Содержание к диссертации
Введение
I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗА И ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ)..9
1.1. Виды и запасы ЦСМ 9
1.2. Состав и структура ЦСМ 10
1.3. Предобработка ЦСМ 15
ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ УПОРЯДОЧЕННЫХ ФОРМ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ 17
2.1. Современные представления о классификации ферментов 17
2.2. Целлюлолитические ферменты 21
2.3. Механизм действия целлюлазного комплекса 26
2.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы 29
ГЛАВА 3. ПЕРСПЕКТИВНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ
КОНВЕРСИИ ЦСМ 33
ГЛАВА 4. ШТАММ PENICILLIUM VERRUCULOSUMH КОМПОНЕНТЫ СЕКРЕТИРУЕМОГО ИМ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА 40
4.1. Характеристика штамма P.verruculosum 40
4.2. Ферменты P.verruculosum 42
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 44
5.1. Использованные ферменты 44
5.2. Субстраты и реактивы 45
5.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка 47
5.4. Методы выделения и очистки ферментов 47
5.5. Методы определения активности ферментов 48
5.6. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков 49
5.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов 50
5.8. Исследование устойчивости ферментов к "термошоку" 50
5.9. Определение адсорбционных характеристик ферментов 51
5.10. Гель-хроматографический анализ продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов 51
5.11. Оценка способности целлюлаз к биодепигментации джинсовой ткани 51
5.12. Оценка способности ферментов к биополировке окрашенной хлопковой ткани 55
5.13. Исследование кинетики глубокого гидролиза МКЦ 55
5.14. Определение гидролитической способности ферментных препаратов 56
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ КОМПЛЕКСА P. VERRUCULOSUM. 57
6.1. Целлюлолитические и сопутствующие активности целлюлазного комплекса P.verruculosum 57
6.2. Фракционирование исходного ферментного препарата с помощью ионобменной хроматографии на Source 15 Q 61
6.2.1. Разделение фракции №6 после АОХ на Source 15 Q 71
6.2.2. Разделение фракции №7 после АОХ на Source 15 Q 73
6.2.3. Разделение несвязавшейся фракции после АОХ на Source 15 Q 76
6.3. Идентификация выделенных ферментов методом масс-спектрометрии 83
ГЛАВА 7. СВОЙСТВА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ КОМПЛЕКСА P.VERRUCULOSUM. 95
7.1. Субстратная специфичность 95
7.2. рН- и температурные оптимумы действия ферментов, стабильность, устойчивость к термошоку 103
7.3. Адсорбционная способность выделенных ферментов 111
7.4. Анализ способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов животных и птиц 113
7.5. Выявление ключевых тополитических ферментов 119
7.6. Выявление ключевых гидролитических ферментов 121
ГЛАВА 8. СРАВНЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТНЫХ КОМЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ P. VERRUCULOSUM.....123
8.1. Результаты анионобменной хроматографии на Mono Q 124
8.2. Результаты гидрофобной хроматографии на Source Isopropyl 130
ГЛАВА 9. СРАВНЕНИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ P. VERRUCULOSUMYL TRICHODERMA SP 138
9.1. Сравнение осахаривающей способности целлюлазных препаратов 138
9.2. Вклад слабо и сильно адсорбирующихся компонентов целлюлазного комплекса в гидролиз целлюлозы 144
9.3. Анализ зависимости выхода Сахаров от активности в реакционной смеси...148
9.4. Влияние р-глюкозидазы на эффективность ферментативного гидролиза
целлюлозы 153
ВЫВОДЫ 158
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 160
ПРИЛОЖЕНИЯ (масс-спектры трипсиновых гидролизатов вьщеленных ферментов).
- Виды и запасы ЦСМ
- Современные представления о классификации ферментов
- Характеристика штамма P.verruculosum
Введение к работе
Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX века. К сегодняшнему дню ферментные препараты стали мощным средством переработки практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов.
В настоящее время основа процесса биоконверсии растительной биомассы состоит в гидролизе целлюлозы до глюкозы с последующим сбраживанием до этанола или получении иных продуктов микробного синтеза. Природная древесина, отходы ее переработки, сельскохозяйственные целлюлозосодержащие отходы представляют потенциальный интерес как дешевый и возобновляемый источник для получения различных продуктов и топлива [1]. Тем не менее, природная древесина и другие целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет кристаллическую структуру, а пространство между целлюлозными волокнами заполнено гемицеллюлозньгми волокнами, трудно разрушаемой матрицей лигнина, а также пектиновыми оболочками. Следовательно, для эффективного гидролиза с помощью ферментов необходимо провести предварительную обработку, направленную на разрушение кристаллической структуры целлюлозы и удаление лигнина. В настоящее время экономический интерес представляют такие методы предобработки, как паровой взрыв и обработка водно-этанольной смесью в кислой среде (органозольвом). Последний способ наиболее предпочтителен, так как приводит к более полному удалению лигнина из древесины, и образуется более реакционноспособный субстрат для ферментативной конверсии [2].
Стоимость предобработки, а также эффективность гидролитического действия целлюлазных комплексов являются основными факторами, влияющими на экономическую рентабельность процессов биоконверсии лигноцеллюлозной биомассы.
Глубокая деструкция целлюлозы с образованием растворимых Сахаров осуществляется под действием полиферментной системы целлюлаз, включающей в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы. Свойства индивидуальных ферментов, а также их взаимодействие в составе целлюлазного комплекса определяют его эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов.
В настоящее время во многих странах ведется активный поиск новых микроорганизмов - эффективных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. Проводятся также работы по получению новых штаммов - суперпродуцентов ферментов методами генетической инженерии.
Среди различных организмов - промышленных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз грибы рода Trichoderma получили наибольшее распространение поскольку обладают высокой секреторной способностью.
В отличие от Trichoderma, грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью [3]. Поэтому получение высокопродуктивных штаммов Penicillium является задачей, имеющей большое научное и прикладное значение.
Целью диссертационной работы являлось исследование свойств ферментного комплекса, секретируемого новыми мутантными высокопродуктивными штаммами гриба P. verruculosum, полученными в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Разработать эффективный метод разделения компонентов ферментного комплекса P. verruculosum, на основе чего определить состав комплекса и получить очищенные индивидуальные ферменты.
Исследовать биохимические и кинетические свойства индивидуальных ферментов.
Сравнить компонентный состав ферментных комплексов, продуцируемых различными мутантными штаммами P. verruculosum.
Сравнить гидролитическую способность различных целлюлазных полиферментных систем по отношению к различным типам предобработанной древесины.
Выявить вклад слабо и прочно адсорбирующихся целлюлаз в эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих субстратов.
Оценить роль р-глюкозидазы в процессе гидролиза.
Виды и запасы ЦСМ
Целлюлоза является одним из наиболее распространенных растительных полимеров. Ежегодный прирост растительных органических соединений (растительной биомассы) в процессе биосинтеза составляет около 2 10й т, примерно треть этого количества приходится на целлюлозу [4].
К ЦСМ, которые могут быть пригодны как сырье для получения Сахаров, относятся вторичные продукты лесопиления и деревообработки, а также отходы переработки сельскохозяйственных культур. Критериями использования тех или иных запасов являются их стоимость, размеры запасов, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства, технологические свойства.
Среди вторичных ресурсов и отходов промышленности и сельского хозяйства, прежде всего следует отметить древесное сырье. К нему относятся лесосечные отходы - ветки, вершины, пни, кора (25% от общего количества древесины), лесопильные твердые (горбыль, рейка, обрезки и т.д., всего до 20%) и мягкие отходы - опилки (до 12%). К сельскохозяйственным отходам относится злаковая солома, содержащая 30% целлюлозы. Ее в мире накапливается до 4-5 млрд. т в год. Она мало используется, гниет или сжигается [4]. В хлопководческих республиках неиспользуемыми отходами являются стебли хлопчатника (0,8 т на 1 т хлопка), хлопковая шелуха, семена хлопчатника, коротковолокнистые остатки хлопка, циклонный пух и т.д. В районах, где производится кукуруза, отходами является кукурузная кочерыжка (400-600 тыс. т в год). На мукомольных заводах накапливается шелуха (25% от массы зерна). Отходом первичной обработки льна является так называемая костра (до 70% от массы поступающей на обработку). Также следует упомянуть верховой малоразложившийся слой торфа (степень разложения 15-20%), химический состав которого во многом повторяет химический состав растений, образующих его. Запасы торфа огромны, причем имеются крупные месторождения, в которых содержание торфа достигает 2-30 млн. т [5-7].
Интересным представляется использование в качестве сырья промышленных отходов, содержащих делигнифицированную, или обработанную иным способом целлюлозу, например, отходы вискозных заводов [6]. В отличие от древесной и хлопковой, эта целлюлоза в значительной степени аморфизована. Другими отходами являются отходы целлюлозно-бумажного производства [8]. Целлюлозу содержат также муниципальные отходы и макулатура.
Состав и структура ЦСМ.
Целлюлоза является основным компонентом растительной биомассы и по строению представляет собой линейный полимер, ангидроглюкозные звенья которого связаны р-1,4-гликозидными связями. Степень полимеризации (СП) целлюлозы может меняться от 12000 до 15000, а молекулярная масса может составлять более 1.5 млн а.е.м. [9]. Молекулярное строение целлюлозы определяет ее надмолекулярную структуру, а так же физико-химические и морфологические свойства. Как и для всех гидрофильных линейных полимеров, для целлюлозы характерно образование первичных фибрилл, в которых группы параллельно расположенных цепей молекул связаны между собой большим количеством водородных связей. В первичных фибриллах однородные высокоупорядоченные кристаллические зоны чередуются с неоднородными и менее упорядоченными аморфными зонами. В кристаллитах существует трехмерный дальний порядок в расположении цепей целлюлозы. В аморфных участках дальний порядок отсутствует, а сохраняется лишь общая продольная направленность цепей [10]. Аморфная целлюлоза имеет рыхлую структуру и поэтому более доступна для ферментов. Напротив, кристаллическая высокоупорядоченная целлюлоза гораздо труднее поддается разрушению под действием ферментов [11].
Другими основными составляющими растительных тканей, заполняющими пространства между микрофибриллами целлюлозы, являются гемицеллюлозы и лигнин [11, 12]. В зависимости от источника (и способов выделения), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру [13,14]. Большинство изученных гемицеллюлоз являются гетерополисахаридами (табл.1.2.1). В состав звеньев основной цепи полимерных молекул могут быть включены: D-ксилоза, D-манноза, D-галактоза, D-глюкоза, D-глюкуроновая кислота, D-4-O-метилглюкуроновая кислота, L-арабиноза, а также присоединенные через сложноэфирные связи остатки уксусной, феруловой и кумаровой кислот [15] (табл. 1.1).
Функциональная роль гемицеллюлоз заключается в осуществлении взаимосвязи основных компонентов клеточной стенки за счет формирования переходного слоя между ними. В первичной клеточной стенке они объединяют пектины и целлюлозу, во вторичной - целлюлозу и лигнин. Присоединение лигнина осуществляется для большинства растений посредством образования диферуловых (дикумаровых) мостиков между ксиланом и лигнином. СП гемицеллюлоз значительно меньше, чем у целлюлозы и варьирует от 50 до 200 [14].
Современные представления о классификации ферментов
С момента открытия первых целлюлаз, ксиланаз, и других карбогидраз, традиционным методом классификации было группирование их по субстратной специфичности и механизму действия (эндоглюканазы, целлобиогидролазы, целлобиазы, экзоглюкозидазы, эндоксиланазы, р-ксилозидазы и др.). Этот подход нашел отражение в международном классификаторе ферментов, где карбогидразам отведена группа КФ3.2.1.Х [190]. Такой тип классификации оказывается полезным для практических целей, но для систематизации ферментов-карбогидраз он не очень подходит. Главные причины в том, что эти ферменты обладают зачастую перекрестной специфичностью, и часто отсутствие детальной информации о механизме их действия. В результате, очень похожие, как впоследствии оказалось, по механизму действия и строению ферменты были помещены в разные подгруппы [191].
Указанная выше классификация была подвергнута критике, и в конце 80-х Хенриссатом с соавторами была новая общая классификация ферментов, основанная на данных гидрофобного кластерного анализа (ГКА) [192]. Метод ГКА базируется на сравнении двумерной топологии и распределения двумерных кластеров аминокислот вдоль полипептидной цепи белка. К тому времени уже были накоплены данные по аминокислотным последовательностям целлюлаз из различных источников, и было обнаружено, что многие ферменты имеют доменную (модульную) структуру, т.е. состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), которые соединены пептидным линкером [193,194]. Согласно данным ГКА авторы [192] разделили каталитические домены целлюлаз на 6 семейств: «A-F». Несколько позже тем же Хенриссатом было предложено классифицировать целлюлазы (и, в общем случае, гликозил-гидролазы) по гомологии первичных аминокислотных последовательностей и структурным особенностям с учетом доменной организации молекулы белка [195]. Таким образом, аминокислотые последовательности каталитических доменов гликозил-гидролаз (всего 291 последовательность), представляющих 39 отдельных позиций (номеров) в «Номенклатуре ферментов», были разделены на 35 семей. Семьи целлюлаз от А до F получили номера 5,6,7,8,9 и 10 соответственно. В дальнейшем количество семей постоянно увеличивалось [196,197]. На начало 2005 года было уже известно более 100 семей гликозил-гидролаз. Самую свежую информацию по классификации по семьям можно найти на сайте http://afmb.cnrs-mrs.fr/KAZY/. В пределах одной семьи ферменты проявляют сходство (гомологию) аминокислотных последовательностей и характеризуются одинаковым типом укладки (фоддинга), т.е. имеют одинаковую трехмерную структуру. Кроме того, все ферменты, принадлежащие к одной и той же семье, функционируют по одинаковому механизму с точки зрения стереохимии катализа, т.е. катализируют расщепление гликозидной связи либо с сохранением, либо с обращением аномерной конфигурации субстрата. Наличие близких типов укладки (фоддинга) и локализации функциональных групп у ферментов способствовало их объединению в суперсемейства или кланы [198]. К настоящему времени выделено 14 таких кланов: от GH-A до GH-H.
По современным представлениям целлюлазы (эндоглюканазы и целлобиогидролазы) попали в следующие семьи: 5,6,7,8,9,10,12,26,44,45,48,61 и 74 [198,199]. Следует отметить, что в одной семье могут находиться не только целлюлазы, но и ферменты с другой специфичностью, т.е. действующие на нецеллюлозные полисахариды. Например, 5 семья, одна из наиболее больших и состоящая из нескольких подсемейств, представлена не только целлюлазами, но также включает в себя р-маннаназы, ксиланазы и некоторые другие ферменты. Семья 10 представлена в основном ксиланазами, но там присутствуют и несколько целлобиогидролаз. Это же касается и других семей. Более подробную информацию о современной классификации целлюлаз по семьям можно найти в обзоре М.Л. Рабиновича с соавторами [198].
Что касается других Р-1,4-гликаназ, то р-глюкозидазы классифицированы в семьи 1,3 и 9, а немногочисленные специфические ксилоглюканазы входят либо в 12-ю, либо в 74-ю семью [200].
В таблице 2.1 суммированы результаты по классификации известных гликозил-гидролаз, продуцируемых различными видами грибов Penicillium. Примечательно, что в базах данных отсутствуют данные по пеницильным ферментам целлюлазных семей 1,3,6,8,9,12,26,44,45,48,61.
Перспективные биотехнологические процессы конверсии ЦСМ
Во времена Второй Мировой Войны армия США на Тихоокеанском театре военных действий столкнулась не только с японскими вооруженными силами но и с агрессивным воздействием тропической окружающей среды: одежда, палатки, аммуниция, сделанные из хлопковой ткани буквально за несколько дней разрушались. Этим "врагом" американских вооруженных сил оказался микроскопический гриб Т. reesei - продуцент целлюлаз [126]. Так началась история исследования целлюлаз. С тех пор на поиск новых штаммов - продуцентов целлюлаз потрачены огромные средства. Одним из таких штаммов являлся штамм Р. verruculosum WA 30. Он был идентифицирован как продуцент целлюлаз, обладающий очень высокой способностью гидролизовать КМЦ. Однако он практически не имел целлобиазы, и в этом отношении не отличался от Т. reesei [124].
Более подробно следует рассмотреть штаммы В221-151 и В221-6, которые, по предварительным данным [125] являются перспективными продуцентами активных целлюлаз и ксиланаз. Эти штаммы были получены из дикого штамма WA 30 методом мутагенеза при использовании в качестве мутагенов нитрозогуанидина (НГ) и ульрафиолетового облучения (УФ), с последующей селекцией по следующей схеме:
Образование целлюлаз в полученных штаммах индуцибельно и подвержено углеродной катаболитной репрессии, однако особенность мутантов заключается в том, что катаболитная репрессия в них существенно редуцирована. Целенаправленные изменения рН в процессе ферментации позволяют влиять на состав целлюлазного комплекса. Некоторые побочные активности, как например, гемицеллилазная, амилазная и целлобиазная становятся выше при более высоких значениях рН [126].
Следует отметить, что получение перспективных штаммов с устойчивой способностью к сверхсинтезу необходимых ферментов является весьма непростой задачей, так как многие мутантные штаммы со временем теряют свои способности к сверхсинтезу тех, или иных ферментов [127].
Ферменты P. verruculosum.
Основные целлюлазные ферменты P. verruculosum частично описаны в работах [128-132]. В результате разделения комплекса P. verruculosum были получены 17 ферментов. Молекулярные массы изменялись в широком диапазоне: от 19100 до 114800 Да. Практически все выделенные ферменты были гликопротеинами, содержание углеводов в которых изменялось от 4,13 до 48,3%. Изоэлектрические точки изменялись в узком диапазоне от 3,7 до 5,8. Значения рН-оптимумов действия находятся в узком диапазоне 4-5,5. Температурные оптимумы варьировали в более широком диапазоне 50-80С. По данным работы [126] выявлены прочносорбнрующиеся на целлюлозе ферменты - ксиланазы III и IV (XYN III, XYN IV), также установлено, что основным тополитическим ферментом комплекса является эндоглюканаза V (EG V). С помощью ограниченного протеолиза папаином доказано наличие бифункциональной организации в структуре XYN III, выделены каталитические и адсорбционные домены. Для EG V расшифрована первичная последовательность и предложена модель ее вторичной и третичной структуры. В работе [133] изучен процесс трансгликозилирования под действием целлобиазы и установлено, что константа скорости трансгликозилирования почти в 600 раз превышает константу скорости гидролиза целлобиозы.
В целом, согласно работам [128-132], в состав P. verruculosum входят шесть эндоглюканаз, четыре ксиланазы, три целлобиогидролазы, одна целлобиаза ф-глюкозидаза) и три неклассифицированных фермента.
Однако, несмотря на сравнительно большой объем исследований в данном направлении, многае вопросы остаются открытыми. Например, несмотря на высокую активность комплекса в целом, индивидуальные ферменты имели относительно низкую удельную активность по специфическим субстратам: активность эндоглюканаз по отношению к Р-глюкану составляла всего 1,3-11 ед/мг [3], а для ксиланаз активность по ксилану не превышала 30 ед/мг [126]. Это в какой-то мере связано с инактивацией в процессе выделения, так как во время опубликования этих работ в руках у исследователей не было современных высокоэффективных хроматографических носителей и приходилось использовать высокие (или наоборот, очень низкие) стартовые значения рН для нанесения белка на колонку. Процесс разделения комплекса был долгим и весьма трудоемким, а элюированные с хроматографической колонки фракции получались разбавленными, что также негативно отражалось на сохраняемой активности. Немаловажен и тот факт, что основные исследования проводились в так называемый «догеномный» период, и информация по принадлежности к той или иной белковой семье, тип фолдинга и т.д. для ферментов P. verruculosum (кроме EG V) фактически отсутствовали. И, наконец, из данных по изоэлектрофокусированию P. verruculosum [126] видно, что общее число компонентов превышает выделенное количество, и роль этих минорных компонентов не установлена.
