препаратов "лейкин" (Scarnes. Watson, 1956) и "фагоци-
.-4-THH"(Hirsch. 1956), полученных из нейтрофилов кролика, обусловлена присутствием в них белковых, компонентов, являющихся по своим электрохимическим свойствам поликатионами и, по-видимому, не относящихся к ферментам. Строгое доказательство эти наблюдения получили в исследованиях другой группы американских ученых (Zeya, Spltznagel, 1963, 1966). которые из смеси кислото-растворимых белков гранул (лизосом) нейтрофилов кролика и морской свинки выделили, очистили и охарактеризовали по физико-химическим свойствам группу катионных белков и полипептидов с молекулярной массой менее 10 кДа. В модельной системе in vitro ими были продемонстрированы микробоцидные свойства этих белков, отсутствующие у паралельно изученных кислых гидролаз (кислая фосфатаза, РНК-аза, ДНК-аза.р-глюкуронидаза ) лейкоцитов (Zeya et al. 1966). Следует отметить, что этим биохимическим исследованиям предшествовали морфологические, в которых с использованием красителя прочного зеленого, селективно выявляющего основные по природе биополимеры, была установлена транслокация лизосомных катионных белков на поверхность фагоцитированных микроорганизмов (бактерии, грибы),сопровождающаяся потерей жизнеспособности последними (Spltznagel, Chi, 1963). В своей совокупности эти наблюдения дали основание авторам рассматривать низкомолекулярные лизосомные катионные белки (полипептиды) нейтрофилов, которые позднее были названы дефенсинами (Ganz et al.. 1985), в качестве специализированной группы веществ, проявляющих в отношении фагоцитированных микробов цито-токсическую активность. В нашей стране работы в этом направлении исследований были инициированы профессорами И. П. Ашмариным (Ашмарин и др., 1972, 1977) на кафедре биохимии Ленинградского Государственного университета и В. Е. Пигаревским (Пигаревский, 1969, 1975) в НИИ экспериментальной медицины АМН СССР, коллективы которых плодотворно сотрудничали в рамках рассматриваемой проблемы более 20 лет.
Существенный вклад в изучение антимикробных факторов нейтрофилов сделал з этот период S.Klebanoff (1967, 1968, 1970), который первым продемонстрировал бактерицидную активность гранулоцитарного фермента - миелопероксидазы в составе системы, включающей в себя кроме энзима, перекись водорода и один из кофакторов (J", СГ.Вг". SCK"). Начальные сведения о локализации в нейтрофилах лактоферрина (Masson et al.. 1970),наряду с уже известными данными о присутствии в них другого антимикробного белка - лизоцима (Conn, Hirsch.1960). до-
полняли общую картину преоставлений о природе основных компонентов "микробоцидной- системы, гранул (лизосом) нейтрофилов. которая сложилась в период, предшествующий начале настоящей-работы в 1974 году.
Вместе с тем ряд вопросов рассматриваемой проблемы оставались открытыми. Отсутствовали углубленные сведения о структурных и функциональных свойствах большинства представителей того или иного гомологического ряда антимикробных белков (миелопе-роксидаза. лактоферрин. эластаза, катепсин G, дефенсины). Практически неизвестны были закономерности функционального взаимодействия рассматриваем: бслко? при фагоцитозе и воспалении, определяющие защитную направленность згах пронесете Совсем не исследованы были особенности развития этого звена защиты организма от инфекций в ранний постнаталышй период его онтогенеза. Изучение этих вопросов имеет весьма важное значение не только для понимания природы механизмов, лежащих в основе формирования неспецифической антимикробной резистентности организма человека и животных, но и открывает новые перспективы в регуляции защитных процессов, обусловленных функционированием нейтрофилов и их отдельных физиологически активных ве ществ.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении физико-химических и. функциональных свойств основных антимикробных " белков (миелопероксидаза. лактоферрин, дефенсины) нейтрофилов и обосновании их важной роли в формировании неспецифической резистентности организма человека и животных. Исходя из этого, были выдвинуты следующие конкретные задачи:
1. Разработать новые и модифицировать известные методы получения высокоочищеннкх препаратов миелопероксидаз, лактоферри-нов. дефенсинов и структурно-родственных им полипептидов из нейтрофилов человека, свиньи, коровы, кролика, крысы и ку-- 'рицы.
2. Провести поиск и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных полипептидов из лейкоцитов свиньи и курицы, структурно родственных дефенсинам. 3.Исследовать физико-химические свойства миелопероксидаз человека, свиньи, коровы, кролике и крысы (спектр поглощения, молекулярную массу, наличие субъединиц, пептидные карты. аминокислотный состав, кинетические параметры). Провести сравнение изученных характеристик между ферментами из раз-
- є -
ных источников для определения их общих и индивидуальных свойств. 4.Осуществить физико-химический и функциональный анализ лак-тоферринов человека, свиньи, коровы и кролика (гомогенность, молекулярная масса, пептидные карты, аминокислотный состав) из разных клеточно-тканевых источников организма с целью обоснования представления о структурной идентичности лактоферринов нейтрофилов и молока. 5.В модельной системе in vitro изучить антистафилококковые свойства миелопероксидазной системы и лактоферрина с целью оценки вклада рассматриваемых белков в микробоцидную активность нейтрофилов. 6. Изучить спектр антимикробных белков нейтрофилов в раннем
постнатальчом развитии человека, кролика и крысы. 7.Осуществить комплексное морфобиохимическое изучение механизмов феномена резорбтивной клеточной резистентности. 8. Осуществить изучение функциональных свойств дефенсинов и родственных им полипептидов (антимикробная активность In . vitro , влияние на резистентность к вирусной инфекции in vivo, некоторые механизмы гемостаза и глюкокэртикоидную реакции при стрессе). Научная новизна. Открыта новая группа антибиотичесісих полипептидов лейкоцитов свиньи, сочетающая в своей структуре черты дефенсина кролика с кортикостатическими свойствами (ІІРЗа) и антимикробного полипептида из гемоцитов подковообразного краба -тахиплезина. Из лейкоцитов свиньи выделен и секве-нирован белок богатый пролином и фенилаланином (профенин). который избирательно кнактивирует грамотрицательную бактерию E.coll в условиях In vitro. Представлена структура универсального антимикробного белка лейкоцитов свиньи, обогащенного проліном и аргинином (РКЗЭх), гомолог которого ранее был выделен из слизистой тонкого кишечника этогр же вида животных.
Впервые осуществлено определение первичной структуры трех антимикробных полипептидов дефенсиновой природы (галлинацинов) из гетерофилов птиц.
Впервые в мировой литературе представлены сведения о некоторых физико-химических свойствах миелопероксидаз коровы и кролика. Осуществлено систематическое сравнительно-биохимическое изучение структурных и кинетических параметров миелопероксидаз человека, свиньи, коровы, кролика и крысы, на основании которого можно говорить об их заметном сходстве в анализируе-
- 7 - *
мок ряду гомологических белков.
Впервые выделенылактоферрины из нейтрофилов свиньи и ко
ровы, проведено сравнительное изучение-ряда "их" физіїко-химичес
ких свойств. Продемонстрирована структурная тождественкость лактоферринов из молокз и нейтрофилов свиньи.
Впервые продемонстрированы в модельных системах In vitro синергические антимикробные эффекты кислородзависимой миелопе-роксидазной системы, с одной стороны, и лактоферрина и де-фенсинов - с другой, которые отражают некоторые возможные механизмы взаимодействия анализируемых белков при инактивации микроорганизмов е процессе фагоцитоза.
Епэрвые в комплексных , мсрфобиохимическах исследованиях выявлены возрастные дефицита лизосомных антимикробных белков (миолопероксидаза, катепсин G, эластаза) нейтрофилов человека, кролика и крысы, которые следует рассматривать в качестве одного из факторов риска развития инфекционных заболеваний в ранний постнатальный период онтогенеза животных.
Расшифрованы некоторые биохимические стороны феномена резорбтивной клеточной резистентности как одного из механизмов защиты организма от инфекции, є основе которого лежит поглощение катионных белков нейтрофилов макрофагами.
Впервые изучен ряд функциональных активностей дефенслнов, который позволяет оценивать их не только как эффективные антибиотические вещества, " ко и соединения, обладающие кортикоста-тическими, иммунопротективными и гемостатическими свойствами.
Впервые продемонстрирована диагностическая значимость изучения кислоторастворимых белков молока при маститах человека и крупного рогатого скота.
Теоретическое значение работы определяется тем, что на основе данных, полученных в настоящем исследовании, сформулировано положение об антимикробных белках нейтрофилов с катион-ным характером заряда их молекул (миелопероксидаза, лактофер -рин; бактерицидный проницаемость-увеличивающий протеин, эластаза, катепсин G. лизоцим, дефенсины и структурно-родс-твеннье им полипептиды) как физиологически активных веществах, участвующих в реализации и обеспечивающих взаимодействие защитных реакций разного рода: фагоцитарных, воспалительных, стрессиндуцированных и иммунологических.
Практическое значение работы.
Комплекс методов препаративной белковой химии, разработанный в ходе работы, может быть использован в лабораторных
.-8-
условиях с целью получения высокоочищенных препаратов антимикробных белков нейтрофилов.
Впервые получено строгое биохимическое доказательство объективности данных, получаемых при исследовании микробоцид-ного потенциала нейтрофилов с использованием морфологического метода -лизосомально-катионного теста.
Предложены новые экспресс-методы диагностики мастита человека и крупного рогатого скота, защищенные авторскими свидетельствами.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Открыта новая группа антимикробных полмпептидов из нейтрофилов свиньи - протегрины, которые сочетают в своей структуре признаки кортикостатических дефенсинов кролика и полипептида из гемоцитов подковообразного краба - тахиплезина.
-
Из нейтрофилов свиньи выделен и секвенирован белок богатый пролином и фенилаланином (профенин), избирательно действующий In vitro на грамотрицательную бактерию Е. coll.
-
Антибиотические полипептиды гетерофилов кур (галлинацины) по своей первичной структуре относятся к группе -дефенсинов.
-
Лактоферрины нейтрофилов и молока одного вида млекопитающих (человек, свинья, корова) идентичны по ряду своих физико-химических свойств (электрофоретическая подвижность.' спектральные характеристики, способность связывать железо, аминокислотный состав, пептидные карты). Установлена заметная структурная гомология лактоферринов человека, свиньи и коровы, триптические гидролизаты которых имеют 37 общих пептидов.
-
Сравнительно-биохимическое изучение некоторых кинетических и структурных параметров миелопероксидаз человека, свиньи, коровы, кролика и крысы свидетельствует об единообразии ряда свойств (молекулярная масса, субъединичная организация молекул, спектральные характеристики) в анализируемом ряду гомологичных белков.
-
.В нейтрофилах новорожденных людей и животных (кролик, крыса) установлен дефицит основных антимикробных белков (миелопе-роксидаза. катепсин G, эластаза), который может быть одной из причин их функциональной неполноценности в ранний постнаталь-ный период онтогенеза.
-7. В модельных системах In vitro продемонстрировано синерги-ческое антимикробное действие миелопероксидазной системы, лактоферрина и дефенсинов', которое отражает некоторые механизмы взаимодействия анализируемых белков при инактивации микро-
- 9 -организмов в процессе фагоцитоза и воспаления. 8: ~Наличие- у - лефенсйнов— свойств ___универсальных, антимикробных
молекул, наряду с их способностью повышать"резистентность жи
вотных к вирусной инфекции, нормализовывать свертываемость крови, оказывать кортикостатическое и иммунопротективное .действие дает основание предполагать участие этих полипептидов в сочетанной регуляции ряда защитных реакций организма.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и представлялись на 2 и з Всесоюзных симпозиумах по медицинской энзимологии, Москва, 1975, Астрахані. 1979; на 1. 2 и з Всесо-азнкх симпозиумах "Структура и функции лизосом", Москва. 1976. Новосибирск. 1980. Тбилиси, 1986; на Всесоюзном симпозиуме "Окислительные ферменты животной клетки". Горький, 1978; на 4 Всесоюзном биохимическом съезде, 'Ленинград, 1979; на 3 Всесоюзной конференции по патологии'клетки, 1982; на 7 Всесоюзном съезде патологоанатомов, Ташкент, 1983; на 9 и 10 международных симпозиумах по листериозу. Нант (Франция), 1996.. Печ (Венгрия), 1988; на 7 Всесоюзном симпозиуме по физиологии и биохимии лактации, Алма-Ата. 1986; на 4 Всесоюзном съезде патофизиологов, Кишинев; 1989; на 1 и 2 Международном конгрессе ISNIM (Италия). Флоренция. 1990. Паэстум, 1993; на конференции посвященной 100-летию НИИЭМ. Ленинград, 1990; на 1 Международном конгрессе патофизиологов. Москва. 1991; на 1 съезде иммунологов России, 1992;" на 1 Балтийской конференции по психосоматике и психотерапии. Киль (Германия). 1992; на 7 симпозиуме американского общества исследователей белков, Сан-Диего.1993, на 1 Международном конгрессе по стрессу, Бетесда (США), 1994. Публикации.По теме диссертации опубликовано 85 печатных работ
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на іе^страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,/С глав собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. В диссертации /6 таблиц и ч рисунков.
