Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Основные компоненты клеточной стенки растений и их свойства
1.1. Целлюлоза 9
1.2. Гемицеллюлозы и пектины 11
1.3. Лигнин 13
ГЛАВА 2. Целлюлозосоджержащие материалы (ЦСМ) 15
2.1. Общая характеристика состава ЦСМ 15
2.2. ЦСМ как перспективный источник сырья и энергии I7
2.3. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов 19
ГЛАВА 3. Биокаталитическая деградация ЦСМ 21
3.1. Современная классификация целлюлаз 21
3.2. Основные ферменты целлюлолитического комплекса 22
3.3. Механизм биокаталитической деградации целлюлозы 25
3.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы 28
ГЛАВА 4. Современные подходы к получению н0вых штаммов продуцентов целлюлаз 31
4.1. Общая характеристика подходов к оптимизации состава ферментных комплексов... 31
4.2. Система экспрессии в грибах рода Pnicillium 34
П. Эксперементалбная часть 39
ГЛАВА 5. Объекты исследования и методы экспериментов 39
5.1. Ферментные препараты 39
5.2. Субстраты 39
5.3. Прочие реактивы 39
5.4. Хроматографические сорбенты 40
5.5. Получение нротопластов и проведение транеформации штамма-реципиента гриба Р. verruculosum 4Q
5.6. Культивирование трансформантов 42
5.7. Метод определения компонентного состава ферментных препаратов 42
5.8. Определение концентрации белка 43
5.9. Определение биохимических характеристик ферментов
5.10. Методы определения активности ферментов 43
5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков 45
5.12. Определение температурного и рН-оптимума действия ферментных препаратов 46
5.13. Изучение термостабильности ферментных препаратов 46
5.14. Гидролиз ЦСМ 46
III. Результаты и их обсуждение 48
ГЛАВА 6. Получение ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов P. verruculosum 48
6.1. Трансформация штамма -реципиента P. verruculosum 537 49
6.2. Результаты первичного скрининга трансформантов «тандем» 50
6.3. Результаты первичного скрининга трансформантов «дуплет» 52
6.4. Результаты первичного скрининга трансформантов «триплет» 55
6.5. Получение сухих ферментных препаратов 58
ГЛАВА 7. Физико-химические свойства новых ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum 59
7.1. Анализ ферментных препаратов методом ДДС-электрофореза в денатурирующих условиях 59
7.2. Анализ активностей ферментных препаратов по отношению к различным субстратам 59
7.3. рН- и температурные оптимумы активности и стабильности ферментных препаратов 63
ГЛАВА 8. Определение компонентного состава новых рекомбинантных ферментных препаратов 69
ГЛАВА 9. Верификация уровня экспресии ферментов новых рекомбинантных штаммов p.verruculosum осахаривающей способностью различных видов ЦСМ 75
9.1. Результаты гидролиза измельченной микрокристаллической целлюлозы 76
9.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 78
9.3. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины 82
9.4. Результаты гидролиза измельченной багассы 85
Выводы 89
Список литературы 90
- Гемицеллюлозы и пектины
- ЦСМ как перспективный источник сырья и энергии
- Механизм биокаталитической деградации целлюлозы
- Получение нротопластов и проведение транеформации штамма-реципиента гриба Р. verruculosum 4Q
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В современном мире четко прослеживается тенденция к приоритетному развитию альтернативной энергетики, основанной на возобновляемых источниках энергии, и сокращению доли углеводородного сырья в глобальном энергетическом балансе. Кроме этого, существуют серьезные экологические проблемы, связанные с увеличением объема выброса парниковых газов в атмосферу.
Биотехнологическая переработка сельскохозяйственных и лесотехнических отходов, а именно лигноцеллюлозной биомассы, являющейся возобновляемым и наиболее распространенным на нашей планете растительным материалом, позволяет значительно снизить нагрузку на экосистему Земли.
Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо - этанол, бутанол, а также другие полезные продукты - органические и аминокислоты, кормовые продукты, адгезивные материалы, биосинтезируемые лекарственные препараты, биоразлагаемые пластики и другие полезные продукты. Таким образом, в будущем растительная биомасса будет играть роль возобновляемого источника сырья, в том числе для получения биотоплива.
Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и синергетического взаимодействия индивидуальных ферментов в нем.
В настоящее время на мировом рынке представлен широкий спектр ферментных препаратов, полученных на основе культуральной жидкости, секретируемой низшими грибами рода Trichoderma. Эти препараты традиционно применяются для гидролиза растительного сырья, однако они обладают рядом существенным недостатком, заключающимся в относительно низкой эффективности гидролиза - в первую очередь из-за недостатка составе ферментных комплексов Trichoderma Р-глюкозидазы (целлобиазы), что приводит к накоплению в реакционной смеси в качестве одного из продуктов целлобиозы, которая ингибирует ключевые ферменты, участвующие в осахаривании целлобиогидролазы.
Поэтому в настоящее время в области ферментативного гидролиза возобновляемого растительного сырья весьма активно развиваются фундаментальные и прикладные исследования, направленные на поиск и получение новых штаммов-суперпродуцентов целлюлаз, гемицеллюлаз и сопутствующих ферментов, обладающих высокой гидролитической способностью и имеющих «управляемый» состав ферментов, так, чтобы комплекс продуцируемых ферментов был наилучшим образом адаптирован к осахариванию тех или иных видов целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ).
Грибы рода Penicillium, в отличие от Trichoderma, продуцируют комплексы целлюлитических ферментов более сбалансированного состава, которые эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие материалы.
Ранее нами были разработаны подходы к получению эффективных ферментных препаратов, основным из которых является создание штаммов-продуцентов, содержащих индивидуальные целевые гены целлюлаз. Стратегия создания таких штаммов-продуцентов заключалась в последовательной трансформации штамма-реципиента одной плазмидой, несущей целевой ген, совместно с ко-трансформацией плазмидой pSTAlO, позволяющей отбирать трансформанты при культивировании на селективной среде. Основываясь на данных по встройке отдельных целевых генов и распределению целевых активностей в конечных ферментных препаратах, нами была разработана новая стратегия получения штаммов-продуцентов с заданными свойствами, заключающаяся в одновременной трансформации штамма-реципиента несколькими плазмидами с целевыми генами, а также трансформация экспрессионной кассетой, представляющей собой линейный участк ДНК с несколькими целевыми генами.
Таким образом, создание новых рекомбинантных штаммов на основе штамма гриба P.verruculosum, продуцирующих мультиферментные комплексы карбогидраз, обладающих улучшенной осахаривающей способностью по отношению к природному растительному сырью, является важной и актуальной задачей, поскольку применение данных мультиферментных комплексов будет способствовать увеличению эффективности процессов переработки целлюлозосодержащих материалов.
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось получение новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum и ферментных препаратов на их основе, обладающих увеличенной осахаривающей способностью.
В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
получить экспрессионные плазмиды, содержащие гены целлюлаз: эндо-1,4-0-глюканазы II (egl2) P.verruculosum, целлобиогидролазы II (cbhll) Trichoderma reesei и P.verruculosum и Р-глюкозидазы (bgl) Aspergillus niger под контролем сильного индуцибельного промотора целлобиогидролазы I (cbhl);
провести трансформацию штамма-реципиента P.verruculosum 537 (niaD'J и осуществить скрининг трансформантов на целевые активности;
исследовать каталитические, физико-химические и биохимические свойства новых ферментных комплексов, продуцируемых полученными новыми рекомбинантными штаммами;
определить компонентный состав ферментных комплексов;
проанализировать осахаривающую способность наиболее перспективных ферментных комплексов по отношению к различным видам ЦСМ (измельченной багассе, измельченной обессмоленной сосновой древесине, измельченной осиновой древесине и микрокристаллической целлюлозе) и сравнить ее с осахаривающей способностью коммерческих и лабораторных ферментных препаратов.
Научная новизна. Впервые с помощью метода одновременной трансформации грибного штамма-реципиента P.verruculosum 537 несколькими плазмидами, несущими индивидуальные гены гомологичных и гетерологичных целлюлаз, созданы новые штаммы P.verruculosum - продуценты высокоактивных целлюполитических ферментных комплексов. На базе наилучших штаммов-продуцентов целевых ферментов впервые получены новые мультиферментные комплексы карбогидраз с увеличенной осахаривающей способностью, определен их компонентный состав и описаны физико-химические свойства. Найдены корреляции между составом растительного сырья, составом полученных комплексов и эффективностью процесса осахаривания природных субстратов.
Практическая значимость работы. Показано, что новая стратегия создания штаммов-продуцентов позволяет получать ферментные комплексы заданного состава. Ферментные препараты, полученные на основе новых рекомбинантных штаммов P.verruculosum, значительно эффективнее (на 19-50%) гидролизуют различные виды предобработанных хвойной и лиственной древесины, а также багассы, чем коммерческие ферментные препараты, получаемые с использованием штаммов гриба Trichoderma sp., и препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях: московской международной научно-практической конференции "БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов" (Москва, 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены полученные результаты и их обсуждение; выводов и списка литературы, содержащего 151 ссылку на публикации в отечественных и зарубежных журналах. Объем диссертации составляет 106 страниц и включает 42 рисунка и 16 таблиц.
Гемицеллюлозы и пектины
Гемицеллюлозы составляют около 20% клеточной стенки растений. В зависимости от источника (и способов выделения), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру. Макромолекулы гемицеллюлоз разветвлены и построены из пентоз (ксилозы, арабинозы) или гексоз (маннозы, галактозы, фруктозы); степень полимеризации 50-300; молекулярная масса значительно меньше, чем у целлюлозы.
Трехмерная структура гемицеллюлозы образована за счет присоединения к гемицеллюлозе ксиланов, арабинанов, ксилоглюканов, арабиноксиланов галактоманнанов, глюкоманнанов и т.д.
Различают следуюшие группы гемицеллюлоз:
1. Группа, условно называемая ксиланами, с преобладанием ксилозных остатков: собственно ксиланы, глюкуроноксиланы и глюкуроноарабаноксиланы. Эти полисахариды присутствуют во всех лигнифицированных растительных тканях и в особенно больших количествах — в соломе злаков (25—35%). Один из наиболее хорошо изученных ксиланов из овсяной соломы имеет основную цепь из ксилопиранозных остатков, соединенных (3-1,4-связями. К этой цепи в качестве ответвлений присоединены при помоши 1,3-связей остатки арабофуранозы и при помощи а-1,2-связей — остатки глюкуроновой кислоты и ее 4-метилпроизводного.
2. Глюкоманнаны и галактоглюкоманнаны, преобладающими структурными компонентами которых являются маннозные остатки, содержатся в наибольших количествах в древесине хвойных пород, дающей при гидролизе 8 - 12% маннозы. Остатки глюкозы и маннозы в этих полисахаридах связаны, по-видимому, главным образом (3-1,4-связями.
3. Арабаногалактаны и глкжуроноарабаногалактаны, в которых преобладают остатки галактозы, содержатся в древесине некоторых растений (Lanae occidentalis) в значительных количествах (до 18%).
В древесине хвойных пород преобладают полисахариды, состоящие из гексоз (гексозаны, чаще глюко- и галактоглюкоманнаны), в лиственных - из пентоз (пентозаны, преимущественно ксилан). Гемицеллюлозы лиственной древесины близки по составу гемицеллюлозам других растительных материалов. Присоединение лигнина осуществляется для большинства растений посредством образования диферуловых (дикумаровых) мостиков между ксиланом и лигнином. У некоторых растений (например, бука) присоединение также возможно за счет образования сложноэфирной связи между глюкуроновой кислотой ксилана и ароматическим спиртом лигнина. Присоединение пектина к гемицеллюлозе осуществляется через арабинаны и арабиногалактаны. СП гемицеллюлоз существенно меньше, чем у целлюлозы, и варьирует от 50 до 200 [14].
Большинство гемицеллюлоз отличается от целлюлозы лучшей растворимостью в растворах щелочей и способностью легко гидролизоваться кипящими разбавленными минеральными кислотами. В растениях гемицеллюлозы служат опорным конструкционным материалом и, возможно, резервным питательным веществом. Содержание гемицеллюлоз в древесине и других растительных материалах - соломе, шелухе семян, кукурузных кочерыжках и т.п. составляет 13-43%. Извлекают гемицеллюлозы обычно щелочными растворами непосредственно из растительных материалов или экстракцией диметилсульфоксидом из холоцеллюлозы (углеводного комплекса, остающегося после выделения из древесины лигнина). В последнем случае получается продукт, близкий по составу природному [12,14].
Такая структура и свойства гемицеллюлоз обуславливают основную функциональную роль гемицеллюлозы: осуществление взаимосвязи между основными компонентами клеточной стенки за счет формирования переходного слоя между ними. В первичной клеточной стенке они объединяют пектины и целлюлозу, во вторичной -целлюлозу и лигнин.
Пектины входят в состав многих растительных тканей. Под термином пектины подразумевают группу полисахаридов, общим признаком которых является наличие неразветвленных блоков полигалактуроновой кислоты или ее метилового эфира.
Изучение пектинов из разных растительных источников показало, что молекулы пектина имеют основную цепь, состоящую из остатков а-1,4-галактуроновой кислоты с вставками 1,2-связанных остатков Ь-рамнопиранозы (рис. 3) [15]. Доля остатков рамнозы обычно составляет 1-4%. Боковые цепи пектина преимущественно представлены остатками В-галактозы, Ь-арабинозы, В-ксилозы. Редко встречаются остатки В-глюкозы, В-маннозы, Ь-фукозы, В-глюкуроновой кислоты.
В пектинах из некоторых источников (сахарная свекла, яблоки) обнаружена феруловая кислота, которая присоединяется к пятому кислородному атому концевого остатка арабинозы или ко второму кислородному атому концевого остатка галактозы. Ее основная роль - сшивание молекул пектина [16].
Природные пектины, как правило, высокометилированы (по карбоксильной группе В-галактуроновой кислоты), и лишь немногие из них, например, пектин из свеклы, ацетилированы (по гидроксильным группам В-галактуроновой кислоты) [14]. methoxygr&ер
Лигнин - третий важнейший компонент растительной биомассы. Он принадлежит к числу наиболее распространенных на земной поверхности веществ, уступая в этом отношении только целлюлозе. Лигнин в отличие от углеводов не является индивидуальным веществом, а представляет собой смесь ароматических полимеров родственного строения. Он входит в состав одревесневших клеток всех наземных растений и, по мнению большинства исследователей, химически связан с углеводами. Молекулярная масса лигнина изменяется от нескольких сотен до миллиона [17].
ЦСМ как перспективный источник сырья и энергии
Для эндоглюканаз прежде всего характерна высокая активность по отношению к растворимым производным целлюлозы и (3-глюканам, содержащим Р-1,4-связи, а именно по отношению к карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), глюкану из ячменя и лихенану, причем в первую очередь это выражается в быстром уменьшении вязкости растворимых полисахаридов (а также в образовании восстанавливающих Сахаров ВС) [64 65 661.
Как правило, эндоглюканазы способны достаточно эффективно гидролизовать аморфную целлюлозу. Однако, их активность по отношению к кристаллической целлюлозе - например, к хлопку, фильтровальной бумаге "Whatman №1", микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) - относительно низка по сравнению с целлобиогидролазами [65, 66].
Грибные эндоглюканазы, как правило, не активны по отношению к целлобиозе, а также далеко не все из них способны расщеплять целлотриозу. Многие эндоглюканазы способны гидролизовать целлоолигосахариды со степенью полимеризации более 3, причем скорость гидролиза, как правило, возрастает с увеличением СП олигосахарида [67, 68]. При действии на целлоолигосахариды эндоглюканазы предпочтительно гидролизуют внутренние связи, удаленные от концов молекул олигосахаридов, при этом для различных ферментов распределение гидролизуемых связей различается [68-70].
После введения в практику исследований хромогенных субстратов целлюлаз -метилумбеллиферильных (МУФ), га-нитрофенильных (иНФ) и других производных моно-и олигосахаридов - в ряде работ изучали действие эндоглюканаз на эти субстраты. Как правило, только ферменты, принадлежащие к 7-й семье (например, ЕGI из T.reesei), способны расщеплять ковалентную связь между МУФ и гликозидным остатком в молекуле МУФ-(3-В-целлобиозида; в случае более длинных олигосахаридов многие эндоглюканазы способны к этому [68, 70, 71].
Основными низкомолекулярными продуктами гидролиза карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), МКЦ и предобработанной фосфорной кислотой целлюлозы (аморфной целлюлозы) под действием эндоглюканаз является глюкоза и целлобиоза, а также реже целлотриоза, целлотетраоза и целлопентаоза [72].
Большинство грибных эндоглюканаз, принадлежащих к различным семьям, являются сохраняющими аномерную конфигурацию гликона ферментами; для них также характерны реакции трансгликозжирования, т.е. реакции переноса гликозидного остатка, в результате которых происходит удлинение цепи олигосахарида [68, 73].
Наиболее удобно детектировать продукты трансгликозилирования, когда в качестве субстрата (или акцептора гликозидного остатка) используются хромогенные производные углеводов, в частности их МУФ и «-НФ-производные [66, 70].
Некоторые эндоглюканазы подвержены ингибированию продуктом реакции -целлобиозой, однако такое ингибирование слабее, чем у целлобиогидролаз [73].
Целлобиогидролазы отщепляют остатки целлобиозы от концов полимерных молекул нативной или частично гидролизованной целлюлозы, а также целлоолигосахаридов [64, 65].
Целлобиогидролазы способны отщеплять целлобиозу как с восстанавливающего (с сохранением конфигурации), так и с невосстанавливающего конца молекул субстрата (с обращением конфигурации аномерного атома углерода) [74-78]. Целлобиогидролазы могут гидролизовать как аморфную, так и кристаллическую целлюлозу, причем именно относительно высокая активность по отношению к кристаллической целлюлозе является их отличительным свойством по сравнению с эндоглюканазами [77, 65]. Поэтому принято считать, что при действии целлюлазного комплекса на авицел измеряемая активность отражает в первую очередь активность целлобиогидролаз. При исследовании кинетики действия целлобиогидролаз на олигосахариды установлено, что, как и в случае эндоглюканаз, скорость реакции возрастает с увеличением СП субстрата [78].
Как правило, практически единственным продуктом при действии целлобиогидролаз на целлюлозу является целлобиоза [77, 79]. Иногда наряду с целлобиозой в небольших количествах образуется глюкоза, а также другие целлоолигосахариды (например, целлотетраоза и целлогексаоза) [66]. продукт гидролиза (целлобиоза) является весьма сильным конкурентным ингибитором многих известных целлобиогидролаз. Константы ингибирования обычно лежат в диапазоне 0,02-2,5 мМ (в случае, когда использовали низкомолекулярные растворимые субстраты - целлоолигосахариды или хромогенные производные дисахаридов) [79, 80].
В-глюкозидазы (целлобиазы) отщепляют концевые нередуцирующие остатки (3-В-глюкозы от целлобиозы и олигосахаридов, причем скорость гидролиза уменьшается с увеличением числа глюкозидных остатков в олигосахариде [81, 82].
В отличие от эндоглкжаназ и целлобиогидролаз, специфичность действия Р-глюкозидаз, как правило, более широкая, и часто они способны расщеплять не только (3-1,4-, но и р-1,2-, Р-1,3-, р-1,6-глюкозидные связи [75, 76]. Некоторые ферменты способны также гидролизовать Р-В-галактозиды, а-Ь-арабинозиды или Р-В-ксилозиды [75].
Кроме того, многие Р-глюкозидазы могут отщеплять терминальные гликозидные остатки от арил- и алкил-гликозидов. Р-глюкозидазы грибов, как правило, являются более высокомолекулярными ферментами, чем эндоглюканазы и целлобиогидролазы; их молекулярные массы лежат в диапазоне 35-350 кДа, а pi - в интервале от 3,5 до 5,9 [64, 65]. В отличие от истинных целлюлаз, действующих на нерастворимую целлюлозу, Р-глюкозидазы часто являются субъединичными ферментами, у которых размер субъединиц варьируется от 41 до 170 кДа [65]. Например, Р-глюкозидаза из Botryodiplodiatheobromae с массой 350 кДа является октамером [86].
Другой особенностью Р-глюкозидаз является то, что они могут быть как внеклеточными, так и внутриклеточными (или связанными с мембраной) ферментами, что было продемонстрировано на примере T.reesei [87, 88], T.emersonii [89], Schyzophyllumcommune [90]. рН-оптимумы грибных Р-глюкозидаз в большинстве случаев находятся в слабокислой области (при рН 4,0-5,5) [65].
Изучение субстратной специфичности Р-глюкозидаз позволило подразделить их на три типа [91-94]: Р-глюкозидазы (целлобиазы), гидролизующие исключительно дисахариды состоящие из одинаковых моносахаридных остатков; арил-Р-глюкозидазы гидролизующие только глюкозиды, агликонами которых являются ариловые спирты (фенолы); Р-глюкозидазы, обладающие широкой специфичностью к агликоновой части, то есть гидролизующие дисахариды арилглюкозиды а также соответствующие олигосахариды.
Механизм биокаталитической деградации целлюлозы
Полученные таким образом трансформанты исследуют на наличие необходимой активности с использованием субстратов, содержащих чистую целлюлозу или другой целлюлозосодержащий субстрат. Другой метод основан на поиске альтернативных ферментов, являющихся необходимыми для конверсии биомассы (ЦБГ и ЕГ), или ферментов, способных усиливать действие существующих коммерческих целлюлазных комплексов. Данный метод получил в последнее время широкое распространение.
Следует отметить, что ферменты микробного происхождения зачастую плохо адаптированы к технологическим процессам, используемым в промышленности, поэтому в мировой практике для получения промышленных ФП используются технологии рекомбинантных ДНК, которые состоят в комбинации методов генной инженерии и микробиологии. Поскольку T.reesei является промышленным продуцентом целлюлолитического и ксиланолитического комплексов ферментов, понятно, что существует достаточное количество литературных данных о применении генно-инженерных методов для улучшения гидролитической функции ферментных препаратов, полученных на основе штамма Trichoderma.
Наиболее популярным подходом к увеличению экспрессии целлюлаз является метод, основанный на применении так называемых «сильных» промоторов или промоторов генов наиболее хорошо экспрессирующихся, т.н. «мажорных», белков. Целлобиогидролаза I (ЦБГ I) является мажорным белком ферментного комплекса, продуцируемого грибом T.reesei, содержание ее е вомплексе еоставляет тримерно о0% оо общего пула секретируемого белка. Таким образом, промотор гена ЦБГІ находит широкое применение для увеличения экспрессии гомологичных и гетерологичных белков. Следует отметить, что cbhl промотор относится к числу индуцибельных промоторов, данный промотор индуцируется целлюлозой, а также дисахаридами (гентиобиозой и софорозой). В работах [126-128, 133] такой подход был применен для увеличения уровня экспрессии гомологичной (3-глюкозидазы в грибе T.reesei. А А работе [129] ]налогичный йодход был успешно применен к экспрессии гетерологичной глюкуронозидазы в клетках T.reesei под контролем cbhl промотора.
Безусловным преимуществом индуцибельной системы экспрессии является возможность получения моно - продуцента целевого белка, что крайне важно для биотехнологии, поскольку новые штаммы могут обеспечить более экономически выгодный путь получения ферментных препаратов индивидуальных целлюлаз. Более того, при наличии отработанной системы скрининга возможно получение целого ряда ферментных препаратов, например, целлюлаз с различной эффективностью действия. Однако, получение таких ферментных препаратов осложнено тем, что встраивание в хромосому экспрессионных кассет происходит статистически и, даже имея информацию о строение генома микроорганизма, возможно только теоретически рассчитать копийность потенциальной встройки гена, но при этом скрининг и анализ получаемых штаммов весьма трудоемок.
В нашей работе мы использовали новый альтернативный метод получения штаммов - продуцентов, основанный на трансформации штамма - реципиента одновременно двумя и тремя плазмидами, несушими гомологичные и гетерологичные гены целлюлаз, а также клонирование линейным участком ДНК, несушим одновременно 2 гена целлюлаз. Данная стратегия позволит, на наш взгляд, увеличивать продукцию целевых белков без изменения состава основного секретируемого ферментного комплекса.
Экспрессия генов с использованием их собственных регуляторных последовательностей не всегда приводит к увеличению уровня экспрессии в штаммах. Поэтому в настоящий момент широкое распространение получило использование регуляторных полинуклеотидных последовательностей гена мажорного белка. Целлобиогидролаза I (ЦБГ I) является мажорным белком ферментного комплекса, продуцируемого грибом P.verruculosum, содержание ее е вкмплексе еоставляет тримерно до 30-40% от общего пула секретируемого белка.
Таким образом, промотор гена ЦБГ I находит широкое применение для увеличения экспрессии гомологичных и гетерологичных белков. Использование данного подхода привело к значительному увеличению продукции целевого белка (табл.3).
Целевой белок Штамм-реципиент Содержаниецелевогофермента в %от общегопула белка Литература К.свшхвзвл А (A.niger) P.verruculosum 50 [125] Р-глюкозидаза (A.niger) P.verruculosum 80 [126] МаннаназаВ(7 ееяг/) P.verruculosum 70 [127] На протяжении ряда последних лет в лаборатории биотехнологии ферментов ИНБИ РАН, совместно с лабораторией биосинтеза и получения ферментов ИБФМ РАН ведутся работы со штаммами гриба P.verruculosum. Этот микромицет был идентифицирован как продуцент целлюлаз в 1981 году. Особенностью дикого штамма P.verruculosum WA 30 являлась способность к гидролизу КМЦ. Он также обладал целлобиазной активностью, которая более чем в 10 раз превосходила целлобиазную активность T.reesei [134].
Первоначальная продуктивность дикого штамма P.verruculosum WA 30 составляла около 7 г/л секретируемого белка в культуральной жидкости (КЖ). Такая продуктивность довольно низка по сравнению с промышленными штаммами-продуцентами целлюлаз на основе Т. reesei (до 100 г/л).
С целью увеличения продуктивности штамм WA 30 подвергли серии последовательных мутагенезов с использованием УФ-облучения после обработки 1-метил-З-нитро-1 -нитрозогуанином (рис.9).
Полученные штаммы P.verruculosum В1-221-151 и В221-6 обладали высокой продуктивностью внеклеточных ферментов целлюлазного и гемицеллюлазного комплекса, которая составляет 30-40 г/л. Биосинтез ферментов в целлюлолитических штаммах низших грибов индуцируется целлюлозой, а также продуктами ее деструкции и в большинстве случаев подвержен катаболитной репрессии глюкозой. Однако катаболитная репрессия биосинтеза карбогидраз в полученных мутантных штаммах P.verruculosum В1-221-151 и В221-6 была значительно снижена. Это явилось значительным преимуществом перед исходным диким штаммом и позволило проводить периодические подпитки растущей культуры клеток гриба глюкозой. Целенаправленные изменения рН в процессе ферментации позволяют влиять на состав целлюлазного комплекса.
Некоторые побочные активности, как например, гемицеллюлазная, амилазная и целлобиазная становятся выше при более высоких значениях рН [135].
Следует отметить, что получение перспективных штаммов с устойчивой способностью к сверхеинтезу необходимых ферментов является весьма непростой задачей, так как многие мутантные штаммы со временем теряют такую способность. Однако, мутантные штаммы P.verruculosum В1-221-151 и В221-6 обладают стабильной продуктивностью и секрецией гидролитических ферментов, что было неоднократно доказано при пересевах штаммов на селективные среды [136].
Получение нротопластов и проведение транеформации штамма-реципиента гриба Р. verruculosum 4Q
Термостабильность ферментных препаратов исследовали при рН 5,0 в диапазоне температур 50-70 С. Результаты, характеризующие собой время, за которое препараты теряли половину по целлобиазной, авицелазной и КМЦ-азной активности, представлены в табл.12.
При 50С все ферментные препараты обладали высокой стабильностью по отношению к МКЦ и КМЦ (время полуинактивации составляла более 180 минут). В случае целлобиазной активности время полуинактивации составляла от 120 для (ЗГл-ЦБГП_Р.у-ЭГП-1 до 180 минут в случае рГл-ЦБГПР.у.
При 60С период полуинактивации активности по целлобиозе резко уменьшался для всех ферментных препаратов и составил 5-7 минут. Следует отметить, что в случае активности по МКЦ время полуинактивации оставалось высоким для всех ферментных препаратов (от 100 до 180 минут). В случае КМЦ-азной активности время полуинактивации составило 80-95 для препаратов рГл+ЭШ, (ЗГл-ЦБГИ_Р.у-ЭГП-1 и 55 минут для рГл-ЦБГПР.у., соответственно.
При 70С время полуинактивации всех ферментных препаратов по целлобиозе и КМЦ не превышало 3-4 минут. В случае авицелазной активности препараты рГл-ЦБГПР.у. и ЦБГПР.у-ЭГП-1 имели достаточно высокое время полуинактивации (30 и 25 минут соответственно). В случае ферментного препарата рГл+ЭГП время полуинактивации было порядка 5 минут. в целом, ферментные препараты имели значения рН-оптимумов целлобиазной, КМЦ-азной и авицелазной активноети, расположенные в слабокислой области (рН 4,5-5,5), значения температурных оптимумов варьировалось от 50 до 60С. Препараты обладали диапазонами значений рН5о% (рН 3,5-6,5) и Т50о/о (35-65С), проявляли наибольшую стабильность при 50 С, наименьшую-при 70С. Таблица 12. рН- и температурные оптимумы активноети ферментных препаратов, температурная етабильность ферментных
В нашей лаборатории была разработана принципиальная схема эффективного и быстрого разделения ферментных препаратов на основе штаммов P.verruculosum. Схема включает три стадии: стадию обессоливания супернатанта растворенного препарата методом гельпроникаюшей хроматографии; стадию грубого фракционирования ферментного комплекса (ионообменная хроматографии на носителе Source 15Q), с последующим анализом специфических активностей собранных белковых фракций, а также проведением ДДС-ЭФ; стадию тонкой очистки, включающую дополнительное разделение (гидрофобная хроматография на носителе Source 15Iso) белковых фракций, отобранных в ходе предыдущей стадии, с последующим анализом специфических активностей полученных фракций, а также проведением ДДС-электрофореза;
Именно этой схемой мы пользовались для определения компонентного состава изучаемых новых ферментных препаратов на основе рекомбинантных штаммов Р. verruculosum.
Отметим, что достоинством использования на первой стадии высокоэффективного анионообменного носителя Source 15Q является его высокая разрешающая способность и возможность легко масштабировать процедуру фракционирования. Максимальная нагрузка по белку составляет 10 мг на 1 мл носителя за один цикл разделения. Хроматографические профили, получаемые при фракционировании всех исследованных препаратов были, во многом, схожими, поэтому в качестве примера ниже подробно представлены данные, характеризующие фракционирование ферментного препарата «тандем» рГл+ЭГП, полученного при трансформации реципиентного штамма P.verruculosum линейной плазмидой, несущей гомологичную ЭГП 36 кДа и гетерологичную р-глюкозидазу 116 кДа, см. табл. 10).
Сухой ферментный препарат после растворения в ацетатном буфере и обессоливания методом ГПХ на носителе Bio Gel Р6 разделяли методом анионообменной хроматографии среднего давления (FPLC-еистема) на колонке с носителем Source 15Q (объем 1мл) при рН 6,8. Связавшиеся белка элюированием в градиенте ионной силы. В результате были получены: несвязавшаяся с носителем фракция (NB) и ряд фракций, выходящих в градиенте NaCl. Хроматограмма и данные ДДС-электрофореза представлены на рис. 24 и 25, соотвественно.
Объем алюента, мл Рисунок 24. Хроматографический профиль препарата рГл+ЭГП при разделении на ионообленном носителе 8ourcе15р при рН 6,8.
Несвязавшаяся фракция характеризовалась высокой активностью по КМЦ (рис. 24) и содержала 2 белка с массами 25 кДа и 23 кДа. Эти ферменты были идентифицированы нами как ЭГ III25 кДа и Ксил 23 кДа [142].
Фракции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 содержали весь пул целлобиогидролаз (ЦБР II 60 кДа, ЦБГ II 50 кДа, ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ I 55 кДа), а так же ЭГ II 33 кДа и ЭГ 40 кДа. Кроме того, фракция 3, содержала Р-глюкозидазу 116 кДа P.verruculosum [142]. Фракции 8, 9, 10 характеризовалась сравнительно высокой активностью по КМЦ. Они содержат ЭГ I 52 кДа, ЭГ I 57 кДа, ЭГ I 70 кДа [142]. Фракции 11 и 12 оказались гомогенными и содержали белок с массой 120 кДа. Удельная активность белка по целлобиозе в этих фракциях составила 120 ед/мг белка. Фермент был определен как Р-глюкозидаза 120 кДа A.niger [142]. ДДС-ЭФ фракций, полученных в результате разделения препарата рГл+ЭГП на ионообменном носителе SourcelSQ. М - стандартные маркеры для ДДС-ЭФ, приведена масса в кДа.
Похожие диссертации на Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum
