Введение к работе
Актуальность проблемы. Конечный этап запасания энергии при окислительном распаде питательных веществ в клетках млекопитающих происходит в митохондриях, где уровень NAD+, необходимый для поддержания окислительного метаболизма, обеспечивается NADH: убихинон оксидоредуктазой (дыхательным комплексом I). Митохондриальный комплекс I или его гомологи прокариот (NDH-1) катализируют окисление митохондриального или цитоплазматического NADH убихиноном, сопровождающееся векторным переносом протонов через сопрягающую мембрану. Комплекс I митохондрий сердца крупного рогатого скота построен из 45 различных субъединиц и содержит, по меньшей мере, 9 индивидуальных редокс-кофакторов. Бактериальные опероны, кодирующие NDH-1, содержат только 13-14 генов, и продукты их транскрипции гомологичны 14 «главным» субъединицам митохондриального комплекса I. Поскольку каталитические свойства митохондриального фермента и его прокариотических гомологов почти одинаковы, можно считать, что только 14 из 45 субъединиц фермента млекопитающих необходимы для катализа. Функции остальных, более чем 30 дополнительных субъединиц остаются неизвестными. Подавляющее большинство сведений о каталитических и регуляторных свойствах комплекса I млекопитающих получено при изучении очищенного фермента или различных препаратов митохондрий сердца крупного рогатого скота. В последние годы в литературе широко обсуждаются корреляции между возникновением и развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний (болезни Паркинсона, Альцгеймера, ретинопатии) и дефектами функционирования комплекса I. В обсуждениях используются данные о свойствах фермента или ферментных
Список сокращений: Дцм+ - трансмембранный электрохимический градиент протонов, Ду - разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны, FCCP - л-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон, FMN -флавинмононуклеотид, HAR - гексааминорутений (III) хлорид, Qi - водорастворимый гомолог природного убихинона, содержащий 1 изопреноидный остаток в положении 5 1,4-бензохинонового кольца, БСА - бычий сывороточный альбумин, ДТТ — 1,4-дитиотреитол, ДТНБ - 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота), СМЧ - субмитохондриальные частицы, М-СМЧ — субмитохондриальные частицы мозга, Мт-СМЧ — субмитохондриальные частицы мозга, полученные из «тяжелых» митохондрий, Мо-СМЧ — субмитохондриальные частицы мозга, полученные из суммарной фракции митохондрий, С-СМЧ - субмитохондриальные частицы сердца, СОД - супероксид-дисмутаза.
препаратов (митохондрии, субмитохондриальные фрагменты) сердечной мышцы. Неизвестно, существует ли тканевая или видовая специфичность комплекса I млекопитающих, отражающаяся в его каталитических или регуляторных свойствах. В нашей лаборатории показано существование двух медленно взаимопревращающихся форм комплекса I: активной (А) и деактивированной (D). Активация комплекса I требует затравочного медленного каталитического цикла. Активная форма деактивируется (A—»D переход) в условиях, когда каталитические обороты фермента невозможны (нет субстрата -NADH или нет акцептора - окисленного убихинона) и этот переход имеет такой высокий активационный барьер, что его наблюдение в минутной шкале возможно только при температуре >30С. Такое поведение фермента, по-видимому, обеспечивает регулирование суммарной скорости окислительного фосфорилирования в митохондриях. Показано, что переход от нормоксии к аноксии интактного изолированного сердца сопровождается синхронным переходом комплекса I из его активного состояния в деактивированное. Таким образом, явление, обнаруженное и проанализированное на простых объектах, удалось проследить в ряду: изолированный фермент - фермент в составе мембраны - фермент в интактных митохондриях - фермент в функционирующем органе. Если переход комплекса I из активного состояния в деактивированное имеет отношение к регулированию его каталитической активности, то разумно предположить, что в матриксе митохондрий присутствуют вещества-регуляторы, влияющие на скорости перехода и положение равновесия между активной и деактивированной формами фермента. Свободные жирные кислоты претендуют на роль одного из таких регуляторов. В нашей лаборатории, недавно было показано, что пальмитиновая кислота снижает скорость активации деактивированной формы фермента сердца, в концентрациях, существенно более низких, чем те, которые необходимы для ингибирования его активности.
Цель работы. Получить препараты митохондрий мозга, пригодные для изучения каталитических и регуляторных свойств митохондриальной ЫАОН:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) мозга и сравнить их со свойствами аналогичных препаратов сердца.
Для достижения этой цели требовалось решить следующие задачи: 1. Наладить метод, пригодный для получения митохондрий мозга в препаративных количествах; 2. Получить и охарактеризовать препарат «вывернутых» сопряженных субмитохондриальных частиц мозга (М-СМЧ); 3. Охарактеризовать основные свойства комплекса I мозга по сравнению с известными для фермента сердца; 4. Оценить влияние свободных жирных кислот и двухвалентных катионов на каталитические характеристики комплекса I мозга.
Научная новизна и практическое значение работы. Разработана процедура получения сопряженных инвертированных («inside-out») субмитохондриальных частиц мозга и охарактеризованы свойства комплекса I в составе такого препарата. Показано, что свойства комплекса I митохондрий мозга, в частности, параметры активации-деактивации, практически не отличаются от таковых препарата сердечной мышцы. Показано, что совместное действие Са2+ и свободных жирных кислот приводит к развивающемуся во времени ингибированию каталитической активности комплекса I в составе М-СМЧ, в условиях (высокие значения рН), которые могут, по-видимому, реализоваться в функционирующих митохондриях. Полученный препарат инвертированных субмитохондриальных частиц мозга может служить в качестве экспериментальной модели, пригодной для изучения дефектов комплекса I, связанных с различными патологическими состояниями (ишемическое повреждение, нейродегенеративные заболевания).
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, 16-ой Европейской Конференции по Биоэнергетике (The 16th European Bioenergetics Conference, Warsaw, 2010), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи и 3 тезисов научных докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах,
содежит 23 рисунка и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы,
описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их
обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.
