Содержание к диссертации
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1 Бактерицидные факторы белковой и пептидной природы молока и молозива 12
2.1.1 Иммунные факторы молока и молозива 14
2.1.2 Факторы неспецифической противомикробной резистентности молока и молозива 2.1.2.1 Лактоферрин 19
2.1.2.2 Лактопероксидаза 20
2.1.2.3 Клеточные и гуморальные факторы, обусловливающие антисептические свойства
молока и молозива 23
2.2 Роль амидных групп в структурно-функциональных свойствах белков 28
2.2.1 Механизмы отщепления амидных групп аспарагина и глутаминав молекулах белков 31
2.2.2 Роль процессов дезамидирования в изменении конформационной организации белковых молекул 37
2.2.3 Дезамидирование и аспарагинзависимая автофрагментация белковых молекул 41
2.2.4 Физиологическое значение процессов неферментативного дезамидирования и автофрагментации .44
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 52
3.1 Материалы исследования и постановка эксперимента 52
3.2 Методы исследования 3.2.1 Определение содержания белка в препаратах лакгоглобулина 53
3.2.2 Изучение специфической и неспецифической биологической активности препаратов лакгоглобулина
3.2.2.1 Определение активности лактопероксидазы в препаратах лактоглобулина 54
3.2.2.2 Определение антиоксидантной активности препарата лактоглобулина , 55
3.2.2.3 Определение титров специфических антител в препарате лактоглобулина 55
3.2.3 Исследование интенсивности дезамидирования и деструкции препаратов лактоглобулина 57
3.2.3.1 Определение содержания фракций амидных групп в белках препаратов лактоглобулина 57
3.2.3.2 Определение уровня молекул средней массы в препаратах лактоглобулина 58
3.2.3.3 Исследование собственной флуоресценции белков препарата лактоглобулина 59
3.2.3.4 Электрофорез препаратов лактоглобулина 60
3.2.4 Статистическая обработка результатов 61
4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 63
4.1 Изучение специфической и неспецифической биологической активности препаратов лактоглобулина в процессе хранения 63
4.1.1 Исследование лактопероксидазной активности препаратов лактоглобулина при хранении 63
4Л .2 Изучение антиоксидантных свойств лрепаратов лактоглобулина при хранении 65
4,1.3 Исследование содержания титров специфических антител против сальмонелл в препаратах лактоглобулина при хранении 68
4.2 Изучение характера протекания процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина при его хранении 72
4.2.1 Исследование неферментативного дезамидирования белков препарата лактоглобулина при его хранении 72
4.2.2 Исследование процессов деструкции и изменения электрофоретической гетерогенности белков препарата лактоглобулина при его хранении .76
4.2.3 Исследование собственной флуоресценции препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения 82
4.3 Исследование специфической и неспецифической
активности препаратов лактоглобулина на различных
этапах их хранения в присутствии углеводов и полиолов 87
4.3.1 Исследование активности лактопероксидазы в препарате лактоглобулина на различных этапах его хранения присутствии 10% глюкозы, фруктозы и сорбитола 87
4.3.2 Исследование антиоксидантной активности препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения в присутствии 10% глюкозы, фруктозы и сорбитола 91
4.3.3 Исследование специфической активности препаратов лактоглобулина на различных этапах их хранения в присутствии 10% глюкозы, фруктозы и сорбитола. 96
4.4 Изучение характера протекания процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина при его хранении в присутствии углеводов 101
4.4.1 Динамика дезамидирования, конформационных перестроек и деструкции белков препарата лактоглобулина при хранении в присутствии 10% глюкозы 101
4.4.2 Динамика дезамидирования, конформационных перестроек и деструкции белков препарата лактоглобулина
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из основных причин возникновения острых кишечных заболеваний у детей раннего возраста служат условнопатогенные микроорганизмы, что обусловлено физиологической незрелостью и относительно низкой степенью развития систем неспецифической иммунной защиты организма (Тур А.Ф., 1967). В исследованиях последних лет показана возможность использования препаратов лактоглобулинов и лактосывороток из молока и молозива коров для защиты от инфекции и формирования нормального микробиоценоза в кишечнике новорожденных (Соболева СВ. и соавт., 1991). Препараты лактоглобулинов представляют собой комплексные белковые системы, содержащие как факторы иммуноспецифической защиты (IgA, IgG, IgM), так и факторы неспецифической противомикробной резистентности, центральное место среди которых занимает лактопероксидазная система (ЛІТО). Однако многие из перечисленных белковых компонентов, обусловливающих протекторные свойства лактоглобулина, весьма уязвимы к действию внешних факторов и легко теряют свою активность в ходе получения препарата (Пушкина Н.В. и соавт., 1986). Получение нелиофилизированной формы препарата лактоглобулина представляет непосредственный интерес в плане сохранения в нем активности систем неспецифической противомикробной резистентности. Применение технологии мембранной фильтрации позволяет избежать использования спирта для фракционирования белков при получении лактоглобулина, а, следовательно, и лиофилизации, являющейся мощным повреждающим фактором для белков лактосыворотки. Исследование биохимических свойств, специфической и неспецифической активности, а также стабильности нелиофилизированных препаратов лактоглобулина, полученных таким способом, необходимо для оптимизации технологического процесса их получения, что и определило направление наших исследований. Одной из основных причин нестабильности и снижения биологической активности белковых препаратов в ходе их получения и последующего хранения являются спонтанные ковалентные постгрансляционные модификации (ПТМ), принимающие непосредственной участие в процессах старения белковых молекул. Центральное место среди таких ПТМ занимает реакция неферментативного посттрансляционного дезамидирования остатков аспарагина (Асн) и глутамина (Глн) (Wright Н.Т., 1991; Reissner К. J., 2003). Предполагают, что встроенные в полипептидную цепь остатки Асн и Глн действуют как «молекулярные часы», определяющие продолжительность функционирования белковой молекулы (Robinson А.В., 2001). Процессы неферментативного дезамидирования и связанная с ним аспарагинзавнсимая автофрагментация задействованы в процессах старения и деградации белковых молекул (Олехнович Л.П. и соавт., 1985; Blotgrett J.K., 1985; Voorter С.Е.М., 1988; Wright Н.Т., 1991). Изменение степени амидированности влечет за собой определенные локальные нарушения структурных и физико-химических характеристик белков, и является причиной возникновения новых модифицированных белков с «дефектными» биологическими функциями (Robinson N.E., 2002). Следствием этих изменений является снижение специфической и неспецифической биологической активности белковых молекул.
Мы полагали, что спонтанное дезамидирование в водных растворах препарата лактоглобулина, полученного с помощью мембранных технологий, может быть важнейшей причиной их «старения» при хранении. Это, а также попытки модифицировать скорость этих процессов определили цель и задачи исследования
Цель работы: Целью настоящей работы явилось установление роли неферментативного дезамидирования в изменениях некоторых биохимических и физико-химических свойств белков препарата лактоглобулина, полученного методом мембранных технологий, в зависимости от условий хранения. Задачи исследования.
1. Изучение лактопероксидазной активности, антиоксидантных свойств, а также титров антител, специфических против Salmonella В и Salmonella D, препаратов лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±ГС и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).
2. Изучение динамики протекания процессов неферментативного дезамидирования белков препарата лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±1°С и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).
3. Изучение интенсивности деструкции белков препарата лактоглобулина в процессе его хранения при различных значениях температуры (4°±1°С и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).
4. Изучение структурно-конформационных преобразований в белках препарата лактоглобулина методом регистрации их собственной флуоресценции в процессе его хранения при различных значениях температуры (40±1°С и 35°±1°С) и рН (7,0 и 5,5).
5. Исследование влияния глюкозы, фруктозы и сорбитола на ЛПО активность, антиоксидантные свойства, титры антител, специфические против Salmonella В и Salmonella D, а также показатели неферментативного дезамидирования, деструкции и структурно-конформационных преобразований белков препарата лактоглобулина в ходе его хранения при 4°±1°С и 35°±1°С.
Научная новизна результатов. В работе впервые установлено состояние систем специфической и неспецифической противомикробной защиты в нелиофилизированных препаратах лактоглобулина направленного действия против сальмонелл, полученных с применением мембранных технологий. Выявлено влияние температуры и рН инкубационной среды на активность ЛПО, антиоксидантные свойства и уровень титров антител специфических против Salmonella В и Salmonella D в препаратах лактоглобулина при их хранении. Впервые установлены тесные корреляционные связи и роль процессов неферментативного дезамидирования, деструкции и структурно-конформационных изменений в инактивации препаратов лактоглобулина при их хранении. Показано снижение интенсивности дезамидирования и деструкции белков препарата лактоглобулина при инкубации в слабокислой среде по сравнению с нейтральной. Установлено влияние глюкозы, фруктозы и сорбитола, на скорость процессов дезамидирования и деструкции, а также изменения биологической активности белков препарата лактоглобулина в ходе их «модельного» старения при хранении. Впервые установлено ускорение дезамидирования трудногидролизуемых амидных групп (ТАГ) перечисленными углеводами. Основные положения выносимые на защиту:
1. В ходе хранения при 4°±1°С и 35°±1°С в препарате лактоглобулина происходит снижение его биологической активности вследствие дезамидирования, фрагментации и конформационных изменений молекул белков, входящих в его состав.
2. Скорость дезамидирования, деструкции и снижения специфической и неспецифической биологической активности в ходе инкубации при 4°±1°С и 35°±1°С в течение 28 суток ниже для препаратов, инкубировавшихся при рН 5,5 по сравнению с нейтральной средой.
3. Скорость дезамидирования белков препарата лактоглобулина тесно коррелирует с интенсивностью деструкции полипептидных цепей.
4. Инкубация препарата лактоглобулина при слабокислых рН позволяет увеличить продолжительность функционирования в нем ЛІТО, а также факторов, обусловливающих его антиоксидантное действие.
5. Введение в среду инкубации глюкозы, фруктозы и сорбитола оказывает неодинаковое влияние на скорость дезамидирования легкогидролизуемых амидных групп (ЛАГ) и ТАГ, а также на активность ЛПО, антиоксидантные свойства и уровень специфической активности изучаемого препарата. Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты имеют существенное значение для понимания молекулярной природы процессов происходящих при старении белков. Важным в теоретическом плане является установление взаимосвязи между интенсивностью дезамидирования и функционированием систем специфической и неспецифической противомикробной резистентности препаратов лактоглобулина. Это может свидетельствовать о роли неферментативного дезамидирования в качестве одного из механизмов регуляции протекторных свойств белков лактосыворотки.
Практическую ценность представляют данные о снижении интенсивности дезамидирования и деструкции белков препарата лактоглобулина при инкубации в слабокислой среде (5,5) по сравнению с нейтральной (7,0). Особое значение имеют данные о более продолжительном функционировании ЛІТО, а также систем, отвечающих за антиокислительные свойства препарата лактоглобулина в условиях его хранении при слабокислых значениях рН.
Учитывая универсальность процессов дезамидирования, такие величины рН могут быть рекомендованы для хранения растворов других белковых препаратов, применяющихся в медицинской практике.
Представляются существенными с практической точки зрения данные о влиянии глюкозы, фруктозы и сорбитола на биологические свойства и показатели нативности белков препарата лактоглобулина, что может оказаться полезным при выборе пищевых добавок и консервантов в практике производства иммунобиологических препаратов на основе молока и молозива с целью сохранения в них тех или иных видов биологической активности, а также обеспечения вкусовых качеств данных препаратов, предназначенных в основном для перорального применения пациентами раннего детского возраста.
Результаты, полученные при выполнении работы, используются при получении экспериментально-производственных серий нелиофилизированного препарата лактоглобулина в Ростовском НИИ Микробиологии и Паразитологии, а также при чтении лекций по специальному курсу «Биохимия белка» в Ростовском государственном университете. В настоящее время получена приоритетная справка по использованному в данной работе способу получения иммунного лактоглобулина.
