Содержание к диссертации
Введение
1. Структура и свойства основных компонентов растительной биомассы 7
1.1. Целлюлоза 8
1.2. Гемицеллюлозы и пектины 10
1.3. Лигнин 12
1.4. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов 13
2. Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащего сырья 17
2.1. Общие сведения о целлюлолитических ферментах 17
2.2. Особенности строения целлобиогидролаз и эндоглюканаз 18
2.3. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз 23
2.4. Механизм действия целлюлазного комплекса 24
2.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы 28
2.6. Применение целлюлаз в производстве этанола 32
2.7. Ферментный комплекс гриба Penicillhim vernicidosum 36
3. Объекты исследования и методы экспериментов 39
3.1 Использованные ферменты 39
3.2. Субстраты и реактивы 39
3.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка 42
3.4. Методы выделения и очистки ферментов 43
3.5. Методы определения активности ферментов 44
3.6. Определение адсорбционных характеристик ферментов 45
3.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов 45
3.8. Изучение термостабильности ферментов 46
3.9. Ограниченный протеолиз ферментов папаином 46
3.10. Гель-хроматографический анализ продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов 46
3.11. Исследование кинетики глубокого гидролиза МКЦ 46
3.12. Гидролиз различных целлюлозосодержащих субстратов 47
3.13. Масс-спектрометрический анализ пептидов и построение трехмерных моделей ферментов 47
4. Выделение и очистка ферментов целлюлазного комплекса P. verruculosum 49
5. Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз, эндоглюканаз и р-глюкозидазы P. verruculosum и их аминокислотные последовательности 59
5.1. ЦБГII 6-й семьи гликозид-гидролаз 59
5.2. ЦБГІ 7-й семьи гликозид-гидролаз 67
5.3. ЭГII 5-й семьи гликозид-гидролаз 76
5.4. Р-Глюкозидаза 3-й семьи гликозид-гидролаз 80
6. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз P. verruculosum 85
6.1. Субстратная специфичность и каталитические свойства 85
6.2. Адсорбционные характеристики 89
6.3. Ограниченный протеолиз ферментов папаином 90
6.4. Термостабилыюсть 91
6.5. Температурный и рН-оптимум действия ферментов 93
6.6. Состав низкомолекулярных продуктов гидролиза Р-глюкана эндоглюканазами 96
6.7. Выявление ключевых гидролитических ферментов 96
7. Создание ферментных комплексов для эффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов 99
7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз 99
7.2. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов гомогенными ферментами и их смесями 110
7.3. Изучение влияния различных эффекторов на гидролитическую способность целлюлаз 131
Выводы 140
- Гемицеллюлозы и пектины
- Применение целлюлаз в производстве этанола
- ЦБГІ 7-й семьи гликозид-гидролаз
- Температурный и рН-оптимум действия ферментов
Введение к работе
На сегодняшний день перед человечеством стоит проблема потенциального исчерпывания традиционного углеводородного сырья, из которого производят моторное топливо и продукты химического синтеза. Кроме того, с каждым годом увеличивается объем антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу, что приводит к изменению климата на Земле. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии, одним из которых является возобновляемое растительное сырье -лигноцеллюлозная биомасса, отходы промышленности и сельского хозяйства. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза такой лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо -этанол или бутанол.
Природная древесина, различные виды сельскохозяйственных культур и другие целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет упорядоченную (кристаллическую) структуру, и во многих случаях субстрат содержит в своем составе сопутствующие вещества (в первую очередь лигнин), которые служат физическим барьером, затрудняющим доступ ферментов к гликозидным связям. Возникает необходимость поиска возможностей увеличения реакционной способности субстрата (предобработки растительного сырья). Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.
Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и взаимодействия индивидуальных ферментов в нем, стабильности целлюлаз, ингибирующего влияния на них продуктов гидролиза. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatwn и др.) играют ведущую роль [1]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Наиболее существенным недостатком данного продуцента целлюлаз является, низкое содержание Р-глюкозидазы [2], отвечающей за конверсию промежуточных продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы в конечный продукт- глюкозу.
В отличие от Trichoderma, грибы рода Penicilliwn синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее
расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью [3, 4]. Поэтому получение высокопродуктивных штаммов Penicilliiim является задачей, имеющей большое научное и прикладное значение.
Ключевые ферменты целлюлазного комплекса — эндоглюканазы и целлобиогидролазы, способные гидролизовать главным образом высокоупорядоченные области целлюлозы. Целлобиогидролазы I и II и эндоглюканазы I и II Г. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. Достаточно много информации опубликовано также о целлобиогидролазах и эндоглюканазах из таких грибных продуцентов целлюлаз, как Hmnicola insolens, Phanerochaete chysosporium, Т. emersonii, Т. aurantiacus и некоторых других, в тоже время о свойствах других грибных целлюлаз известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных белков имеется значительное количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов. Сведения, касающиеся пеницильных ферментов-карбогидраз, весьма противоречивы, а аминокислотных последовательностей, транслированных из. генов P. verrucidosum, практически нет в белковых базах данных. Некоторые ферменты, продуцируемые P. verrucidosum, уже изучены в нашей лаборатории. Создание новых мутантных штаммов привело к секреции новых ферментов: целлобиогидролазы 60 кДа и эндоглюканазы 70 кДа.
Целью диссертационной работы являлось изучение молекулярных и каталитических свойств целлобиогидролаз и эндоглюканаз, секретируемых" высокопродуктивным мутантным штаммом гриба P. verrucidosum В221-151, полученным в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, а также разработка подхода для создания на основе ферментов P. verrucidosum смесей, способных осуществлять глубокий гидролиз растительной биомассы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Выделить все секретируемые целлюлазы P. verrucidosum;
Исследовать биохимические и каталитические свойства целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа в сравнении с ранее описанными целлобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента;
Разработать подход для создания мультиферментных смесей на основе целлюлаз P. verrucidosum для эффективного гидролиза различных целлюлозосодержащих субстратов.
Гемицеллюлозы и пектины
Гемицеллюлозы составляют около 20% клеточной стенки растений. В зависимости от источника (и способов выделения), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру. Гемицеллюлозы - более гетерогенные полисахариды. Основным гемицеллюлозным полимером злаков и лиственных деревьев является ксилан. Основная цепь ксилана построена из остатков D-ксилозы, соединенных Р-1,4-связями, и может содержать различные заместители (боковые цепи), включающие остатки L-арабинозы, D-галактозы, D-маннозы, ацетил-, ферулоил- и и-кумароил -группы, а также остаток глюкуроновой кислоты [б, 17]. Функциональная роль гемицеллюлоз заключается в осуществлении взаимосвязи между основными компонентами клеточной стенки за счет формирования переходного слоя между ними. В первичной клеточной стенке они объединяют пектины и целлюлозу, во вторичной — целлюлозу и лигнин. Присоединение лигнина осуществляется для большинства растений посредством образования диферуловых (дикумаровых) мостиков между ксиланом и лигнином. У некоторых растений (например, бука) присоединение также возможно за счет образования сложноэфирной связи между глюкуроновой кислотой ксилана и ароматическим спиртом лигнина. Присоединение пектина к гемицеллюлозе осуществляется через арабинаны и арабиногалактаны. СП гемицеллюлоз существенно меньше, чем у целлюлозы, и варьирует от 50 до 200 [17]. Ксилоглюканы служат связующим звеном между целлюлозой и другими полисахаридами в первичной клеточной стенке, а также в семенах однодольных и двудольных растений. Основная цепь ксилопокана построена из Р-1,4 связанных D-глюкопиранозных остатков, к которым присоединена (а-1,6 связью) D-ксилопираноза или В-ксилопиранозил-р-В-1,2-галактоза. В ксилоглюканах двудольных растений встречаются боковые цепи и с более сложной структурой (фукозил-сс-1,2-галактозил-Р-1,2-ксилозил) [18]. Первоначально ксилоглюканы были обнаружены в семенах растений, где они служат запасными полисахаридами клеточных стенок [9]. Эти ксилоглюканы давали синий комплекс с йодом и получили название амилоиды [19].
Наиболее изучен и часто используется ксилоглюкан, получаемый из семядолей семян тамаринда {Tamarindus indicd) [20]. В ксилоглюканах семян растений, в том числе тамаринда, не обнаружены фукозильные заместители. В большом количестве ксилоглюкан содержится в первичных клеточных стенках двудольных растений, составляя до 20-25% первичной клеточной стенки [18]. Основным отличием от ксилоглюканов семян является наличие фукозильных заместителей. Эти заместители могут быть присоединены к галактозилыюму остатку, ближайшему к восстанавливающему концу мономерного звена [9]. Арабиноглюкуроноксилан (арабиноксилац) — гетерополисахарид, составляющий 7-8% от сухой массы мягкой (хвойной) древесины. Основная цепь его состоит из 1,4-p-D-ксилопиранозных звеньев, а боковые группы представляют собой 4-0-метил-Б-глюкуроновую кислоту (сс-1,2-связь, 20%) и L- арабинофуранозу (сс-1.2-связь и сс-1,3-связь, 10-15%) [17]. Структура арабиноксиланов злаковых растений зависит от их локализации. Арабиноксиланы, входящие в состав шкурки зерна, по структуре схожи с арабиноксиланом мягкой древесины. Арабиноксиланы, входящие в состав эндосперма зерна, в качестве боковых заместителей содержат только L-арабинофуранозу (ос-1,2-связь и а-1,3-связь, а-1,3-связь доминирует) [17], причем ее содержание существенно выше, чем у арабиноксиланов хвойных пород. Высокое содержание боковых арабинозных заместителей обуславливает высокую вязкость арабиноксиланов данного типа. Арабиноксиланы однодольных растений этерифицированы по С-5 атому L- арабинофуранозы феруловой или кумаровой кислотами [21]. Степень этерификации варьирует в зависимости от источника арабиноксилана. СП арабиноксилана варьирует в пределах от 70 до 130 [17].
Галактоглюкоманнан — преобладающий компонент гемицеллюлаз мягких (хвойных) пород деревьев. Основная цепь галактоглюкоманнана сформирована 0-1,4 связанными остатками D-машюпиранозы и D-глюкопиранозы, которые чередуются большей частью произвольным образом, а боковые цепи - остатками D-галактозы, соединенные с основной цепью сс-1,6-связями. Кроме того, в среднем каждый четвертый гликозидный остаток в основной цепи ацетилирован по С-2 или С-3 атомам. Выделяют два типа галактоманнанов: с высоким и низким содержанием галактозы. В первом, составляющем 5-8% от сухой массы хвойной древесины, соотношение галактоза/глюкоза/манноза можно представить как 1/1/3. Во втором, составляющем 10-15% от сухой массы хвойной древесины - 0,1/1/3 [17]. Гліокоманнан, составляющий 2-5% от сухой массы твердой древесины, - это сополимер, Р-1,4 связанных D-маннопиранозных и D-глюкопиранозных остатков. Относительное содержание Сахаров зависит от источника выделения глюкоманнана, но в среднем может быть описано как 1/1 или 1/2 [17]. Пектины входят в состав многих растительных тканей. Они выполняют важную функцию: регулируют водный обмен, являясь промежуточным звеном в поглощении и транспорте ионов.
Под термином пектины подразумевают группу полисахаридов, общим признаком которых является наличие неразветвленных блоков полигалактуроновой кислоты или ее метилового эфира. Изучение пектинов из разных растительных источников показало, что молекулы пектина имеют основную цепь, состоящую из остатков а-1,4-галактуроновой кислоты с вставками 1,2-связанных остатков L-рамнопиранозы [22]. Доля остатков рамнозы обычно составляет 1-4%. Боковые цепи пектина преимущественно представлены остатками D-галактозы, L-арабинозы, D-ксилозы. Редко встречаются остатки D-глюкозы, D-маннозы, L-фукозы, D-глюкуроновой кислоты. В пектинах из некоторых источников (например, сахарной свеклы и яблок) обнаружена феруловая кислота, которая присоединяется к пятому кислородному атому концевого остатка арабинозы или ко второму кислородному атому концевого остатка галактозы. Ее основная роль - сшивание молекул пектина [23]. Природные пектины, как правило, высокометилированы (по карбоксильной группе D-галактуроновой кислоты), и лишь немногие из них, например, пектин из свеклы, ацетилированы (по гидроксильным группам D-галактуроновой кислоты) [17]. Лигнин - третий важнейший компонент растительной биомассы. Он принадлежит к числу наиболее распространенных на земной поверхности веществ, уступая в этом отношении только целлюлозе. Он входит в состав одревесневших клеток всех наземных растений и, по мнению большинства исследователей, химически связан с углеводами. Молекулярная масса лигнина изменяется от нескольких сотен до миллиона [24]. При выделении из древесины любым методом лигнин претерпевает необратимые изменения. Об этом свидетельствует уже то, что цвет его меняется в зависимости от способа выделения от светло-желтого до темно-коричневого. Существование различных типов связей между лигнином и другими компонентами клеточной стенки, многообразие связей и функциональных групп самой макромолекулы лигнина приводят к тому, что при различных способах выделения лигнина из клеточной стенки получаются препараты, значительно отличающиеся по своим свойствам не только от природного лигнина, но и друг от друга [24]. Указанные причины делают условными и все методы количественного определения лигнина. Лигнин можно представить как нерегулярный полимер с разветвленными макромолекулами, построенными в основном из замещенных фенилпропановых звеньев.
Применение целлюлаз в производстве этанола
В настоящее время биоэтанол является альтернативным источником энергии [152]. Возросший интерес к нему связан в первую очередь с тем, что за последние десятилетия цены на топливо (бензин) неумолимо растут, особенно сильно это проявилось в 1973 году, когда арабские страны-экспортеры нефти ввели эмбарго на поставку «черного золота» государствам, поддержавшим Израиль, и в 1979 году после исламской революции в Иране. В результате мировые цены на нефть выросли в три раза. Другой важной причиной особого интереса к биоэтанолу как альтернативному топливу является снижение загрязнения воздушной среды продуктами горения. Отработанные газы двигателей внутреннего сгорания (работающих на бензине) содержат около 200 компонентов, причем период их существования длится от нескольких минут до 4-5 лет. Биоэтанол как альтернативное топливо в результате сгорания дает только углекислый газ. Мировые лидеры по производству топливного этанола — Бразилия и США. В США весь топливный этанол продуцируется биотехнологически - путем сбраживания (дрожжами) Сахаров (сахарный тростник) или глюкозы, полученной из крахмалосодержащего сырья (различные зерновые культуры). Благодаря его производству Соединенные Штаты ежегодно экономят 1,5 млрд. долларов на импорте нефтепродуктов. В крупных городах США (с населением более 1 млн. чел.) в зимний период используют лишь бензин, содержащий 10% этанола, - так называемый бензин ЕЮ, или газохол. Объем продажи газохола в США составляет 12% от общего объема продажи бензина. На сегодняшний день этанол является наиболее широко используемым биотопливом, чей оборот в США составляет 1,8 млрд. галлонов в год. Крупные автопроизводители создают машины, работающие на биотопливе. Например, компания Ford of Europe продала в прошлом году в Европе 17500 автомобилей Flexifuel, работающих на биоэтаноле.
Такие автомобили можно заправлять как бензином, так и биоэтанолом Е85, (смесью, содержащей 85% спирта и 15%) бензина), что позволяет снизить общее количество выбросов СОг за весь жизненный цикл автомобиля на 30-80% (в зависимости от используемого сырья и процессов производства (http://w\wv.fbrd.ru/T). Китай за три года сумел войти в четверку крупнейших производителей топливного этанола в мире. Первые партии биоэтанола были выпущены в конце 2003 году, а в 2007 году объем производства биоэтанола достиг максимального показателя. Совокупный среднегодовой темп роста (CAGR) объемов производства биоэтанола с 2003 по 2007 годы составил 124,2%. Доля Китая в мировом объеме производства биоэтанола в 2007 году составила 3,7%. К этому времени в Китае насчитывалось шесть производителей биоэтанола. Из них компания Jilin Fuel Ethanol Со. является крупнейшим производителем биоэтанола. Биоэтанол производят из пшеницы, риса, маниоки и сахарного сорго. Кроме того, Китай планирует поднять долю возобновляемой энергии в общем потреблении энергии до 10% к 2010 году и 15% к 2020 году, по сравнению с 8% в настоящее время. В 2006 году производство биотоплива в мире составило 40 млн. т энергетического эквивалента нефти, в 2030 году составит 150 млн. т., а ежегодный темп прироста - 7-9% (по данным Международной энергетической ассоциации). Согласно энергетической концепции Евросоюза, до 2020 года планируется довести потребление биодизеля до 20% от общего объема моторного топлива. В России «Корпорация Биотехнологии», контрольный пакет акций которой принадлежит государственной корпорации «Ростехнологии», планирует к 2017 году открыть 30 заводов по производству биотоплива. Перспективным сырьем для получения биоэтанола являются отходы деревообрабатывающей промышленности - стружки, опилки (табл. 2). До начала 1990-х годов на территории России существовало около 40 гидролизных заводов, перерабатывающих древесную целлюлозу в спирт. Сейчас из них работает лишь несколько. Поэтому восстановление и переоборудование их в современные заводы позволит снизить капитальные затраты на развитие биоэтанольных мощностей. Возможно использование других видов сырья для выработки биоэтанола, например, свекловичный жом (отход свеклосахарного производства). В нашей стране его производится ежегодно около 1 млн. т. Также можно целенаправленно культивировать так называемые «энергокультуры», например сладкое сорго, мискантус (50 т с гектара). Основным недостатком SSF-процессов является то, что они, как правило, проводятся при температурах, являющихся компромиссом между оптимальной температурой сбраживания (20-40С в зависимости от используемого микроорганизма) и гидролиза (45-50С для ферментов Trichoderma и большинства других грибных целлюлаз). Кроме того, ферменты и дрожжи (либо другие сбраживающие микроорганизмы) могут функционировать не при оптимальном значении рН. В итоге ни гидролиз, ни сбраживание не осуществляются в оптимальных условиях, что приводит к длительным временам процесса.
Технологии получения биоэтанола широко внедряются в производство. Например, в Национальной Лаборатории Возобновляемой Энергии (National Renewable Energy Laboratory, NREL) при поддержке Департамента Энергии (DOE) в г. Голден, штат Колорадо, построен пилотный завод по переработке целлюлозной биомассы в этанол. Он способен переработать 900 кг сухих целлюлозосодержащих отходов в день. В целом, в США существует более 80 заводов, производящих 10 мли. т биоэтанола в год, а к 2010 году планируется увеличить производство биотоплива до 19 млн. т [153]. Основное ограничение по расширению производства этанола из лигноцеллюлозных материалов - это высокая стоимость используемых ферментов. На сегодняшний день компании Novozymes и Genencor/Danisco - ведущие мировые производители целлюлазных препаратов при поддержке NREL (www.nrel.gov) сообщают о том, им удалось снизить в 30 раз стоимость ферментов, благодаря 6-кратному увеличению активности и 5-кратному сокращению издержек производства. Согласно этой информации этанол из лигноцеллюлозных материалов стал бы конкурентноспособным по сравнению с этанолом из крахмала и сахарозы. P. verruculosum B221-151 - мощный продуцент целлюлаз и ксиланаз, по гидролитической способности не уступающий лучшим мутантным штаммы Т. reesei [4]. Однако его предшественник - дикий штамм WA 30 - практически не продуцировал целлобиазы, и в этом отношении не отличался от Т. reesei [157]. Штамм В221-151 был получен из дикого WA 30 методом мутагенеза, используя обработку нитрозогуанидином (NTG) и ульрафиолетовое облучение (УФ), с последующей селекцией по схеме: Образование целлюлаз в полученных штаммах индуцибельно и подвержено катаболитной репрессии. Однако особенность полученных мутантов P. verruciilosum заключается в редуцированной репрессии катаболизма. Целенаправленные изменения рН в процессе ферментации позволяют влиять на состав целлюлазного комплекса. Некоторые побочные активности, например ксиланазная, амилазная и целлобиазная, становятся выше при более высоких значениях рН [158]. Следует отметить, что получение перспективных штаммов с устойчивой способностью к сверхсинтезу необходимых ферментов является весьма непростой задачей, так как многие мутантные штаммы со временем теряют свои способности к сверхсинтезу тех или иных ферментов, поэтому для поддержания штаммов в активном состоянии требуется поддерживающая селекция. Например, в результате ненаправленного мутагенеза дикого штамма Т. viride QM (в последствии переименнованного в Т. reesei) был получен устойчивый сверхпродуцент целлюлаз - штамм RUT С-30.
ЦБГІ 7-й семьи гликозид-гидролаз
Нужно отметить, что пептид из ЦСМ имел слишком высокую молекулярную массу (4911,1), чтобы быть зарегистрированным, поэтому соответствующий пик не присутствовал на масс-спектре. Кроме того, в этот пептид входил небольшой участок линкера, богатого аргинином и треонином, который мог быть гликозилирован. Можно предположить, что белок с более высокой молекулярной массой (б б кДа) представляет собой полноразмерную форму фермента, в то время как белок с низкой молекулярной массой (55 кДа) является его фрагментом, полностью содержащим каталитический домен, но не имеющим ЦСМ и значительной части линкера. Вероятно, ЦБГ I 55 кДа образуется в результате ограниченного протеолиза полноразмерной ЦБГ І в процессе ферментации или хранения культуралыюй жидкости. Следует отметить, как показал анализ с помощью программы FindMod, в ЦБГ I N-концевой остаток глутамина существовал в модифицированном виде, т. е. в форме пироглутамовой кислоты. Это объясняет, почему попытка секвенирования ЦБГ I с N-конца по Эдману, предпринятая в нашей лаборатории ранее, не удалась. С помощю программы ProtParam были вычислены теоретические коэффициенты экстинкции (є28о) ЦБГ I 66 и 55 кДа, они составили 86635 и 74925 М -см"1 соответственно. При таких значениях коэффициентов экстинкции раствор белка с концентрацией 1 мг/мл дает значение оптических плотностей на длине волны 280 нм 1,66 и 1,62 соответственно. Сравнение аминокислотных последовательностей и гомология с известными целлюлазами. Поиск белков, гомологичных ЦБГ I P. verruculoswn, с помощью программы BLAST2 (http://cn.expasy.org/tools/) показал, что ее аминокислотная последовательность проявляет сходство с первичными структурами известных целлобиогидролаз из 7-й семьи гликозид-гидролаз (http://www.cazy.org/fam/gh7.htmn.
Наибольшая степень идентичности (83%) имела место в случае ЦБГ I (Се17А) из P. funiculosum (UniProtbCB код Q8WZJ4). Высокая степень гомологии (67%) была также найдена с ЦБГ I (Се17А) Talaromyces emersonii (UniProtbCB код Q8TFL9) (для этого фермента известна его трехмерная кристаллическая структура). Несколько ниже была гомология с другими целлобиогидролазами 7-й семьи гликозид-гидролаз, в частности -62% в случае ЦБГ I (Се17А) A. fumigatus (UniProtKB код Q75A23) и 57% в случае ЦБГ I (Се17А) Т. reesei (UniProtKB код Р62694), для которой также известна трехмерная кристаллическая структура [83]. Сравнение (выравнивание) аминокислотных последовательностей ЦБГ I P. verruculosum, P. funiculosum, A. fumigatus, Т. reesei приведено на рис. 23. В выравнивании принимала участие ЦБГ 1а С. lucknowense. Путем сравнения аминокислотных последовательностей изучаемых белков с ферментами, для которых известны их кристаллические структуры, можно выявить основные структурные домены (модули) в молекулах ферментов P. verruculoswn. Найденные таким образом структурные домены ЦБГ I указаны в таблице 10. В дальнейшем тексте этого раздела, таблицах и рисунке нумерация аминокислотных остатков соответствует первичной структуре белка без сигнального пептида. Поскольку даже в случае такого хорошо изученного фермента, как ЦБГ I Т. reesei, в литературе существуют разногласия насчет аминокислотных остатков, соответствующих концу каталитического домена и началу линкера, некоторая неоднозначность также присутствует и в области соединения этих структурных частей в молекуле ЦБГ I P. verruculoswn. ЦСМ ЦБГ I P. verruculoswn проявлял высокую степень гомологии с соответствующими модулями молекул известных грибных целлюлаз, при этом наиболее высокая степень подобия снова имела место в случае ЦБГ I P. funiculosum (92%). ЦСМ ЦБГ IP. verruculoswn состоит из 36 аминокислотных остатков, включая 4 консервативных остатка цистеина, которые образуют две S-S связи. В случае пептидного линкера ЦБГ I заметной гомологии с соответствующими участками молекул других известных целлюлаз обнаружено не было. Линкеры содержат много остатков Ser, Thr, Pro и Gly, однако эти остатки расположены неупорядоченно. Остатки Ser и Thr в линкерах сильно гликозилированы (О-гликозилирование) [177]. Ни одного возможного сайта JV-гликозилирования в молекуле ЦБГ I P. verruculoswn не обнаружено. Один возможный сайт iV-гликозилирования (Asn-271) был обнаружен в молекуле ЦБГ 1а С. lucknowense с помощью программы MotifScan. В молекуле ЦБГ I Т. reesei соответствующий остаток (Asn-270) модифицирован высокоманнозным олигосахаридом [178]. В ЦБГ I Т. reesei имеются два дополнительных сайта iV-гликозилирования (Asn-45 и Asn-384), к каждому из которых присоединен единичный остаток GlcNAc или высокоманнозный олигосахарид [178]. В молекуле ЦБГ I P. vemiculoswn в позициях, соответствующих Asn-45, Asn-270 и Asn-384 ЦБГ I Т. reesei, находятся остатки Asn-45, Val-292 и Asn-388. Следует обратить внимание, что полноразмерная (высокомолекулярная) форма ЦБГ I P. vemiculoswn состоит из 500 аминокислотных остатков, и ее теоретическая молекулярная масса (без сигнального пептида) составляет 52185 Да. В то время как масса белка, определенная по данным Ds-Na-ПААГ-электрофореза, составляла 66 кДа.
Наблюдаемые разногласия можно объяснить гликозилированием фермента (главным образом, О-гликозилированием пептидного линкера). Трехмерные модели ЦБГ I P. verruciiloswn. Используя программу SWISS-MODEL Швейцарского института биоинформатики (http://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.html), было осуществлено моделирование трехмерной структуры каталитических доменов ЦБГ I P. verruciiloswn. Кристаллическая структура каталитического домена ЦБГ I (Се17А) Т. reesei (PDB структуры с кодами: 1CEL, 3CEL, 5CEL, 1DY4) была использована в качестве шаблонов для сравнительного моделирования. Структура, полученная в результате моделирования, представлена на рнс. 24, а. Как и следовало ожидать, каталитический домен ЦБГ представляет собой Р-сэндвич, т. е. структуру, типичную для целлюлаз из 7-й семьи гликозид-гидролаз. Петли, образованные остатками Туг 193-Asp201, Gly266-Gly275, Asp397-Leu406 (в молекуле ЦБГ I P. verruciiloswn) расположены так, что, покрывая «ущелье» активного центра, они образуют «туннель» - характерную особенность активного центра целлобиогидролаз (рис. 24, б). Стоит отметить, что в каталитическом домене ЦБГ I Т. reesei находятся 20 остатков цистеина, которые образуют между собой 10 дисульфидньгх мостиков (рис. 23). Однако в молекуле ЦБГ I P. verruciiloswn имеется на два остатка цистеина меньше (соответствующие остатки в позициях 4 и 72 замещены на Gly и Ala) и, как следствие, девять S-S связей вместо десяти. Подобная ситуация наблюдается и в случае ЦБГ I P. funiculosum и A. fumigatus (рис. 23). Поскольку из литературных данных [83] известны ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активном центре целлобиогидролаз 7-й семьи, оказалось возможным определить соответствующие остатки в молекуле ЦБГ I P. vemiculoswn, анализируя при этом выровненные аминокислотные последовательности белков и полученные трехмерные модели ферментов. Соответствующие остатки подчеркнуты на рис. 23. Наиболее важные аминокислоты абсолютно консервативны, включая каталитическое трио Glu-Asp-Glu, и четыре триптофана, осуществляющих «стэкинг» взаимодействие с гликозидными остатками Следует отметить, что некоторые неконсервативные аминокислотные остатки также могут участвовать в связывании субстрата. В особенности, следует отметить два ароматических остатка (Туг-370 и Туг-371) в Се17А Т. reesei, которые заменены на менее объемные His и Ala в молекуле Се17А из С. hicknowense и His и Ser в молекуле Се17А из A.fumigatus, а в молекуле Се17А из P. verruculosum заменен только второй из остатков на Ala.
Температурный и рН-оптимум действия ферментов
Эндоглюканазы обеспечивали меньшую глубину гидролиза МКЦ, причем наибольший выход глюкозы наблюдали в случае ЭГ I 70 кДа - 1,1 г/л (или 20% глубины гидролиза). Как и следовало ожидать, остальные эндоглюканазы, не содержащие ЦСМ, менее эффективно разрушали целлюлозу: для них степень конверсии составляла 9-16%. Отметим, что при гидролизе МКЦ БГЛ 166 кДа через 4 суток содержание глюкозы в реакционной смеси составило 0,15 г/л, или 2,7% от максимально возможного. Следовательно, ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа наряду с ЭГ I 70 кДа представляют «ключевые» ферменты для осахаривания кристаллических форм целлюлозы. Суммируя полученные результаты проведенных исследований, можно заключить, что в составе комплекса внеклеточных ферментов P. verruculosam выявлены два новых фермента - ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа, характеризующиеся высокой стабильностью и активностью в широком интервале значений рН и температуры и способные в индивидуальном виде осуществлять глубокую конверсию кристаллической целлюлозы. В настоящее время человечество столкнулось с проблемой потенциального исчерпывания традиционного углеводородного сырья, из которого производят моторное топливо и продукты химического синтеза. Кроме того, с каждым годом увеличивается объем антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу, что приводит к изменению климата на Земле. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии, в том числе к возобновляемому растительному сырью. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо -этанол или бутан ол [152]. Согласно энергетической концепции Евросоюза, до 2020 года планируется довести потребление биодизеля до 20% от общего объема моторного топлива. В России «Корпорация Биотехнологии», контрольный пакет акций которой принадлежит государственной корпорации «Ростехнологии», планирует к 2017 году открыть 30 заводов по производству биотоплива. Для реализации этих проектов необходимо преодолеть проблемы, связанные с высокими затратами на предобработку сырья для увеличения его реакционной способности, и высокой стоимостью целлюлолитических ферментов [153]. Поэтому компании, производящие ферменты, стараются не только снизить затраты на производство уже известных целлюлолитических ферментов (например Т. reesei), но и ведут активный поиск новых более эффективных продуцентов целлюлаз.
Данная глава посвящена сравнению осахаривающей способности целлюлазных комплексов, продуцируемых различными штаммами Trichoderma sp. и P. verruculoswn, а также выявлению факторов, оказывающих влияние на эффективность ферментативного гидролиза. В табл. 16 приведены активности использованных ферментных препаратов. 7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз. Гидролиз МКЦ. На рис. 41 представлены результаты ферментативного гидролиза МКЦ (50 г/л) под действием ферментных препаратов P. verruculoswn (В221-151, F10), Т. reesei (TW-307, BioACE, Spezyme СР). Содержание белка целлюлазных препаратов в реакционной среде составляло 5 мг/г субстрата. Существенное влияние на эффективность ферментативного осахаривания целлюлозы оказывает Р-глюкозидаза, увеличивая концентрацию глюкозы в реакционной среде и уменьшая концентрацию целлобиозы. Т. reesei TW-307, имевшего очень низкую собственную р-глюкозидазную активность. Препарат P. verruculosum F10 приводил к образованию 1,9 г/л глюкозы после 72 ч гидролиза МКЦ. В присутствии дополнительного количества р-глюкозидазы (Novozym 188 или P. verruculosum F10) происходило увеличение содержания глюкозы и ВС в реакционной среде в 1,7-3 раза. При этом наиболее эффективно гидролизовали МКЦ смеси лабораторных целлюлозных препаратов P. verruculosum В221-151 или Т. reesei TW-307 с р-глюкозидазным препаратом P. verruculosum F10. Вклад р-глюкозидазы наиболее заметен в случае препарата Т. reesei TW-307, для которого скорость гидролиза на начальном этапе (3 ч) возросла в 5 раз, для остальных препаратов - в 2,1-2,5 раза. Смеси коммерческих препаратов целлюлаз в присутствии р-глюкозидазы образовывали на 2-4 г/л глюкозы меньше, чем смеси соответствующих лабораторных препаратов. Необходимо отметить, что выход Сахаров через 48 и 72 ч гидролиза различались незначительно, а существенная часть целлюлозы разрушалась уже за 24 ч. Ниже будет показано, что аналогичная картина наблюдалась и для других субстратов. В наших экспериментах препараты, полученные на основе С. lucknowense, не принимали участия в связи с их низкой осахаривающей способностью [112]. Гидролиз прсдобработанных стеблей кукурузы (ПСК) и делигнифпцированных стеблей кукурузы (ДСК). В сельскохозяйственных районах, где производится кукуруза, отходами являются кукурузные стебли и початки, запасы которых измеряются сотнями тысяч тонн в год.
Реакционная способность такого природного целлюлозосодержащего сырья, как правило, невелика и для ее увеличения необходима предобработка. Нами были использованы стебли кукурузы, предобработанные паровым взрывом (ПСК, #62), а также подвергнутые после парового взрыва дополнительной делигнификации с помощью щелочной обработки (ДСК, #74) (предобработанные субстраты предоставлены компанией Dyadic Int./Abengoa) (табл. 4). Нами было проведено сравнение эффективности действия четырех целлюлазных препаратов при гидролизе ПСК (рис. 42) и ДСК (рис. 43), а именно промышленных препаратов BioACE и Spezyme СР и лабораторных - P. verruculosum В221-151 и Т. reesei TW-307 (без добавления препаратов Р-глюкозидазы). Через 72 ч ферментативного гидролиза как ПСК, так и ДСК наибольший выход ВС и глюкозы наблюдали в случае препарата P. verruculosum В221-151. Из препаратов на основе Т. reesei лучшей осахаривающей способностью характеризовался Spezyme СР. Реакционная способность ДСК (по конечному выходу ВС) при гидролизе всеми ферментными препаратами была несколько выше, чем у ПСК, поскольку содержание лигнина в ПСК составляло 30,2%, в ДСК - 15,8%. На рис. 45 приведены результаты осахаривания пергамента и сосновых опилок четырех видов (100 г/л) препаратами Целловиридин Г20х и P. vemiculoswn В221-151, взятых в количестве 2, 5 и 10 мг белка на 1 г сухой массы субстрата. Эти препараты использовались в присутствии дополнительного количества Р-глюкозидазы P. verruculosum F10 (0,6,1,5 и 3 мг белка на 1 г субстрата соответственно). По осахаривающей способности лабораторный препарат P. verruculosum В221-151 в присутствии Р-глюкозидазы P. verruculosum F10 был эквивалентен промышленному препарату Целловиридину Г20х. Пергамент обладал наибольшей реакционной способностью, и через 48 ч выход глюкозы и ВС составил 51 и 52 г/л, соответственно, максимальная степень его конверсии составила 48%. Степень конверсии целлюлозы СО I вида, не прошедших дополнительного измельчения, была весьма низкой (не более 12%). С усилением интенсивности обработки СО (II-IV виды) происходило увеличение реакционной способности. Выход глюкозы за 6 ч гидролиза увеличился в 1,2-4,2 раза по сравнению с СО I вида, при этом через 24 ч и 48 ч соотношение сохранилось. Так, степень конверсии целлюлозы СО IV вида после 48 ч составила 21, 29 и 34% при содержании белка целлюлазных препаратов 2, 5 и 10 мг/г субстрата соответственно.
